Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Scipion, biyolojik numunenin yüksek çözünürlüklü bir yeniden yapılandırılmasını sağlamak için kriyo-EM'deki tek bir parçacık analizi için tüm işleme iş akışını bütünleştirici bir şekilde oluşturmak için araçlar sağlar. Bu çerçeve, daha doğru bir çıktı oluşturmak için birlikte çalışabilirlik, izlenebilirlik, tekrarlanabilirlik ve farklı yöntemlerle iletilen bilgilerin birleşimini destekleyen birkaç görüntü işleme paketi kullanarak işleme iş akışını oluşturmayı mümkün kılar. Scipion, yeni yöntemler ve paketler de dahil olmak üzere sürekli büyüyor.

Ayrıca, kriyo-elektron tomografisi ve atom modellemesine genişletilerek bu verileri işlemek için iş akışları oluşturulmasına da olanak sağlanmıştır. Scipion'da bir proje oluşturmak için Proje Oluştur'u tıklatarak projeyi oluşturun. Mikroskop filmlerini içe aktarmak için Filmleri içe aktar'ı seçin.

Yeni bir pencere görünecektir. Bu pencerede, verilerin yolunu girin ve Mikroskop voltajını 300 kilovolt, Küresel sapmayı iki milimetreye, Genlik kontrastını 0,1'e, Büyütme oranını 50,000'e, Örnekleme hızı modunu Görüntüden'e ve Piksel boyutunu 1,34 angstroms'a ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında Yürüt'ü tıklatın.

Yöntem tamamlandığında, Özet sekmesini açın sonuçları çözümle'yi tıklatın. Yöntem tarafından oluşturulan çıktıların listesini içeren yeni bir pencere görüntülenir. Film hizalaması için optik akış yöntemini çalıştırmak için xmipp3 optik hizalama yöntemini açın ve giriş filmleri olarak içe aktarılan filmleri seçin ve Kareleri 2 ile 13 arasında HIZALAMA aralığına ayarlayın.

Ek Parametreler altında, Önceki film hizalamasını SUM karelerine kullan seçeneğini No.Leave diğer seçeneklerin tümünü varsayılan değerlerine bırak olarak ayarlayın ve programı yürütün. Elde edilen mikro grafikleri ve tahmini kaymaların yörüngesini kontrol etmek için Sonuçları Analiz Et'i tıklatın. Her mikrograf için, güç spektral yoğunluğunu, filmi hem Kartezyen hem de kutupsal koordinatlarda hizalamak için elde edilen yörüngeleri ve elde edilen mikro grafiğin dosya adını kontrol etmek mümkündür.

Numunenin parçacıklarının mikrografide filmin tek bir karesine kıyasla çok daha görünür olduğuna dikkat edin. Parçacık toplama için xmipp3 manuel malzeme çekme yöntemini açın ve giriş mikrografları olarak önceden elde edilen mikrografları seçin. Yürüt'ü tıklatın.

Yeni bir etkileşimli pencere görünecektir. Bu pencerede piksel boyutunu 150 olarak değiştirin. Seçilen mikrograf daha büyük bir pencerede görünecektir.

Bir bölgedeki tüm görünür parçacıkları seçin. Tüm parçacıklar manuel olarak seçildiğinde, öğrenmeye başlamak için Eğitimi Etkinleştir'i tıklatın. Mikro grafiğin kalan bölgeleri otomatik olarak seçilecektir.

Toplanan parçacıkları kontrol et. Ek bir parçacık eklemek için bir ilgi parçacığına tıklayın. Yanlış parçacıkları gidermek için Shift tuşunu basılı tutun ve gerektiğinde parçacıkları tıklatın.

Tüm parçacıklar otomatik olarak seçildiğinde, temsili bir eğitim kümesi oluşturmak için sonraki dört mikrografı teker teker seçin. Seçilen her mikrograftaki parçacıklar otomatik olarak toplanacak ve gerektiğinde parçacıkları içerecek veya kaldıracak şekilde her mikrografi kontrol edilecektir. Bir eğitim kümesi alındığında, toplanan tüm parçacıkların koordinatlarını kaydetmek için Koordinatlar'ı tıklatın.

Eğitim setini aldıktan sonra, Xmipp parçacık toplama çalıştırmasında önceki manuel toplamayı belirtmek için xmipp3 otomatik toplamayı açın ve Mikrografileri denetlenenle aynı olarak seçecek şekilde ayarlayın. Yaklaşık 100.000 koordinat kümesi oluşturmak için Yürüt'ü tıklatın. Konsensüs yaklaşımı uygulamak için, sfenk cryolo toplamayı açın ve önceden işlenmiş mikrografları malzeme çekme modelinde giriş mikrografileri olarak varsayılan olarak ayarlayın.

