Name: Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Öğrenin, kemirgen ve insan beyin dokularında aktin polimerizasyonunu floresan spektroskopi ile hızlıca ölçmek için yüksek verimli bir yöntem. Bu teknik, sinaptik plastisite ve nöropatolojik araştırmalarda F-aktin düzeylerini doğrudan nicelendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Yeni Zelanda Nörolojik Vakfı (1835-PG), Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi (#16-597) ve Yeni Zelanda Otago Üniversitesi Anatomi Bölümü tarafından desteklendi. İnsan beyin dokuları için HCB-IDIBAPS BioBank (İspanya) Nörolojik Doku Bankası'na borçluyuz. Jiaxian Zhang'a videonun kaydedilip düzenlenmesindeki yardımı için teşekkür ederiz.

Tüm deneysel işlemler Otago Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımında Etik Kurulu'nun yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Etik Protokol No. AUP95/18 ve AUP80/17) ve Yeni Zelanda yasama organı. İnsan beyin dokuları, İspanya'nın Barselona kentindeki Clínic-IDIBAPS BioBank Hastanesi Nörolojik Doku Bankası'ndan elde edildi. Tüm doku toplama protokolleri Barselona'daki Clínic Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı ve ailelerden bilgilendirilmiş onay alındı.
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Beyin dokusunun homojenizasyonu ve sinaptik terminallerin zenginleştirilmiş fraksiyonunun hazırlanması için aşağıdaki tamponları hazırlayın: Homojenizasyon tamponu: 5 mM HEPES, pH 7.4 0.32 M sakkaroz ile desteklenmiş Resüspenzyon tamponu: 5 mM Tris, 0,32 M sakkaroz ile desteklenmiş pH 7,4 Yıkama tamponu: 5 mM Tris, pH 8.1 1.2 M sakaroz 1.0 M sakaroz 0.85 M sakaroz</li>
	<li>Proteaz ve fosfataz inhibitörlerinin ev yapımı veya ticari karışımını ekleyin. NOT: Komple Proteaz inhibitör karışımının (10 mL tampon başına 1 tablet) ve Fosfataz inhibitörü kokteyl IV'ün (1:100; hacim: hacim) EDTA içermeyen sürümünü kullandık.</li>
	<li>Phalloidinin sabitlenmesi, permeabilizasyonu ve bağlanması için aşağıdaki tamponları ve reaktifleri hazırlayın: Krebs tampon: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM glikoz, 20 mM HEPES, pH 7.4 1 M KCl %25 glutaraldehit (stok çözeltisi) % 0,1 Triton X-100 ve 1 mg/mL NaBH4 içeren Krebs tamponu DMSO'da 400x Alexa Fluor 647 Phalloidin 0.32 M sakkaroz içeren Krebs tamponu DMSO'da 50 μM latrunculin A (stok çözümü) 1 M KCl (stok çözümü) DİkKAT: Phalloidin toksiktir (LD50 = 2 mg/kg) ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Glutaraldehitin solunması toksiktir ve bir duman kaputunda ele alınmalıdır.</li>
	<li>Tamponları 4 °C'de, phalloidin ve latrunculin A'yı ise -20 °C'de uzun süreli depolama için saklayın. NOT: Arabelleklerin uzun süreli depolanmasının önerilmez. Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>2. Beyin dokusu homojenizasyonu
<ol><li>Bir Potter-Elvehjem cam tüpünde ve buzda pestle içinde 10 cilt homojenizasyon tamponunda kriyoprezer korunmuş veya taze parçalanmış sıçan beyin dokusunu homojenize edin. NOT: Optimal homojenizasyon, beyin dokuları için elle 15-20 inme ile elde edilir. Başarılı homojenizasyon, süspansiyonun cam tüpten sorunsuz akışı ile doğrulanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.</li>
	<li>Bradford tahlil31kullanarak homojenattaki protein konsantrasyonu belirleniyor. NOT: Protein tahmini için alternatif ev yapımı veya ticari tahliller de kullanılabilir.</li>
