Alternatif Viskoz-Atalet Kuvveti Jetting ile In Vitro Hydrogel Mikrokaçörlerinin 3D Baskısı

İyi bir kontrol edilebilirlik ve biyouyumluluk ile mikrokaçör hazırlamak için hafif bir biyobaskı süreci sunuyoruz. Hücreler tarafından kapsüllenmeden sonra, taşıyıcılar in vitro hücre genişlemesi ve fonksiyonel mikrotissue yapımında da kullanılabilir. Benzer koşullar altında şiddetli kuvvetler yerine sınırlı yer değiştirme, baskı işlemi sırasında nozül üzerinde hareket eder ve biyo mürekkecin orijinal fiziksel/kimyasal özelliklerini maksimum ölçüde korur.

Konvansiyonel mikrokaçörlere ek olarak, iç hücre dağılımına veya tritosin kapsüllü kapsül yapılara sahip üniteler inşa edilebilir ve farklı doku yapılarının montajına uygulanabilir. Nozül hazırlığı için, cam mikropipettesleri üreticinin talimatlarına göre çekme üzerine yükleyin ve çekme parametrelerini ayarlayın. Deney için belirli uç çapını elde etmek için belirlenen çaptaki nozüle kesmek için bir mikroforge kullanın ve nozüle alkolde beş dakika sterilize edin.

Daha sonra, artık alkolü çıkarmak için nozülü steril suyla üç kez durulayın. Hidrojel biyo mürekkede hazırlamak için, sterilize edilmiş %4 sodyum aljinat stok çözeltisini 0,5, 1, 1,5 ve %2 ağırlıkta hacimsel konsantrasyonlarda %0,9 sodyum klorürde seyreltin. Mikro damlacık oluşumu için, beş mililitre biyo-mürekkep tek kullanımlık steril bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı bir şırınga pompasına takın.

Bir milimetrelik iç çaplı bir hortum kullanarak şırınnayı bağlayın ve nozül yazdırın. Nozülü yerine sabitlemek için sıkma vidasını sıkın ve biyo-mürekkep nozüle yüklemek için şırınna pompasını hızla bastırın. Sinyal üreteci parametrelerini ayarlayın ve titreşimin hareket yolunu ve tetik modunu isteğe bağlı olarak düşecek şekilde önceden ayarlayın.

Ardından, önceden tasarlanmış desenleri izleyerek damlacıkları yazdırın. Mikrokaçör oluşumu için, bir Petri kabına beş mililitre çapraz bağlama çözeltisi ekleyin ve kabı alt tabaka olarak baskı nozülüne yerleştirin. Yazdırduktan sonra, mikrokaç süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarmadan önce mikro taşıyıcıları üç dakika çapraz bağlayın.

Daha sonra, mikrokaçları santrifüjleme ile zenginleştirin ve mililitre başına yaklaşık 600 mikrokaçörde uygun bir kültür ortamında yeniden depolayın. Aşılarından önce, bir A549 hücre kültürünün üst kısmını, hücre kültürü inkübatöründe 30 dakikalık bir inkübasyon için 10 mikromoler hücre izleyici yeşil CMFDA boyası ile desteklenmiş beş mililitre serumsuz ortamla değiştirin. Kuluçkanın sonunda, boya çözeltisini taze ortamla değiştirin ve hücreleri mililitre başına mililitre başına altı hücreye 1,6 çarpı 10 yoğunlukta yeniden kullanın.

Hücrelere bir mililitre mikrokaç süspansiyonu ve düşük yapışan altı kuyulu bir kültür plakasının her kuyusuna bir mililitre A549 hücresi ekleyin. Plakayı hücre kültürü inkübatöründeki bir çalkalayıcıya dakikada 30 devirde yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, plakayı çalkalayıcıdan çıkarın ve baskı nozülünü, Petri tabaklarını ve mikrokaç aşılanmış hücreleri parlak alan ve konfokal floresan mikroskopi ile gözlemlemeden ve ölçmeden önce mikrokaçların 30 dakika yerleşmesine izin verin.

30 mikrometre uçlu bir nozül kullanılarak, PBS, %1,5 aljinat ve %1,5 jelatin dahil olmak üzere birden fazla biyo-mürekkep türü Petri tabaklarına sabit bir şekilde basılabilir. Mürekkeplerin viskozitesi arttıkça, baskı işlemi giderek zorlaşır ve daha büyük damlacıklar elde etmek için daha fazla itici kuvvete ihtiyaç duyulmaktadır. Yazdırma parametreleri, bu yazdırma deneyinde de gözlemlendiği gibi damlacıkları belirli 2D düzenlerde yazdırmak için ayarlanabilir.

Nozül ucunun çapı, basılabilen mikrokaç boyutunun doğrudan etkisine sahiptir. Bu parlak alan ve konfokal görüntülerde gözlemlendiği gibi, A549 hücreleri iki günlük kültürden sonra aljinat-kollajen mikrokaçörlerine yapışır. Altı gün sonra, A549 hücreleri mikrokaç yüzeyleri neredeyse tamamen kaplar.

Bu işlemi takiben mikrokaç yüzeyini chitosan ile kapladık ve alveoller gibi içi boş yapılar inşa etmek için uygulanabilecek kistik bir yapı oluşturmak için aljinat jelini eritmek için glukoğat kullandık. Mikrokaçörleri hazırlamak için baskı işlemi oldukça naziktir, bu nedenle bu yöntem hücre içeren mikrokaçörleri yazdırmak için yaygın olarak kullanılabilir.