Güven eşiğini 0,3'e ve Kutu Boyutu'nu 150 olarak ayarlayın, sonra Yürüt'ü tıklatın. Yöntem ayrıca yaklaşık 100.000 koordinat oluşturmalıdır. Ardından, xmipp3 derin konsensüs toplamayı açın ve giriş koordinatlarını sphire cryolo ve xmipp3 otomatik toplama çıktısını, önceden eğitilecek model türünü ve önceden eğitilmiş modelle doğrudan Eğitim ve puanı Atla'yı Evet'e içerecek şekilde ayarlayın, ardından Yürüt'ü tıklatın.

Yürütmenin sonunda Sonuçları Çözümle'yi tıklatın. Yeni pencerede göz simgesini tıklatın. Tüm parçacıkların bir listesiyle ikinci bir yeni pencere açılacaktır.

Sütundaki Z-puan değerleri, düşük bir değer düşük bir kalitenin göstergesi olduğundan, her parçacığın kalitesi hakkında fikir verecektir. Parçacıkları en yüksekten en düşük Z puanına sıralamak için Xmipp Z-score derin öğrenme'yi tıklayın ve 0,75'ten daha yüksek Z puanına sahip parçacıkları seçin. Ardından, yaklaşık 50.000 koordinatlı yeni alt küme oluşturmak için Koordinatlar'ı tıklatın.

Çözünürlüğü yerel olarak hesaplamak için xmipp3 yerel MonoRes'i açın ve giriş hacmini son iyileştirme adımının çıktısına ayarlayın, Yarım birimleri Evet olarak ve Çözünürlük Aralığını 1 ile 10 angstrom arasında kullanmak ister misiniz? Parametreler ayarlandığında Yürüt'ü tıklatın. Çözünürlük hesaplandığında Sonuçları Çözümle'yi tıklatın ve Çözünürlük histogramını göster ve Renkli dilimleri göster'i seçin.

Birimin farklı bölümlerindeki çözünürlük gösterilecektir. Yapıların orta kısımlarının voksellerinin çoğu üç angstrom etrafında çözünürlükleri temsil etmeli, en kötü çözünürlükler ise yapıların dış bölgelerinde gözlemlenecektir. Voksel başına üç angstrom etrafında veya altında bir tepe ile çözünürlüklerin histogramı da gösterilecektir.

Keskinleştirme uygulamak için xmipp3 localdeblur keskinleştirmeyi açın ve son iyileştirme adımının çıktısını Giriş Haritası olarak seçin ve çözünürlük eşlemesini MonoRes eşlemesini elde etmek üzere ayarlayın. Komut çalıştırıldıktan sonra, Özet sekmesinde çıktı olarak oluşturulan birimler kümesini çift tıklatın. Her yinelemede oluşturulan birimler denetlenebilir.

Ayrıca, hacmin özelliklerini 3D olarak daha iyi gözlemlemek için hacmi UCSF Chimera gibi diğer araçlarla açmanız önerilir. Bu şekilde, Nyquist sınırına çok yakın olan üç angstromun Fourier kabuk korelasyonu gözlenebilir. Gösterildiği gibi, yeniden inşa edilen 3D hacim dilimleri yüksek düzeyde ayrıntı ve iyi tanımlanmış yapılar sergiler.

Yerel analizlerden sonra, merkezi voksellerin çoğu üç angstromun altında bir çözüm elde eder. Ancak, yerel çözünürlük dilimlerinin dış bölgeleri, bu alanlarda gözlenen bulanıklıkla tutarlı olan daha düşük bir çözünürlük gösterir. İşlem sonrası, 3D harita hacminin daha yüksek frekansları gözlemlenebilir, daha fazla ayrıntı ortaya çıkarılabilir ve gösterimin iyileştirilmesi.

Elde edilen çözünürlük yeterince yüksek olduğunda, yapının bazı biyokimyasal kısımları bile gözlemlenebilir. Elde edilen yapı düşük çözünürlüğe sahipse ve daha iyi bir çözünürlüğe dönüştürülemezse, yerel tahminin düşük Fourier kabuk korelasyonu, çözünürlük eğrisi ve histogramı ile bulanık bir hacim gözlenebilir. Toplamadan sonra, parçacık kalitesini değerlendirmek için 2D sınıflandırma kontrol edilebilir.

Örneğin, bu sınıflandırmada parçacıklar gürültülü, girilmemiş veya birleştirilmiştir, bu da malzeme çekmenin yanlış olduğunu gösterir. İlk birim tahmini sırasında başka bir denetim noktası gerçekleştirilebilir. Bu örnekte, yöntem için yanlış bir kurulum kullanılarak hatalı bir tahmin oluşturulmuştur.

Yeterli çözünürlüğe sahip bir 3B harita üretildikten sonra, bir sonraki adım harita için atomik bir model önermektir. Bu, modelleme eklentileri kullanılarak Scipion içinde yapılabilir. Bu teknik, biyolojik makromoleküllerin moleküler etkileşimlerinin ve biyolojik topluluk fonksiyonlarının ilaç tasarımının temeli olarak değerlendirilmesi için başarılı bir şekilde yeniden oluşturmak için kullanılabilir.