Minimum numune ancak maksimum otomasyon modunda NMR tabanlı parça taraması
4 Haziran 2021
NMR ile fragman tabanlı tarama, küçük molekül bağlayıcılarını biyomakromoleküllere (DNA, RNA veya proteinler) hızlı bir şekilde tanımlamak için sağlam bir yöntemdir. Otomasyon tabanlı numune hazırlama, NMR deneyleri ve elde etme koşulları ve analiz iş akışlarını açıklayan protokoller sunulmaktadır. Bu teknik, tespit için hem 1H hem de 19F NMR-aktif çekirdeklerin optimum şekilde kullanılmasına izin verir.
Nükleer manyetik rezonans çalışmaları yapıyoruz. Bu, çözeltideki proteinlerin, RNA'nın ve DNA'nın yapılarını belirlememizi sağlar. Bu biyomoleküller hücrelerimizin bileşenleridir, bileşenleridir ve burada sunduğumuz protokollerimiz küçük moleküllerin taranması ve bu hedeflere bağlanmaları ile ilgilidir.
Bu moleküllerden, tıbbi kimyamız ve yapısal biyolojimiz, hastalıklarla mücadele eden yeni ilaçlar türetebilir. Tekniğimizin temel avantajı, proteinler gibi moleküler hedeflerin kalitesi üzerinde tam kontrole sahip olmamız ve küçük molekül parçalarının ve ilaçların kalitesi üzerinde tam kontrole sahip olmamız ve ayrıca diğer metodolojilere kıyasla bir avantaj olan çok çeşitli afinitelerin bağlanması için proteinleri tarayabilmemizdir. NMR ölçümü için elek numuneleri hazırlamak üzere, karışım başına 4,2 milimolar nihai konsantrasyona kadar 12 parça içeren 64 karışım elde etmek üzere 768 bileşiği sekiz adet 96 delikli plakaya dağıtmak üzere bir numune hazırlama robotu kullanın.
Uygun bir tarama tamponunda seyreltilmiş ilgili biyomoleküler hedefi, uygun sayıda barkodlu üç milimetrelik NMR yüksek verimli numune değiştirici tüplerine aktarın ve robotu, her ligand karışımının 10 mikrolitresini hedef biyomolekülün her bir tüpüne aktarmak için kullanın. Ardından, robotun çözeltileri iyice karıştırmasını sağlayın. NMR alımı için, numuneyi spektrometreye yükleyin.
Spektrometre yazılımını açın, ardından ligand tabanlı deneyler için parametre kümesini ve darbe dizilerini seçin. Listelenen tüm deneyler için, su bastırma olarak uyarma heykelini seçin. Flor-19 taraması için hem 1B hem de T2 deneylerini seçin.
Spektral genişliği milyonda 220 parçaya, uyarma frekansını milyonda 140 parçaya ve analiz süresini bir ila beş saat arasında seçin. T2 için, CPMG süresi 5 ila 100 milisaniye arasında değişmelidir. T1r ve T2 deneylerini kaydedin.
Doygunluk transfer farkını sahte 2B olarak kaydedin. İki tek 1B spektrumu işlemek için, gevşeme seçeneği olsun veya olmasın, AU programı ProcStd işlevini kullanın. WaterLOGSY, çözücü sinyali için negatif ile fazlanması gereken tek bir 1D'dir.
Hidrojen tarama verilerini analiz etmek için, tarama kampanyalarından biyomoleküler manyetik rezonans NMR verilerini depolamak için parça tabanlı tarama aracının talimatlarını izleyin, böylece her tarama karışımının, bir alt dizinin numune üzerinde ölçülen farklı deneyleri içerdiği dizini vardır. Referans spektrumlarını, biyomoleküler hedef olmadan numunelerden kaydedilen tüm verilere sahip olarak, ancak karışımlar ve farklı dizinlerdeki tek bileşikle saklayın. Elde edilen verileri içeren dizine doğrudan bir yol oluşturun ve tüm karışımların ayrı bir dizine sahip olması gereken NMR dizinini seçin.
CSV, parça ekranı, XML belgesi ve BAC dosyalarının da verilerin NMR dizinine kopyalandığından emin olun. Filtrelenen bir örnek için parça tabanlı tarama aracını kullanmak üzere, parça tabanlı tarama projesi sembolünü analiz penceresinin ortasına sürükleyin. Simge, önceden kaydedilmiş veri kümeleri bu veri kümesine kopyalanmışsa görünmelidir.
