Name: Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Öğrenin, davranan farelerin hipokampus CA1 bölgesindeki nöronal aktiviteleri kronik in vivo görüntülemek için kraniyotomi prosedürünü. Entegre infüzyon kanülü ile uzun süreli optik erişim ve viral vektör teslimi sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Westlake Üniversitesi Moleküler Biyomühendislik Grubu'nun tüm üyelerine tüm yardım ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Ayrıca Westlake Üniversitesi'nden Jinze Li ve Jie-Min Jia'ya cerrahi prosedürün filme alınmasına yardımcı olan için teşekkür ederiz.
Bu çalışma, Westlake Üniversitesi Vakfı, 2020 BBRF Genç Araştırmacı Hibesi ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın K.D.P.'ye 32050410298 hibe vermesiyle desteklendi.

<ol><li>Leutgeb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Codes+for+Spatial+and+Episodic+Memory+in+Hippocampal+Neuronal+Ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles.</a> Science. 309 (5734), 619-623 (2005).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Polanco, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+and+tau+complexity+-+towards+improved+biomarkers+and+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).</li>
<li>Henneman, W. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+atrophy+rates+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Added+value+over+whole+brain+volume+measures%22%5BJournal%5D)">Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease.</a> Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).</li>
<li>Camicioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+is+associated+with+hippocampal+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy.</a> Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).</li>
<li>Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Engineering+and+Application+of+Optogenetic+Indicators+for+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience.</a> Applied Sciences. 9 (3), 562(2019).</li>
<li>Piatkevich, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+neural+activity+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population imaging of neural activity in awake behaving mice.</a> Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).</li>
<li>Fan, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-Optical+Electrophysiology+Reveals+the+Role+of+Lateral+Inhibition+in+Sensory+Processing+in+Cortical+Layer+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1.</a> Cell. 180 (3), 521-535 (2020).</li>
<li>Shemesh, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+Calcium+Imaging+of+Dense+Neural+Populations+via+a+Cell-Body-Targeted+Calcium+Indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator.</a> Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).</li>
<li>Villa, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+Synapses+Are+Repeatedly+Assembled+and+Removed+at+Persistent+Sites+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo.</a> Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22Paxinos+and+Franklin%27s+The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , (2013).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).</li>
<li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Genetically+Encoded+Bright+Positive+Calcium+Indicator+NCaMP7+Based+on+the+mNeonGreen+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644(2020).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Kalmbach, A. S., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+surface+temperature+under+a+craniotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Brain surface temperature under a craniotomy.</a> Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).</li>
<li>Roche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+with+a+water+immersion+objective+affects+brain+temperature%2C+blood+flow+and+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation.</a> eLife. 8, 47324(2019).</li>
<li>Watakabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+8+and+9+in+marmoset%2C+mouse+and+macaque+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex.</a> Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).</li>
<li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCastle%2C+MJ+%22Gene+Therapy+for+Neurological+Disorders%3A+Methods+and+Protocols%22">Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols</a>. Manfredssonn, F. P. , Springer. New York. 133-149 (2016).</li>
<li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+hippocampal+activity%2C+plasticity%2C+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li>
<li>Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-endoscopic+system+for+functional+assessment+of+neural+circuits+in+deep+brain+regions%3A+Simultaneous+optical+and+electrical+recordings+of+auditory+responses+in+mouse%27s+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus.</a> Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).</li>
<li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li>
<li>Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+In+Vivo+Imaging+of+Hippocampal+Dendrites+and+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147(2004).</li>
<li>Busche, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+soluble+amyloid-%CE%B2+for+early+hippocampal+hyperactivity+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical role of soluble amyloid-β for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740(2012).</li>
<li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Consolidation+of+Ensemble+Neural+Plasticity+Patterns+in+Hippocampal+Area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li>
<li>Castello-Waldow, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurons+with+stable+excitatory+connectivity+become+part+of+neuronal+representations%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations.</a> PLOS Biology. 18 (11), 3000928(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, hipokampus CA1 bölgesinin farelerde uzun süreli görüntülenmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, virüslerin veya ilaçların doğrudan ilgi çekici nöronlara hedefli bir şekilde yönetilmesini sağlayan özel yapım bir görüntüleme penceresinin kronik implantasyonuna dayanmaktadır. Mevcut protokol dört ana bölümden oluşur: i) görüntüleme implantının montajı; ii) görüntüleme implantının montajı; iii) görüntüleme implantı ile virüs enjeksiyonu; iv) Farelerin davranışlarında fonksiyonel görüntüleme. Aşağıda, yöntemin protokolündeki kritik adımları, sorun gidermeyi, değişiklikleri ve sınırlamaları açıklar ve tartışırız. Ayrıca yöntemin önemini ve potansiyel alternatif uygulamalarını tartışıyoruz.
Açıklanan protokolde başarılı cerrahi için oldukça önemli olan birkaç kritik adım vardır: (i) yüksek kaliteli bir görüntüleme implantının hazırlanması; (ii) steril cerrahi durumlar; (iii) korteksin aspirasyonu; (iv) görüntüleme implantının hassas yerleştirilmesi; (v) viral enjeksiyon. Adım 1.6'nın gösterdiği gibi, aşırı lehim tenekesi daha büyük bir kraniyotomi gerektirir ve böylece iltihaplanma riskini arttırır. Kapak camını görüntüleme kanamasına sabitlerken uygun miktarda yapışkan optik tutkal kullanmak da çok önemlidir, adım 1.11'de belirtildiği gibi, yetersiz bir miktar serebrospinal sıvının görüntüleme akümülasına sızmasına ve opak hale getirilmesine neden olabilir. Öte yandan, aşırı optik yapıştırıcı cam pencerenin saydamlığının azalmasına neden olabilir. Görüntüleme implantının olası kirlenmesi, optik pencere altındaki bağ dokusunun aktif olarak çoğalmasına ve/veya şiddetli iltihaplanmaya neden olabilir ve bu da deneyin erken sonlandırılmasına neden olur. Bu nedenle ameliyat öncesi görüntüleme implantı montajı ve hazırlanması neredeyse cerrahi işlemin kendisi kadar önemlidir.
