Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü
24 Temmuz 2021
Bu makale, infüzyon kanülü ile desteklenmiş özel yapım bir görüntüleme penceresinin hazırlanmasını ve farelerde hipokampüsün CA1 bölgesine implantasyonunu göstermektedir.
Çocuklar, benim adım Wang Yangdong ve Westlake Üniversitesi'ndeki Dr. Kiryl Piatkevich moleküler biyo-mühendislik laboratuvarından geliyorum. Bugün size hipokampüsün nöronal aktivitelerini farelerde, in vivo'da görüntüleme prosedürünü göstereceğim. Kaynak makinesini açın ve gerekli sıcaklığa kadar ısıtın.
Şekil olarak gösterildiği gibi yardım eden eller kullanarak görüntüleme kolayının ve enjeksiyon kolayının konumunu ayarlayın. Şırıngayı iğne ile kullanarak, görüntüleme ve enjekte kanülleri arasındaki bağlantı noktalarına beş saniye boyunca az miktarda uygun akı uygulayın ve ardından damlacığı çıkarın. Lehim tenekesini monte edin ve akı ile tedavi edilen bağlantı noktasına uygulayın.
Ameliyat sırasında yapılması gereksiz daha büyük kranial gerektireceğinden aşırı lehim tenekesi kaçının. Lehim tenekesi soğumasını bekleyin. Genellikle birkaç saniye sürer.
Her iki yönden de kukla canül takılarak enjeksiyon kolayın engellenmediğini onaylayın. Bir kürdan veya 26 kalibrelik şırınga iğnesi kullanarak görüntüleme kanüllerinin alt tarafına UV kürleme optik yapıştırıcı uygulayın. Görüntüleme canülüne karşılık gelen boyutta bir kapak camını dikkatlice yerleştirmek için ince bir cımbız kullanın.
Yapıştırıcıyı standart bir el UV lambasından UV aydınlatma ile en az bir saat boyunca iyileştirin. IACUC onaylı prosedüre göre fareyi izofluran ile uyuşturun. Fareyi bir ameliyat ısıtma yastığının üzerine stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin.
Başı kulak çubuklarıyla sabitleyin. Başın sıkıca sabit olduğundan emin olmak için başı her yöne hafifçe itin. Ameliyat sırasında hayvanın gözlerinin kurumasını önlemek için göz merhemi uygulayın.
Kürkü boynun arkasından gözlere kadar çıkarmak için bir düzeltici veya depilatör krem kullanın. Kesi yapmadan önce cerrahi bölgeyi betadin ve ardından %70 etanol ile üç kez sterilize edin. Kafa tabanının her yerinde yatay kesimden başlayarak kafatasının üstündeki deriyi çıkarın, ardından rostral yönde iki kesik, neredeyse göz kapaklarına ulaşır.
Sonra orta çizgide birleşen iki eğik kesik. İki steril pamuklu çubukla, bağlantı dokusunu ve boynun arkasının kafatasının kenarlarına kaslarını geri çek. Aşırı ağrıyı önlemek için periosteumun yüzeyine iki dakika boyunca bir damla lidokin çözeltisi uygulayın.
Kuru ve pürüzlü bir yüzey oluşturmak için kafatasının tüm açık alanını bir neşterle hafifçe kazıyın. Kafa konumunun dikey olduğunu onaylamak için AP koordinatının sıfır olup olmadığını ve ml koordinatının sıfır olup olmadığını görmek için iğnenin ucunu Lambda'ya yerleştirin. Değilse, AP ve ML koordinatları 0,1 milimetre içinde olana kadar stereotaksik istasyondaki muhabir düğmelerini ayarlayın.
Kraniyotomi için karşılık gelen noktaları bulmak için iğnenin ucunu hareket ettinin ve ince bir işaretleyici kullanarak kafatasındaki konumlarını işaretleyin. Dört işaretli noktaya ve dairenin cannula tarafındaki enjeksiyon cannula alanının ana hatlarına göre bir daire çizin. Kafatasında işaretlenmiş anahat boyunca hafifçe delmek için dakikada 10.000 mermi hızında bir pnömatik matkap kullanın.
Kafatasını, genellikle merkezde hafif bir dokunuşla hareket etmeye başlayan çok ince bir kemik tabakası kalana kadar delin. Kraniyotomi merkezine bir damla steril PBS uygulayın. Kemik kapağını kafatasından çok ince uçlu uzun uçlu uzun uçlu veya karşı taraflardan yaklaşan iki 26'lı iğne ile kaldırın.
Dura yüzeyini temizlemek için 26 kalibrelik künt bir iğneden pbs ve ardından hafif aspirasyonlar uygulayın. Korteksin yanı sıra hipokampüsün üzerindeki Corpus Callosum'u emmek için nazik emiş uygulayın. Korteks genellikle Corpus Callosum'dan daha sarıdır.