Parça tabanlı tarama seçenekleri penceresi otomatik olarak açılmalıdır. Mikslerin adlarını, her parçanın adını ve her parçanın mikslere bölünmesini içeren bir CSV kokteyl dosyası seçin. Tek parçaların ölçülen tüm spektrumlarını içeren bir referans ligand spektrum klasörü tanımlayın ve genellikle araştırılan hedef olmadan karışımların veri kümelerini içeren bir referans boş deney klasörü tanımlayın.
İncelenen spektrumları ve spektrum görüntüleme renklerini tanımlamak için, Spektrum Türleri sekmesini açın ve spesifikasyon türünü proses verilerine göre ayarlayın. Görüntü Düzeni sekmesinde, teknik özellik türlerine göre karşılaştırılacak spektrumları tanımlayın. Ardından, projeyi başlatmak için Tamam'ı tıklatın.
Veriler işlenirken, tüm kokteyl karışımlarını ve her karışımın ligandlarını özetleyen tablonun bulunduğu ayrı bir pencere açılacaktır. İlgili veri kümelerini açmak için bir hücreye çift tıklayın. Bağlayıcıları atamadan önce, referans piklerinin birbiriyle eşleştiğinden ve aynı kimyasal kaymaya sahip olduğundan emin olun.
Farklılıklar gözlenirse, İşlem sekmesini açın ve bunları düzeltmek için seri işleme seçeneğini kullanın. Flor-19 karışımları üzerindeki ilk analiz için, Analiz sekmesini açın ve entegre işlevini seçin. Karışımdaki her parça için karşılık gelen flor-19 sinyali için net bir entegrasyon bölgesinin tanımlandığından emin olun.
Tümleştirme dosyasını ileride kullanmak üzere dışa aktarmak için dışarı aktarma tümleştirme bölgelerini kaydedin ve kullanılan tümleştirme dosyalarını uygun yükleme dizinine kaydedin. Flor-19 verileri için, araştırılan hedef olsun veya olmasın bir veri kümesi açın ve Analiz sekmesi altında, ilgili tümleştirme dosyasını geçerli spektruma yüklemek için İçe Aktarma Tümleştirme Bölgelerini Tümleştirme ve Okuma Tümleştirme Bölgeleri'ne tıklayın. Ardından, İntegraller sekmesinde tümleşik bölgelerin listesini bulmak için Kaydet ve geri dön'ü tıklatın ve bu bilgileri aşağı akış analizi için bir elektronik tabloya kopyalayın.
Fragman kütüphanesindeki ligandların moleküler yapısı veya yapısı, gösterildiği gibi moleküler güven yazılımı kullanılarak analiz edilir ve sonuçlar grafiksel bir çıktı olarak sunulur. Turuncu renk, parçanın yapı veya konsantrasyonda tutarsızlık sergilediğini gösterir. Yeşil renkli kuyular, parçanın tutarlı olduğunu gösterir.
Bu temsili analizde, kurum içi kütüphaneden bir veya birkaç flor grubu içeren 103 parça, karışım başına 20 ila 21 parçadan oluşan beş karışıma bölünmüştür. CPMG darbe trenleri uygulayan her karışım için Flor-19 enine gevşeme deneyleri ölçüldü. Eşikler, bu tipik tiamin proteini tirozin kinaz A ve RNA spektrumlarında gözlendiği gibi, karışımdaki bağlayıcı, zayıf bağlayıcı veya bağlayıcı olmayanları tanımlamak için yararlıdır.
Bu temsili analizde, isabetli bir vuruş yaklaşık% 50'lik bir T2 düşüşü ve altı hertz'den daha büyük veya ona eşit bir kimyasal kayma gösterdi. WaterLOGSY, pozitif olarak sayılacak sinyalde önemli bir değişiklik göstermedi. Bununla birlikte, üç deneyden ikisi pozitif olduğu için, bu parça bir hit olarak sayıldı.
İkinci vuruş için, T2 sinyal yoğunluğunda yaklaşık% 80'lik bir düşüş gösterdi. WaterLOGSY için de net bir sinyal değişikliği gözlendi. Kimyasal kayma bu deneyde yeterli değildi, ancak önceki iki kriter pozitif olduğu için hala bir isabet olarak sayıldı.
Bu tür yöntemlerin nihai amacı, örneğin enzimlerin yeni ilaçları veya yüksek afiniteli inhibitörleri geliştirmektir ve bu bağlamda, tıbbi kimya bu yeni molekülleri devralır ve sentezler, ancak yapı biyolojisi, burada uyguladığınız teknikler tıbbi kimyaya rehberlik edebilir ve bu yaklaşımı daha hızlı hale getirebilir.