Ameliyat sırasında korteksin kraniyotomi altındaki kısmı hafif aspirasyon ile ablatlanır ve bu da kaçınılmaz kanama ile sonuçlanır. Cerrahi sahadaki kan, çıkarılması gereken beyin dokusunun görünürlüğünü önemli ölçüde azaltır. Bu, gerekli doku ablasyon derinliğinin kesin değerlendirmesini zorlaştırır. Dokunun bir sonraki kısmını çıkarmak için emme uygulamadan önce cerrahi bölgenin her seferinde PBS ile dikkatli bir şekilde yıkanması derinliğin daha iyi kontrol etmesini sağlar. Beyin dokusu, daha fazla emişle devam etmeden önce ablated dokunun derinliğini doğrulayan adım adım küçük porsiyonlarda her zaman çıkarılmalıdır. Daha ince bir künt iğne ile emmenin daha ince kontrolü de sağlanabilir. 26 G iğne kullanmanızı öneririz, ancak 26 G çapından daha küçük tıkanmaya daha yatkındır. Ayrıca, korteks, korpus callosum ve hipokampüsün rengi fareden fareye değişebileceğinden, her hayvan için gereken aspirasyon derinliğini belirlemek genellikle çok fazla pratik gerektirir (Şekil 3).
Görüntüleme penceresinin hipokampüsün dorsal yüzeyine mümkün olan en yakın konumunu sağlamak için görüntüleme implantının yerleştirilmesi ve sabitlemesi çok hassas bir şekilde yapılmalıdır. Hazırlanan kraniyotomi boyutu implantla yakından eşleşmeli ve önemli bir direnç olmadan yerleştirilmesine izin vermelidir. Aynı zamanda, uygun sızdırmazlık sağlamak ve beyin dokusuna maruz kalmayı önlemek için kafatası ve implant arasında görünür bir boşluk olmamalıdır. Kafatasına sızdırmazlığı sırasında implantın üstüne yumuşak ve kararlı basınç uygulanmalıdır. İmplant kurulumu sırasında görüntüleme penceresinin altında kan olması neredeyse kaçınılmazdır. Cerrahi işlem düzgün yapılırsa, pencere 3-7 gün içinde temizlenmeli ve beyin damarı açıkça görülebilir hale gelmelidir. Virüsün pencerenin altına düzgün bir şekilde enjekte edildiğine emin olmak da önemlidir. Başarısız ifade durumunda, virüs birden çok kez yeniden eklenebilir.
Bazı durumlarda karşılaştığımız en büyük komplikasyon görüntüleme penceresinin görünürlüğünün azalmasıdır. Düşük görüntüleme kalitesinin birkaç olası nedeni vardır: i) devam eden iltihaplanma; ii) cam üzerindeki bağ dokusunun büyümesi; iii) pencere ve hipokampus arasındaki büyük boşluk. İltihaplanma genellikle ameliyat sırasında kontaminasyondan veya uygun şekilde sterilize edilmiş görüntüleme implantı nedeniyle ortaya gelir. Her ameliyattan önce ve sonra cerrahi aletlerin otomatik olarak kapatılarak işlemden hemen önce ameliyat alanını dezenfekte etmeyi ve ameliyat sırasında temiz kişisel koruyucu ekipman giymenizi öneririz. Görüntüleme implantları monte edildikten sonra temizlenmeli, sterilize edilmeli ve steril koşullarda saklanmalıdır. Görüntüleme implantının camındaki bağ dokusunun büyümesi, camın yüzeyindeki mekanik kirlenmeye veya korteks ablasyonu sırasında beyin dokusunun aşırı travmasına bağlı olabilir. İmplantı monte ettikten sonra, cam yüzeyin temiz ve pürüzsüz olduğunu onaylamak önemlidir. Ayrıca, kraniyotomi içine görüntüleme implantı yerleştirilmeden önce tüm hasarlı beyin dokusu parçaları dikkatlice çıkarılmalıdır. Bazı durumlarda, cam pencere ile hipokampus arasındaki boşluk beyin omurilik sıvısının birikmesiyle sonuçlanır ve görüntüleme kalitesini azaltır. Bu nedenle, implant kurulumu sırasında, hipokampus ve cam pencere arasında iyi temas sağlamak için sonuna kadar takmak çok önemlidir. Bazen, opak görüntüleme penceresinin tam nedenini belirlemek zordur. Optik pencere altındaki koşulları ortaya çıkarmak ve buna bağlı olarak sonraki ameliyatları ayarlamak için ölüm sonrası analiz yapmanızı öneririz.
Yöntemin in vivo görüntülemeden önce ve in vivo görüntüleme sırasında dikkate alınması gereken birkaç temel ve teknik sınırlaması vardır. En önemli sınırlamalardan biri korteks ablasyondur. Ameliyat sırasında görsel ve duyusal korteksin bir kısmı çıkarılır. Korteks ablasyonunun etkisini hassas bir şekilde değerlendirmek zor olsa da, çıkarılan beyin dokusu doğrudan hipokampus üzerine yansıtılmadığı için, birkaç çalışma hipokampal bağımlı öğrenme veya diğer ilgili hipokampus fonksiyonlarında gözle görülür bir bozukluk olmadığını göstermiştir15,16. Optik sınırlamalar, özellikle yüksek NA objektif lensler kullanıldığında da göz önünde bulundurulmalıdır. Örneğin bu çalışmada 1,9 mm iç çaplı 1,75 mm uzunluğunda bir canül kullandık. Bu canül geometrisi, hava hedefinin tam NA'sını ~ 0.5'ten fazla NA veya NA ile su hedefini ~ 0.6'dan fazla korumaz, çünkü ışığın bir kısmını kesecektir. Tüm beyin görüntüleme implantları için yaygın olan bir başka sınırlama, beynin bir kısmının açığa çıkıyor olmasıdır, böylece ısı kaybını teşvik eder17,18. Bununla birlikte, fizyolojik beyin sıcaklığı görüntüleme sırasında sıcak bir tamponun perfüzyonu ile kolayca geri yüklenebilir.
Açıklanan yöntem, diğer uygulamalar için kolayca değiştirilebilir veya ayarlanabilir. Örneğin, hazırlık striatum7'ningörüntülenmesi için uyarlanabilir. Striatum hipokampustan biraz daha derine uzandıkça, görüntüleme implantını monte etmek için daha uzun görüntüleme cannula kullanılmalıdır. 2.0 mm görüntüleme canül kullanmanızı öneririz. Kraniyotomi koordinatları buna göre ayarlanmalıdır (AP: +0.8 mm, ML: −1.8 mm). Ek olarak, infüzyon kanül yoluyla virüs enjeksiyonu, sınırlı spread19,20ile AAV serotipini kullanırken ince bir nöron tabakasında bir transjenin ekspresyonunu elde etmeyi sağlar. Daha derin katmanlardan gelen odak dışı floresan azalması ve sonuç olarak geliştirilmiş tek hücreli çözünürlük görüntülemesi nedeniyle tek foton görüntüleme için özellikle faydalıdır. Ayrıca, enjeksiyon kanülleri, ilaçların veya diğer kimyasalların doğrudan FOV'daki nöronlara verilmesi için fonksiyonel görüntüleme sırasında da kullanılabilir (Şekil 5B). Genel infüzyon kanül, görüntüleme implantı için yararlı işlevler ekleyerek hedeflenen viral ekspresyon nedeniyle görüntüleme kalitesini artırır ve FOV'daki nöronların farmakolojik uyarılmasını sağlar. Kullanılan kafa plakası, koşu bandında aktif olarak hareket eden hayvanlarda bile hareket yapıtlarını en aza indiren görüntüleme implantının olağanüstü stabilitesini sağlar. Baş plakası küçük ve hafiftir, hayvanlara minimum rahatsızlık verebilir ve kurulumdan sonra birkaç ay boyunca sabit kalır. Görüntüleme implantı ayrıca multifotoğraf görüntüleme15,16,21 ile uyumludur ve mikro endoskoplar 22,23ile birleştirilebilir. Benzer bir görüntüleme implantı, stratum radiatum, stratum lacunoz ve dentat girus 16 , 24 ,25,26,27dahil olmak üzere daha derin hipokampus yapılarının çok sesli görüntülenmesi için de kullanılmıştır. Bununla birlikte, infüzyon kanül yoluyla AAV'lerle daha derin hipokampus yapılarının hedeflenmesi, AAV serotipinin ve hacim19'undaha fazla optimizasyonunu gerektirebilir.
Açıklanan protokolün, basit ve uygun fiyatlı tek foton görüntüleme kurulumları kullanarak farelerin hipokampusunda yüksek mekansal çözünürlüğe sahip nöronal aktiviteyi araştırmayı amaçlayan çalışmaları kolaylaştıracağına inanıyoruz.