Ve Corpus Callosum genellikle hipokampustan daha geniştir. Ayrıca, Corpus Callosum'u yukarıdan gözlemlendiğinde dikey ve yatay yönlere giden nöronal liflerle ayırt etmek gerçekten kolaydır. Bu noktada kanama kraniyotomide beyin dokusunun görünürlüğünü etkileyecektir.
PBS uygulayın, ardından hafif emiş uygulayın, kandan kurtulmak için korteksi arzularken, Corpus Callosum şemada şematik olarak gösterildiği gibi beyaz liflerin yönü ile tanınabilir. Corpus Callosum liflerini dairesel bir hareketle hafif emiş uygulayarak katman katman çıkarın. PBS, maruz kalan beyin dokusunun üzerinde biriken kanlardan kurtulmak için sürekli olarak uygulanır.
İmplantı kraniyotomi içine hafifçe yerleştirin. İmplantın optik penceresini hipokampüsün maruz kalan yüzeyine mümkün olduğunca yakın konumlandırmak için L şeklindeki iğne ile implantın üzerine sıkıca bastırın. İmplant etrafındaki yara izine tekrar tekrar PBS uygulayın, ardından implant yerleştirilmesi sırasında kanı mümkün olduğunca çıkarmak için emme uygulayın.
Diş çimentosunun kafatasının altına nüfuz etmesini önlemek için implant ve kafatası arasına ince bir hızlı conta tabakası uygulayın. Hızlı conta iyileştikten sonra, kafatasının yüzeyine, hızlı contanın yüzeyine ve implantın yüzeyine eşit olarak süper bağ uygulayın. Süper bağ iyileştikten sonra, ameliyatın başında yapılan kesi etrafındaki cildin yanı sıra süper bağın üzerine protez bazlı reçine uygulayın.
Protez tabanı reçinesi iyileştikten sonra kafa plakasını implantın etrafındaki reçinenin üzerine yerleştirin ve görüntüleme kanı ile konsantre olmasını sağlamak. Konumunu sabitlemek için kafa plakasının etrafına ve üstüne daha fazla protez taban reçinesi uygulayın. Birkaç dakika tedaviye bırakın.
Görüntüleme penceresine daha iyi erişimin objektif mercek olmasını sağlamak için canül etrafında kalın bir çimento tabakası oluşturmaktan kaçının. Viskozitesini azaltmak için protez taban reçinesini seyreltin, böylece ulaşılması zor olan boşlukları bir aplikatörle doldurmasını sağlar. Pencereyi hayvan bantlamadan olası kirlenmeye karşı korumak için pencerenin üzerine yavaşça yalıtımlı bir kauçuk bant yerleştirin.
Virüs çözeltisine Hızlı Yeşil boya stok çözeltisi ekleyin, bir PCR tüpünde bir ila dokuz oranında istenen titreye seyreltin. Virüs çözeltisinin 600 nano litresini çekin, kukla kanülünü çıkarın ve iç kanülleri enjeksiyon şırıncığına kılavuz kanüle bağlayın. Virüsü dakikada 15 nano litre hızında, toplamda 10 dakika boyunca demleyin.
Virüsün pencerenin altına yayılması için iç canülleri 10 dakika bağlı tutun. İç canülleri kılavuz canülden hafifçe çıkarın ve kukla canül ile yeniden yakalayın. Fareyi birkaç dakika boyunca% 4 izofluran ile teşvik edin.
Kafa plakasını kafa çatalı üzerine sabitleyin ve sonra kafa çatalını koşu bandına sabitleyin. İşlevsel görüntüleme için görünümü filtrelemek için en iyisini bulmak için düşük büyütme nesnel lensi kullanın. Ardından, nöronal aktiviteleri tek hücre çözünürlüğünde kaydetmek için daha yüksek objektif bir lense geçin.
Kalsiyum görüntüleme için yeşil floresan, standart bir GFP filtre duyusu kullanılarak piyasada bulunan 470 nanometre LED ile heyecanlandı. Floresan izler elde etmek için, nöronal hücre kütlesine karşılık gelen ilgi alanları manuel olarak segmentlere ayrılmıştır ve ImageJ yazılımı tarafından analiz edilmiştir. 40 X lens optik voltaj kaydı kullanılarak gerilim görüntüleme için yakın kızılötesi kanalda 830 Hertz alım oranlarında gerçekleştirildi.
Spontan sinirsel aktivite kaydı 25.000 kareye kadar sürekli olarak sürdü. Burada, hipokampüsün farelerde A1 bölgesi olarak uzun süreli görüntülenmesi için bir yöntem tarif ediyoruz. Yöntem kronik implantasyona dayanmaktadır.
Şimdi, virüslerin veya ilaçların doğrudan ilgi çekici nöronlara hedefli bir şekilde yönetilmesini sağlayan özel yapım görüntüleme penceresi. Açıklanan protokolün, basit ve uygun fiyatlı 1 foton görüntüleme kurulumları kullanarak farelerin hipokampusunda yüksek mekansal zamansal çözünürlükle nöronal aktiviteyi araştırmayı amaçlayan çalışmaları kolaylaştıracağına inanıyoruz.