	<li>Krebs tamponunda homojenat örnekleri 50 μL hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda seyreltin. NOT: Bazı deneylerimizde, homojenleri 37 °C'de 1 saat boyunca 2 μM latrunculin A veya DMSO (kontroller) ile kuluçkaya yatırıyoruz. Bunun için homojenatlar 48 μL Krebs tamponunda yeniden sulanır ve 50 μM latrunculin A veya 2 μL DMSO'nun 2 μL'si eklenir. İmmünblotting için ayrıca, inkübasyondan sonra az miktarda örnek (10 μg) toplanır.</li>
	<li>Homojen örnekleri düzeltin (bölüm 5).</li>
</ol>3. İzole sinir terminallerinin hazırlanması
<ol><li>Sinaptozomların hazırlanması NOT: Sinaptozomlar için alternatif protokoller32,33 de kullanılabilir.<ol>
<li>Santrifüj beyin 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.200 x g'da homojendir.</li>
		<li>Ham nükleer fraksiyon olan peleni atın.</li>
		<li>3.1.1 adımda elde edilen süpernatantı (S1) 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca daha fazla santrifüj edin.</li>
		<li>Çözünür sitozolitik fraksiyon olan süpernatantı (S2) çıkarın.</li>
		<li>Resüspensyon tamponunda ham sinaptozomal fraksiyon olan 3.1.3 adımında elde edilen peletin (P2) yeniden dürttü. NOT: Resüspenzyon tamponunun hacmi başlangıç dokusunun miktarına ve elde edilen pelet miktarına bağlıdır. Örneğin, 150-300 mg beyin dokusu ile başlarken, elde edilen pelet 200 μL resüspenzyon tamponunda yeniden kullanılabilir.</li>
		<li>Yeniden canlanan ham sinaptozomları 0,85-1,0-1,2 M sakkaroz eşit hacimlerde yapılmış süreksiz bir sakkaroz gradyanı üzerine yükleyin. NOT: Tipik olarak sakkaroz çözeltisinin her biri için 1 mL kullanırız (150-300 mg doku için). Bu daha büyük doku miktarlarına göre değiştirilebilir. Süreksiz gradyanlar, ultracentrifuge tüpünün iç duvarına bastırılmış 25G şırıng ve sakkaroz katmanlarının yumuşak katmanları kullanılarak yapılabilir.</li>
		<li>4 °C'de 2 saat için 85.000 x g'da santrifüj. NOT: Santrifüjlemenin yüksek hızı nedeniyle, ısıtmayı azaltmak için vakum oluşturabilen bir ultra merkezigül gereklidir.</li>
		<li>200 μL pipet ucu kullanarak 1.0 ile 1.2 M sakkaroz arasındaki arayüzde sinaptozmal fraksiyonu toplayın.</li>
		<li>Sinaptozomal fraksiyonu 18.000 x g'da santrifüjleme ile buz gibi yıkama tamponu ile 4 °C'de 10 dakika yıkayın. NOT: Yıkama için, 1.0 ve 1.2 M sakkaroz arayüzünde elde edilen sinaptozmal fraksiyon taze bir 1.5 mL tüpte toplanır ve yüksek sakkarozun ortamdan uzaklaştırılmasını sağlayan eşit hacimde bir yıkama tamponu eklenir.</li>
		<li>Sinaptozomal peletı 12.000 g'da buz gibi homojenizasyon tamponu ile 4 °C'de 10 dakika tekrar yıkayın.</li>
		<li>Sinaptozomları buzdaki homojenizasyon tamponunda yeniden dirsintir. NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.</li>
		<li>Bradford tahlilini kullanarak protein konsantrasyonu belirlen.</li>
		<li>Krebs tamponundaki sinaptozomları 50 μL'lik bir hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda yeniden depolar (sinaptozomlar KCl ile depolarize edilecekse 47,5 μL; bkz. bölüm 4). NOT: Resüspensiyon için, sinaptozomal fraksiyon ilk olarak 12.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca döndürülür ve üst düğme (tampon) çıkarılır. Sinaptozomal pelet daha sonra 200 μL pipet ucu kullanılarak hafif pipetleme ile Krebs tamponunda yeniden sınıflandırılmıştır.</li>
		<li>Depolarizasyona devam edin (bölüm 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Sinaptonürozomların hazırlanması NOT: Sinaptoneurozomlar için alternatif protokoller34,35 de kullanılabilir.<ol>