Hipokampus, öğrenme ve hafıza1'in yanı sıra mekansal navigasyon2'densorumlu önemli bir beyin bölgesidir. Hipokampal atrofi, hafıza kaybı ve bilişsel düşüş içeren nörolojik ve psikiyatrik bozukluklarla ilişkilidir3,4,5. Farelerde, hipokampus hücresel ve ağ seviyelerinde mekansal, bağlamsal ve ilişkilendirilebilir öğrenme ve bellek oluşumunu incelemek için çok iyi kurulmuş bir modeldir4,5. Öğrenme ve hafızanın mekanistik çalışmaları, farelerin davranışlarında nöronal yapının ve işlevin uzunlamasına sorgulanarak sorgulanılmasını gerektirir. Genetik olarak kodlanmış problar6 ile birlikte floresangörüntüleme,membran voltaj dinamikleri7,8, kalsiyum geçicileri9ve yapısal değişiklikleri intravital olarak büyük nöron alt kümeleri üzerinde10 kaydetmek için eşi görülmemiş yetenekler sağlar. Bununla birlikte, farelerde hipokampusa optik erişim, kalınlığı 1 mm'nin üzerine ulaşabilen korteks tarafından engellenmiştir. Burada, farelerde sırt hipokampüsün CA1 alt bölgesine uzun süreli optik erişim için özel yapım bir görüntüleme cihazının ve kronik implantasyonunun fare kafasına monte edilmesi için bir prosedür tanımladık. Görüntüleme implantına entegre infüzyon kanülleri, virüslerin veya ilaçların doğrudan görüş alanındaki nöronlara verilmesine izin verir. Geniş alanlı mikroskopi ile birlikte tariflanan preparat, uzun süre farelerde davranan nöronların büyük alt kümelerinin tekrarlayan görüntülemesini sağlar. Bu hazırlığı hipokampal CA1 bölgesindeki kalsiyum ve voltaj genetik olarak kodlanmış göstergeleri tek hücreli çözünürlükte nöronal aktivite kayıtları için rekombinant adeno ilişkili virüsün (rAAV) hedefli enjeksiyonu ile ifade etmek için kullandık. Ayrıca, hayvanlara yapılan davranışlarda yüksek mekansal çözünürlükte ilgili nöronal alt kümelerin boyuna kalsiyum görüntülemesini gerçekleştirdik. Ek olarak, bu preparat multifotoğraf mikroskopisi ve miksoskopi ile uyumludur, böylece farelerde hücresel ve hücre altı seviyelerde nöronal ağları incelemek için görüntüleme tekniklerinin araç kutusunu daha da genişletir. Kritik adımları ve protokolün sorunlarını gidermeyi anlattık. Yöntemin olası tuzaklarını ve sınırlamalarını da tartıştık.