Genel Bakış
Bu makale, biyomakromoliküllere bağlanan küçük molekülleri tanımlamak için nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanarak parça bazlı tarama için sağlam bir yöntem sunmaktadır. Protokoller, otomasyon tabanlı numune hazırlama, NMR deneyleri ve analiz iş akışlarını içerir ve hem 1H hem de 19F NMR-aktif çekirdeklerin kullanımını optimize eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Nükleer Manyetik Rezonans (NMR)
- Tıbbi Kimya
Arka Plan
- NMR çalışmaları, çözeltide proteinlerin, RNA'ların ve DNA'ların yapılarını belirlemeye yardımcı olur.
- Teknik, bu biyomoleküllere bağlanan küçük moleküllerin taranmasını sağlar.
- Moleküler hedeflerin ve küçük molekül parçalarının kalitesi üzerinde tam kontrol sağlanır.
- Bu yöntem, geniş bir bağlanma afiniteleri aralığı için tarama sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Biyomakromoliküllere bağlanan küçük moleküllerin taranması için bir protokol geliştirmek.
- NMR tabanlı parça taraması için kapsamlı bir iş akışı sağlamak.
- Hastalıklarla mücadele eden yeni ilaçların keşfini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bileşikleri plakalara dağıtmak için bir robot kullanarak otomasyon tabanlı numune hazırlama.
- Ligand tabanlı deneyler için özel parametrelerle NMR alımı.
- NMR spektrumlarının analizi için AU programını kullanarak veri işleme.
- Bağlanma değerlendirmesi için florin-19 sinyallerinin entegrasyonu ve analizi.
Ana Sonuçlar
- NMR taraması yoluyla küçük molekül bağlayıcıların başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Yöntemin birden fazla parçayı analiz etme verimliliğinin gösterilmesi.
- Sonuçlar, parçaların hedef biyomoleküller için farklı afinitelere sahip olduğunu göstermiştir.
- Grafik çıktılar, ligandların moleküler yapısı hakkında bilgiler sağlamıştır.
Sonuçlar
- Parça bazlı tarama yöntemi, ilaç keşfi için etkilidir.
- Numune kalitesi üzerinde kontrol, sonuçların güvenilirliğini artırır.
- Bu yaklaşım, terapötik geliştirme için çeşitli biyomakromoliküllere uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
NMR-based fragment screening with automation addresses a critical bottleneck in early drug discovery by enabling high-throughput, quantitative detection of small molecule binders to diverse biomacromolecular targets. This approach enhances predictive confidence in hit identification, reduces false positives and negatives, and supports robust portfolio triage at the target validation and lead identification stages. The integration of advanced hardware and software ensures scalable, reproducible workflows essential for enterprise R&D impact.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of target-ligand interactions across proteins and RNA with high sensitivity.
- Supports functional target validation by quantifying binding affinities over a broad dynamic range.
- Reduces mechanistic ambiguity through rigorous quality control of both targets and fragments.
- Facilitates predictive confidence and efficient triage of fragment hits for downstream medicinal chemistry.
Screening & Assay Development
- Automated sample preparation and high-throughput NMR acquisition standardize assay conditions and outputs.
- Delivers reproducible, quantitative readouts for reliable compound evaluation and hit prioritization.
- Enables scalable screening of large, diverse fragment libraries with minimal manual intervention.
- Provides validated data structures and reference spectra for platform reuse and cross-project comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns fragment screening outputs with structural biology and medicinal chemistry for seamless lead optimization.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by ensuring data integrity and traceability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, quantitative evidence of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This automated NMR-based screening method integrates at the interface of target validation, lead identification, and early preclinical research, providing a reusable capability for both protein and RNA targets.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by directly measuring fragment binding to biomacromolecules.
- Screening: Delivers standardized, high-throughput, and quantitative assay outputs for reliable hit identification.
- Analytics: Provides robust statistical outputs, including T2 relaxation changes and chemical shift thresholds, to compare binding conditions.
- Translational Research: Ensures continuity and data quality for downstream lead optimization and preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated workflow adaptable across multiple targets and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in fragment hit identification.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and advanced data analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by minimizing false positives and negatives.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of validated fragment hits across diverse target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy, fragment library management, and data analysis.
- Demands access to automated sample preparation robots and high-throughput NMR instrumentation.
- Necessitates standardized data structures and cross-team alignment for reproducible workflows.
- Adaptation across protein and RNA targets requires protocol optimization for buffer, pH, and ligand conditions.
- Throughput and scalability are contingent on hardware capacity and software integration.