Genel Bakış
Bu makale, farelerde nöronal aktivitelerin in vivo görüntülemesinde kullanılmak üzere hipokampusun CA1 bölgesine infüzyon kanüllü özel yapım bir görüntüleme penceresinin hazırlanmasını ve implantasyonunu göstermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Nöromühendislik
- In vivo Görüntüleme
Arka Plan
- Hipokampusun CA1 bölgesi hafıza ve öğrenmede önemli bir rol oynar.
- Bu bölgedeki nöronal aktivite, çeşitli nörolojik durumların araştırılması için gereklidir.
- Mevcut yöntemler, nöronal devrelerin hassas görüntülemesine ve manipülasyonuna izin vermeyebilir.
- Özel bir görüntüleme sistemi, hipokampal fonksiyonların gerçek zamanlı çalışmalarını kolaylaştırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Fare beyninde bir görüntüleme kurulumunun oluşturulması için ayrıntılı bir cerrahi prosedürü göstermek.
- Nöronal aktivitelerin in vivo görüntüleme yöntemlerini geliştirmek.
- Araştırmacıların hipokampustaki nöronal dinamikleri daha etkili bir şekilde keşfetmelerini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışma, farelerde özel bir görüntüleme penceresi tasarımı ve cerrahi implantasyonu kullanır.
- Hipokampustaki nöronal aktiviteleri araştırmak için fare modelleri kullanıldı.
- Implantasyon prosedürü, anestezik uygulama, kraniostomi ve kanül ve pencerenin dikkatli bir şekilde yerleştirilmesini içerir.
- Hassas cerrahi adımlar, kesinliği sağlamak ve komplikasyonları önlemek için izlenir.
- Önemli metodolojiler, UV kürleme yapıştırıcıları ve doğru hedefleme için çoklu cerrahi aletlerin kullanımını içerir.
Ana Sonuçlar
- Makale, bir görüntüleme kurulumunun dikkatli implantasyonu için başarılı bir metodoloji tasvir etmektedir.
- Önemli adımlar, komplikasyonların nasıl önleneceğini ve kanülün optimal yerleştirilmesini nasıl sağlayacağını detaylandırır.
- Süreç, implantasyon sırasında beyin canlılığını korumak için önemli mekanik içgörüler gösterir.
- Bulgular, hipokampustaki nöronal dinamiklerin geliştirilmiş in vivo çalışmalarının potansiyelini vurgulamaktadır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, farelerde nöronal aktivitelerin görüntülemesinde tekrarlanabilir bir yöntemi göstermektedir.
- Prosedür, hipokampal fonksiyonların anlaşılmasında gelişmeler sağlar ve nörolojik araştırmalar için potansiyel etkilere sahiptir.
- Bu yaklaşımdan elde edilen bilgiler, öğrenme ve hafızanın temel mekanizmalarının çalışmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Chronic in vivo imaging of hippocampal neuronal activity in behaving mice addresses a critical gap in deep-brain circuit interrogation for CNS drug discovery. This method enables high-resolution, longitudinal monitoring of neuronal dynamics, supporting mechanistic de-risking and target validation in translational neuroscience pipelines. The integrated infusion cannula further allows for precise delivery of viral vectors or compounds, enhancing experimental flexibility and predictive confidence in early-stage neuropharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of neuronal circuit function in disease-relevant hippocampal regions.
- Supports mechanistic de-risking by linking molecular interventions to functional neural outcomes.
- Facilitates functional target validation through chronic, single-cell resolution imaging in behaving animals.
- Improves predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Provides a validated platform for quantitative, reproducible measurement of neuronal activity in vivo.
- Supports assay standardization for compound or genetic intervention studies in deep-brain regions.
- Enables scalable, longitudinal screening of neural responses to candidate therapeutics or gene delivery.
- Allows for reliable evaluation of intervention effects at both population and single-cell levels.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease-relevant hippocampal circuitry for translational biomarker development.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting repeated, longitudinal measurements.
- Reduces translational risk by providing high-content, functional readouts in behaving animals.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust neural activity data.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by enabling chronic, high-resolution imaging and targeted intervention in the hippocampus of behaving mice.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct neural activity measurement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for compound or genetic screening in deep-brain circuits.
- Analytics: Provides high-content calcium and voltage imaging data for comparative analysis across interventions.
- Translational Research: Aligns animal models with human CNS disease mechanisms for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse CNS research and intervention testing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes chronic imaging and intervention workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management in neuropharma pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs based on robust functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery and chronic cranial window implantation.
- Demands access to wide-field fluorescence microscopy and high-speed imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of surgical, imaging, and analytical protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or animal models.
- Potential limitations include surgical complexity, risk of tissue damage, and long-term window maintenance.