<table><tbody><tr><td>Kapak camı</td><td>Deckgl&auml; ser</td><td>72296-03</td><td></td></tr><tr><td>Protez&nbsp; Baz Reçine</td><td>ShangHai Yeni Centery Dentel Malzeme</td><td>N/A</td><td>Tip I, kendiliğinden katılaşan</td></tr><tr><td>Kukla Kanül</td><td>RWD Life Science Co., LTD</td><td>62102</td><td>OD 0.30mm</td></tr><tr><td>Kılavuz Kanül</td><td>RWD Life Science Co., LTD</td><td>62003</td><td>26G</td></tr><tr><td>Kafa Çatalı</td><td>N/A</td><td>N/A Özel</td><td>yapım</td></tr><tr><td>Kafa Plakası</td><td>N/A</td><td>N/A Özel</td><td>yapım</td></tr><tr><td>Görüntüleme Kanülü</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Özel Yapım; OD 3mm, ID 2.7mm, Yükseklik 1.8mm, # 108 paslanmaz çelik</td></tr><tr><td>İç Kanül</td><td>RWD Life Science Co., LTD</td><td>62203</td> <td>& nbsp; 0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td></tr><tr><td>Kwik Sil</td><td>World Hassas Aletler</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>SuperBond C& B</td><td>SUN MEDICAL</td><td>N/A</td><td>SuperBond C& B kiti</td></tr><tr><td>Koşu Bandı Kiti</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Özel yapım</td></tr><tr><td>UV ile kürlenmiş Yapıştırıcı</td><td>NORLAND ÜRÜNLERİ</td><td>NOA 60</td><td></td></tr></tbody></table>

behaving farelerinin hipokampusunda nöronal aktiviteleri görselleştirmek için kraniyotomi prosedürü

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Uyanık davranan hayvanlarda nöronal aktiviteleri tek hücreli çözünürlükte görüntülemek, sistem sinirbiliminde sinir devresi fonksiyonlarının araştırılması için çok güçlü bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, memeli dokusundaki ışığın yüksek emiciliği ve saçılması, intravital görüntülemeyi çoğunlukla yüzeysel beyin bölgeleriyle sınırlar ve hipokampus gibi derin beyin bölgelerini optik mikroskopi için ulaşılamaz bırakır. Bu videoda, kafa sabiti davranan farelerde dorsal hipokampal CA1 bölgesinin kronik in vivo görüntülemesini sağlamak için özel yapım görüntüleme penceresinin hazırlanmasını ve implantasyonunu gösteriyoruz. Özel yapım pencere, viral vektörlerin ve ilaçların görüntüleme alanına hedefli olarak teslimine izin veren bir infüzyon kanülü ile desteklenmiştir. Bu hazırlığı geniş alan görüntüleme ile birleştirerek, birkaç hafta boyunca farelerin davranışlarında büyük nöron alt kümelerinden floresan kalsiyum göstergesi kullanarak nöronal aktivitenin uzun süreli bir kaydını gerçekleştirdik. Bu gerilim görüntüleme hazırlığının uygulanabilirliğini tek ani çözünürlükle de gösterdik. Nöronal aktivitenin ve bilimsel CMOS kameraların yüksek performanslı genetik olarak kodlanmış göstergeleri, tek nöronların hücre altı morfolojik ayrıntılarının yüksek zamansal çözünürlükte tekrarlayan görselleştirilmesine izin verdi. Ayrıca, açıklanan yöntemin avantajlarını ve potansiyel sınırlamalarını ve diğer görüntüleme teknikleriyle uyumluluğunu tartışıyoruz.

Genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesi kullanılarak nöronal aktivitenin in vivo görüntülenmesi. Ortalama olarak, yeterli düzeyde transgene ekspresyon elde edilirse in vivo görüntüleme implantasyondan 3-4 hafta sonra başlar. Bu zamana kadar, serebral ödem ve kanama genellikle tamamen çözülür ve beyin damarı optik pencereden kolayca gözlemlenebilir. Burada, dorsal hipokampal CA1 bölgesindeki nöronal aktivitenin tekrarlanan kayıtlarını floresan geniş alan mikroskobu altında farelerin davranmasında gerçekleştirmek için açıklanan hazırlığı kullandık. Nöronal aktiviteyi kaydetmek için, GCaMP6s14ile benzer kalsiyum duyarlılığı ve zamansal çözünürlük gösteren NCaMP713adlı parlak bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi kullandık. Hipokampustaki NCaMP7 göstergesini ifade etmek için, bir infüzyon kanül kullanarak rAAV / DJ-CAG-NCaMP7 virüsünü enjekte ettik ve enjeksiyondan 14 gün sonra boylam görüntülemeyi başlattık. Nöronal aktiviteyi kaydetmek için 100 Hz frekansa kadar ~1.5x1.5 mm FOV'da görüntülemeye izin veren 10x NA 0.3 hava objektif lensi ve Hamamatsu OrcaFusion sCMOS kamera kullandık. Yeşil floresan, standart bir GFP filtre seti kullanılarak piyasada bulunan 470 nm LED ile heyecanlandı. Yeşil kanalda elde edilen ortalama görüntüleme derinliği yaklaşık 50-120 μm'dir, bu da esas olarak stratum oriens ve stratum piramitlerinde nöronal aktivitenin kaydedilmesini sağlar. Yakın kızılötesi kanallarda görüntüleme derinliği, hipokampüsün daha derin katmanlarına ulaşan 200 μm'ye kadar olabilir8. FOV başına ortalama kayıt süresi 6-12 dk idi, ancak NCaMP7 son derece yüksek fotoğraflanabilirlik ile karakterize olduğu ve tespit edilebilir fototoksioksisite gözlenmedi(Şekil 6).
<img alt="Nöronal analizi sergileyen floresan mikroskobu, nöron aktivite diyagramı ve kalsiyum sinyal grafiği." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Şekil 6: Hipokampal nöronlardaki nöronal aktivitenin yeşil floresan genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi kullanılarak kaydedilmektedir. (A) Yeşil kanalda geniş alan floresan mikroskobu altında görüntülenen seçilmiş bir FOV. (B) A'da gösterilen ve tüm kaydın standart sapma projeksiyonu kullanılarak seçilen tek nöronlara karşılık gelen 15 ROI. (C) B'de seçilen 15 nöronun temsili floresan tek deneme izleri. (D) C. Scale barda gösterilen karşılık gelen renk kutularında gösterilen 2 kalsiyum izinin temsili yakınlaştırma görünümü, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Floresan izleri elde etmek için, nöronal somalara karşılık gelen ilgi alanları (ROI' ler) manuel olarak segmentlere ayrılmıştır ve ImageJ yazılımı tarafından analiz edilmiştir. Görüntü analizi hareket düzeltmeden önce, elde edilen veri kümeleri görüntüleme implantının yüksek stabilitesi nedeniyle hareket eserleri sergilemediği için uyanık hayvanlarda yaygın kayıt sonrası prosedürler gerekli değildi. Hipokampustan gelen nöronal aktivitelerin uyanık bir farede temsili tek denemelik optik kaydı Şekil 6'da sunulmuştur. Nöronal somalara karşılık gelen 15 ROI, Şekil 6B'degösterilen aynı FOV'dan manuel olarak seçilmiştir ve her yatırım getirislerindeki tek denemelik floresan izleri Şekil 6C'degösterilmiştir. Şekil 6D, iki farklı ROI'den floresan izlerinin iki temsili parçasını göstermektedir. Aynı FOV için 3 gün aralıklarla ardışık 4 görüntüleme seansı gerçekleştirdik. Aynı nöronları belirli FOV'larda en az iki hafta boyunca tanımlamak ve görüntülemek mümkündü (bu çalışma için daha uzun görüntüleme seansları yapılmadı, ancak aynı hazırlık daha önce7farelerde 6 aya kadar görüntüleme çalışması için kullanıldı; Şekil 7). Bu çalışmada, virüs doğumundan 21 gün sonra bile ilgi geninin güçlü bir ifadesini yönlendiren AAV / DJ-CAG vektörünü kullandık (Ek Şekil 1). Sürekli ifade, artan floresan arka planı ve kalsiyum göstergesini ifade eden yeni nöronların görünümü nedeniyle aynı nöronların uzun süreli tanımlanmasını karmaşık hale getirdi. Bu nedenle, hedef gen ekspresyonunun yönlendirilmesi için AAV serotipinin ve promotörünün seçilmesi, özellikle aynı nöron alt kümesinin boyuna görüntülenmesi gerekiyorsa deneysel tasarım sırasında önemli hususlardan biri olmalıdır. Görüntüleme kalitesi proksimal dendritleri çözmenin yanı sıra kan damarlarını görselleştirmeye izin veriyordu.
<img alt="Mikroskopi floresan görüntüleri, işaretçilerle birlikte 25-34. gün boyunca hücre büyümesini gösteren çizelge." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Şekil 7: Hipokampal alandan dört farklı FOV'un görüntü dizisi 12 gün boyunca izlendi. Hayvana 0. günde pencere takıldı ve 7. günde rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 virüsü enjekte edildi. Ok uçları FOV içinde izlenen nöronu gösteriyor. Ölçek çubukları: 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Genetik olarak kodlanmış bir voltaj sensörü kullanılarak nöronal aktivitenin in vivo görüntülenmesi. Bu çalışmada, somArchon7adlı genetik olarak kodlanmış bir yeni gerilim sensörü de kullandık, bu da hayvanlara davranışlarda tek hücreli tek ani çözünürlükte voltaj görüntülemeye izin verir7,8. SomArchon'u ifade etmek için, bir infüzyon kanülü kullanarak rAAV / DJ-CAG-SomArchon virüsünü enjekte ettik ve enjeksiyondan birkaç gün sonra kafa sabitli bir farede voltaj görüntülemesi yaptık. Nöronal aktiviteyi kaydetmek için, 150x40 μm FOV'u 830 Hz alım oranına kadar görüntülememizi sağlayan 40x NA 0.8 objektif lens ve Hamamatsu OrcaFusion sCMOS kamera kullandık. SomArchon'un bir parçasının spektrumun görünür aralığında ifadenin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için inşa ettiği GFP proteini, voltaj görüntüleme için ilgi çekici hücreleri bulmak için yeşil kanalda (470/20 nm'de LED eksitasyon, emisyon 525/50 nm) kolayca görüntülenebilir. Optik gerilim kayıtları yakın kızılötesi kanalda (lazer ekscitasyon 637 nm at 3.4 W/mm2, emisyon 665 nm uzun pas) 830 Hz alım hızında 4 x 4 binning ile gerçekleştirildi. Hipokampal bir nöronun spontan aktivitesini, eylem potansiyeli başına ortalama 7 SNR ile uyanık bir farede kaydettik (Şekil 8). 
<img alt="Sinyal-gürültü oranı grafikleri ile mikroskop görüntüsü, nöral aktivitede zamansal çözünürlüğü analiz eder." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Şekil 8: Hipokampal nöronlardaki nöronal aktivitenin, genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi SomArchon'un kızılötesine yakın bir floresan kullanılarak kaydedilmesi. (A) Kızılötesine yakın kanalda geniş alan floresan mikroskobu altında görüntülenmiş seçilmiş bir FOV. (B) A. (C) B. Ölçek çubuğunda gösterilen ilgili kutudaki voltaj izinin temsili yakınlaştırma görünümü: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
histoloji Fonksiyonel görüntüleme çalışması yapıldıktan sonra, implantın doğru yerleşimini, virüs ekspresyon alanını ve görüntülenmiş nöronlarda ilgi çekici bir proteinin lokalizasyonunu doğrulamak için ölüm sonrası analiz kullanılır. Virüs ekspresyonunun histolojik olarak doğrulanması ve implantın yerleştirilmesi için PFA sabit beyninin koronal bölümleri floresan geniş alan mikroskobu altında incelenmiştir(Şekil 9A, C). Kalsiyum göstergesini ve voltaj göstergesini(Şekil 9B, D)ifade eden bireysel nöronların yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için bir konfokal mikroskop kullanılmıştır. Beyin diliminin genel morfolojisini görselleştirmek için DAPI boyama kullanıldı. Ek olarak, beyin dilimleri, pencere implantasyonu ve viral ifadenin neden olduğu astrogliosis veya glizizi doğrulamak için immünhistokimya kullanılarak değerlendirilebilir. Önceki çalışmalarımız, prosedürün gözle görülür glioz7'yeneden olmadığını göstermiştir.
<img alt="Beyin dilimi mikroskobu; optik pencere kurulumu; floresan nöron görüntüleme; nöroanatomi analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> Şekil 9: Optik pencere konumunun ve virüs ifadesinin histolojik doğrulaması. (A) Optik pencerenin NCaMP ifade eden bir fareden yerleştirilmesini gösteren koronal bölüm beyin diliminin temsili floresan görüntüsü. Ölçek çubuğu: 1 mm. (B) NCaMP7 göstergelerini ifade eden nöronların temsili konfokal görüntüsü. Ölçek çubuğu: 25 μm. (C) Optik pencerenin SomArchon ifade eden bir fareden yerleştirilmesini gösteren koronal kesit beyin diliminin temsili floresan görüntüsü. Ölçek çubuğu: 1 mm. (D) SomArchon göstergelerini ifade eden nöronların temsili konfokal görüntüsü. Ölçek çubuğu: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: İfade süresi ile birlikte bağıl floresan yoğunluğunun nicel analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu makale, infüzyon kanülü ile desteklenmiş özel yapım bir görüntüleme penceresinin hazırlanmasını ve farelerde hipokampüsün CA1 bölgesine implantasyonunu göstermektedir.

Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Çocuklar, benim adım Wang Yangdong ve Westlake Üniversitesi'ndeki Dr. Kiryl Piatkevich moleküler biyo-mühendislik laboratuvarından geliyorum. Bugün size hipokampüsün nöronal aktivitelerini farelerde, in vivo'da görüntüleme prosedürünü göstereceğim. Kaynak makinesini açın ve gerekli sıcaklığa kadar ısıtın.Şekil olarak gösterildiği gibi yardım eden eller kullanarak görüntüleme kolayının ve enjeksiyon kolayının konumunu ayarlayın. Şırıngayı iğne ile kullanarak, görüntüleme ve enjekte kanülleri arasındaki bağlantı noktalarına beş saniye boyunca az miktarda uygun akı uygulayın ve ardından damlacığı çıkarın. Lehim tenekesini monte edin ve akı ile tedavi edilen bağlantı noktasına uygulayın.Ameliyat sırasında yapılması gereksiz daha büyük kranial gerektireceğinden aşırı lehim tenekesi kaçının. Lehim tenekesi soğumasını bekleyin. Genellikle birkaç saniye sürer.Her iki yönden de kukla canül takılarak enjeksiyon kolayın engellenmediğini onaylayın. Bir kürdan veya 26 kalibrelik şırınga iğnesi kullanarak görüntüleme kanüllerinin alt tarafına UV kürleme optik yapıştırıcı uygulayın. Görüntüleme canülüne karşılık gelen boyutta bir kapak camını dikkatlice yerleştirmek için ince bir cımbız kullanın.Yapıştırıcıyı standart bir el UV lambasından UV aydınlatma ile en az bir saat boyunca iyileştirin. IACUC onaylı prosedüre göre fareyi izofluran ile uyuşturun. Fareyi bir ameliyat ısıtma yastığının üzerine stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin.Başı kulak çubuklarıyla sabitleyin. Başın sıkıca sabit olduğundan emin olmak için başı her yöne hafifçe itin. Ameliyat sırasında hayvanın gözlerinin kurumasını önlemek için göz merhemi uygulayın.Kürkü boynun arkasından gözlere kadar çıkarmak için bir düzeltici veya depilatör krem kullanın. Kesi yapmadan önce cerrahi bölgeyi betadin ve ardından %70 etanol ile üç kez sterilize edin. Kafa tabanının her yerinde yatay kesimden başlayarak kafatasının üstündeki deriyi çıkarın, ardından rostral yönde iki kesik, neredeyse göz kapaklarına ulaşır.Sonra orta çizgide birleşen iki eğik kesik. İki steril pamuklu çubukla, bağlantı dokusunu ve boynun arkasının kafatasının kenarlarına kaslarını geri çek. Aşırı ağrıyı önlemek için periosteumun yüzeyine iki dakika boyunca bir damla lidokin çözeltisi uygulayın.Kuru ve pürüzlü bir yüzey oluşturmak için kafatasının tüm açık alanını bir neşterle hafifçe kazıyın. Kafa konumunun dikey olduğunu onaylamak için AP koordinatının sıfır olup olmadığını ve ml koordinatının sıfır olup olmadığını görmek için iğnenin ucunu Lambda'ya yerleştirin. Değilse, AP ve ML koordinatları 0,1 milimetre içinde olana kadar stereotaksik istasyondaki muhabir düğmelerini ayarlayın.Kraniyotomi için karşılık gelen noktaları bulmak için iğnenin ucunu hareket ettinin ve ince bir işaretleyici kullanarak kafatasındaki konumlarını işaretleyin. Dört işaretli noktaya ve dairenin cannula tarafındaki enjeksiyon cannula alanının ana hatlarına göre bir daire çizin. Kafatasında işaretlenmiş anahat boyunca hafifçe delmek için dakikada 10.000 mermi hızında bir pnömatik matkap kullanın.Kafatasını, genellikle merkezde hafif bir dokunuşla hareket etmeye başlayan çok ince bir kemik tabakası kalana kadar delin. Kraniyotomi merkezine bir damla steril PBS uygulayın. Kemik kapağını kafatasından çok ince uçlu uzun uçlu uzun uçlu veya karşı taraflardan yaklaşan iki 26'lı iğne ile kaldırın.Dura yüzeyini temizlemek için 26 kalibrelik künt bir iğneden pbs ve ardından hafif aspirasyonlar uygulayın. Korteksin yanı sıra hipokampüsün üzerindeki Corpus Callosum'u emmek için nazik emiş uygulayın. Korteks genellikle Corpus Callosum'dan daha sarıdır.Ve Corpus Callosum genellikle hipokampustan daha geniştir. Ayrıca, Corpus Callosum'u yukarıdan gözlemlendiğinde dikey ve yatay yönlere giden nöronal liflerle ayırt etmek gerçekten kolaydır. Bu noktada kanama kraniyotomide beyin dokusunun görünürlüğünü etkileyecektir.PBS uygulayın, ardından hafif emiş uygulayın, kandan kurtulmak için korteksi arzularken, Corpus Callosum şemada şematik olarak gösterildiği gibi beyaz liflerin yönü ile tanınabilir. Corpus Callosum liflerini dairesel bir hareketle hafif emiş uygulayarak katman katman çıkarın. PBS, maruz kalan beyin dokusunun üzerinde biriken kanlardan kurtulmak için sürekli olarak uygulanır.İmplantı kraniyotomi içine hafifçe yerleştirin. İmplantın optik penceresini hipokampüsün maruz kalan yüzeyine mümkün olduğunca yakın konumlandırmak için L şeklindeki iğne ile implantın üzerine sıkıca bastırın. İmplant etrafındaki yara izine tekrar tekrar PBS uygulayın, ardından implant yerleştirilmesi sırasında kanı mümkün olduğunca çıkarmak için emme uygulayın.Diş çimentosunun kafatasının altına nüfuz etmesini önlemek için implant ve kafatası arasına ince bir hızlı conta tabakası uygulayın. Hızlı conta iyileştikten sonra, kafatasının yüzeyine, hızlı contanın yüzeyine ve implantın yüzeyine eşit olarak süper bağ uygulayın. Süper bağ iyileştikten sonra, ameliyatın başında yapılan kesi etrafındaki cildin yanı sıra süper bağın üzerine protez bazlı reçine uygulayın.Protez tabanı reçinesi iyileştikten sonra kafa plakasını implantın etrafındaki reçinenin üzerine yerleştirin ve görüntüleme kanı ile konsantre olmasını sağlamak. Konumunu sabitlemek için kafa plakasının etrafına ve üstüne daha fazla protez taban reçinesi uygulayın. Birkaç dakika tedaviye bırakın.Görüntüleme penceresine daha iyi erişimin objektif mercek olmasını sağlamak için canül etrafında kalın bir çimento tabakası oluşturmaktan kaçının. Viskozitesini azaltmak için protez taban reçinesini seyreltin, böylece ulaşılması zor olan boşlukları bir aplikatörle doldurmasını sağlar. Pencereyi hayvan bantlamadan olası kirlenmeye karşı korumak için pencerenin üzerine yavaşça yalıtımlı bir kauçuk bant yerleştirin.Virüs çözeltisine Hızlı Yeşil boya stok çözeltisi ekleyin, bir PCR tüpünde bir ila dokuz oranında istenen titreye seyreltin. Virüs çözeltisinin 600 nano litresini çekin, kukla kanülünü çıkarın ve iç kanülleri enjeksiyon şırıncığına kılavuz kanüle bağlayın. Virüsü dakikada 15 nano litre hızında, toplamda 10 dakika boyunca demleyin.Virüsün pencerenin altına yayılması için iç canülleri 10 dakika bağlı tutun. İç canülleri kılavuz canülden hafifçe çıkarın ve kukla canül ile yeniden yakalayın. Fareyi birkaç dakika boyunca% 4 izofluran ile teşvik edin.Kafa plakasını kafa çatalı üzerine sabitleyin ve sonra kafa çatalını koşu bandına sabitleyin. İşlevsel görüntüleme için görünümü filtrelemek için en iyisini bulmak için düşük büyütme nesnel lensi kullanın. Ardından, nöronal aktiviteleri tek hücre çözünürlüğünde kaydetmek için daha yüksek objektif bir lense geçin.Kalsiyum görüntüleme için yeşil floresan, standart bir GFP filtre duyusu kullanılarak piyasada bulunan 470 nanometre LED ile heyecanlandı. Floresan izler elde etmek için, nöronal hücre kütlesine karşılık gelen ilgi alanları manuel olarak segmentlere ayrılmıştır ve ImageJ yazılımı tarafından analiz edilmiştir. 40 X lens optik voltaj kaydı kullanılarak gerilim görüntüleme için yakın kızılötesi kanalda 830 Hertz alım oranlarında gerçekleştirildi.Spontan sinirsel aktivite kaydı 25.000 kareye kadar sürekli olarak sürdü. Burada, hipokampüsün farelerde A1 bölgesi olarak uzun süreli görüntülenmesi için bir yöntem tarif ediyoruz. Yöntem kronik implantasyona dayanmaktadır.Şimdi, virüslerin veya ilaçların doğrudan ilgi çekici nöronlara hedefli bir şekilde yönetilmesini sağlayan özel yapım görüntüleme penceresi. Açıklanan protokolün, basit ve uygun fiyatlı 1 foton görüntüleme kurulumları kullanarak farelerin hipokampusunda yüksek mekansal zamansal çözünürlükle nöronal aktiviteyi araştırmayı amaçlayan çalışmaları kolaylaştıracağına inanıyoruz.

craniotomy-procedure-for-visualizing-neuronal-activities-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video ve protokol kemirgenlerde bir cam kaplı kafatası pencere nasıl implant göstermektedir. Bu hazırlıklar, kronik in vivo iki ay zaman ölçekleri üzerinde neokorteks foton görüntüleme için kullanılabilir. Optik içsel sinyal görüntüleme gibi diğer görüntüleme türleri için de kullanılıyor olabilir.

Kronik Beyin Görüntüleme Kraniyotomi Cerrahi Prosedür

Biz nöronların CA1-CA3 dizi koruyan bir in vitro katlanmamış hipokampus geliştirdik. Nüfuz mikro elektrot dizisi ile birlikte, sinir aktivitesi hem uzunlamasına hem de enine yönlerde izlenebilir. Tüm hipokampta yayılma aynı anda kaydedilebilir Bu yöntem hippocampal slice preparatlarda fazla avantajlar sağlamaktadır.

Bir Penetran Mikro-elektrot Array ile bir Kırımsız Hipokampal Hazırlık Sinir Faaliyet Yayılım

Bu protokol, fare serebral korteksinin temporal hem de parietal bölgelerinde üzerinde büyük tek taraflı kraniyotomi oluşturmak için bir yöntem sunulur. Bu kortikal yarımkürenin geniş alan üzerinde gerçek zamanlı görüntüleme için özellikle yararlıdır.

Beyin Faaliyet Mesoscale Geniş alan Optik Görüntüleme için Büyük Yanal Kraniotomi Prosedürü

Multifoton görüntüleme sadece doku yüzeyinden sınırlı derinliklerde etkili olurken, pCLE ile herhangi bir derinlikte 3 μm çözünürlükte görüntüleme elde etmek mümkündür. Burada, iktal ve vahşi tip farelerin hipokampusundaki mikrovasküler dinamikleri ölçmek için pCLE görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Uyanık Farelerde Hipokampal Kılcal Damarların İn Vivo Fiber Bağlantılı Klinik Öncesi Konfokal Lazer Taramalı Endomikroskopisi (pCLE)

Bu iletişim kuralı yerel alan potansiyelleri ile çoklu şaftlı doğrusal silikon sondalar kayıt açıklar. Geçerli kaynak yoğunluk analiz kullanarak sinyalleri dönüşüm yerel elektrik etkinlik yeniden inşası farenin hipokampus sağlar. Bu teknik ile dağınık şekilde kısıtlı beyin salınımlarını serbestçe fare hareket okudu olabilir.

Dağınık şekilde kayıt sınırlı salınım oluşur içinde fareler davranmak

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Biz postitudinal hipokampal beyin dilimleri ve uzunlamasına konumlandırılmış kayıt ve stimülasyon elektrotlar in vivo hücre dışı postinaptik potansiyelleri uyandırmak ve göstermek için kullanılan kayıt ve stimülasyon elektrotlar uzunlamasına interlamellar CA1 boyunca uzun vadeli sinaptik plastisite.

Elektrofizyolojik Alan Kaydı ile Interlamellar Hipokampus CA1'de Uzun Süreli Sinaptik Plastisitenin Araştırılması

Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Farelerin dorsal-ara hipokampusundan akut dilimler hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu transversal preparatı, kayıtların kalitesi ve kaydedilen nöronların morfolojik özelliklerinin korunması açısından koronal dilimleme ile karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Burada, sıçanlarda ve farelerde yüksek yoğunluklu mikro-elektrokortikografi (μEcoG) kaydı için cerrahi, implantasyon ve kayıt yöntemleri dahil olmak üzere iki protokol sunuyoruz. μECoG kayıtları, sıçan işitsel korteksinde laminer politrod kaydı veya fare somatosensoriyel korteksindeki nöral aktivitenin optogenetik manipülasyonu ile kombinasyon halinde gerçekleştirilir.

Kemirgenlerde Laminer Politrodlar ve Optogenetiğin Mikro Elektrokortikografi ile Entegre Edilmesi ile Kortikal İşlemenin Çok Ölçekli Araştırılması

Öğrenin, davranan farelerin hipokampus CA1 bölgesindeki nöronal aktiviteleri kronik in vivo görüntülemek için kraniyotomi prosedürünü. Entegre infüzyon kanülü ile uzun süreli optik erişim ve viral vektör teslimi sağlanır.

Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü

Daha fazla video keşfet