<li>Beyni homojenatı, 1 mL şırıngan kullanarak bir filtre tutucusunda 100 μm gözenek boyutunda önceden ıslanmış bir ağ filtresinden geçirin. NOT: Numune kaybını önlemek için tüm filtrelerin önceden ıslatılması önemlidir ve homojenizasyon tamponu kullanılarak yapılmalıdır. Bunun için homojenizasyon tamponu, tampon dışarı akana kadar filtre tutucusunda bulunan filtrelerden 1 mL şırıng kullanılarak geçirilir.</li>
		<li>Filtratı (F1) buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.</li>
		<li>İkinci filtrat (F2) elde etmek için F1 kesir için işlemi (adım 3.2.1 ve 3.2.2) tekrarlayın.</li>
		<li>F2 filtratı 5 μm gözenek boyutunda bir ağ filtresinden geçirin.</li>
		<li>Filtratı (F3) buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL tüpte toplayın.</li>
		<li>Santrifüj filtrat F3 1,500 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca.</li>
		<li>Krebs tamponundaki peleti (sinaptoneurozomlar) 50 μL'lik bir hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda buz üzerinde yeniden depolar (sinaptozomlar KCl ile depolarize edilecekse 47,5 μL; bkz. bölüm 4). NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.</li>
		<li>Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonu tahmin edin.</li>
		<li>Depolarizasyona devam edin (bölüm 4).</li>
	</ol></li>
</ol>4. İzole sinaptik terminallerin KCl aracılı depolarizasyonu
<ol><li>5-10 dakika boyunca 37 °C'de eşkenel lipatokomlar/sinaptoneurozomlar.</li>
	<li>Hücre dışı K+ 'yı 37 °C'de 30 sn için 50 mM'ye çıkarmak ve ilgili uyarılmamış kontrol kümesine eşit hacimde Krebs tamponu eklemek için KCl ekleyerek sinaptozomları /sinaptoneurozomları uyarın. NOT: Örneğin, 47,5 μL Krebs arabelleğine yeniden harcanan sinaptozomlara 2,5 μL 1 M KCl ekleyin; ve ilgili uyarılmamış kontrol sinaptozomlarına 2,5 μL Krebs tamponu ekleyin. Çok sayıda örneğin yer aldığı deneyler için, depolarizasyon süresinin 30 s'yi geçmemesi için aynı anda en fazla 2 örnekle devam edin.</li>
	<li>Glutaraldehit ekleyerek stimülasyonu sonlandırın (bölüm 5).</li>
</ol>5. Örneklerin fiksasyonu ve phalloidin lekelenmesi
<ol><li>Homojenat/sinaptozomal/sinaptoneurosomal örneklere glutaraldehit ekleyin, oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca% 2,5'lik son konsantrasyona ekleyin. NOT: 50 μL numunede (homojenatlar/sinaptozomlar/sinaptoneurozomlar) glutaraldehitin son konsantrasyonunun %2,5 olması için 6 μL%25 glutaraldehit çözeltisi ekledik. Fiksasyon kritiktir ve hızlı olmalı ve bu nedenle glutaraldehit ekledikten hemen sonra, örnek güçlü bir şekilde girdaplanmalıdır.</li>
	<li>Örnekleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da tortulandır.</li>
	<li>Üsttekini çıkarın. NOT: Glutaraldehit toksik olduğu için süpernatantı duman kaputuna atın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca %0,1 Triton X-100 ve 1 mg/mL NaHB4 içeren 100 μL Krebs tamponunda resüspenzyon ile peleti dengele.</li>
	<li>Örnekleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da tortulandır.</li>
	<li>Geçirgenleştirme arabelleği kaldırılın.</li>
	<li>Peletin 200 μL Krebs tamponu ile 5 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleme ile yıkayın.</li>
	<li>Peletin, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca 100 μL Krebs tamponunda 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (500 μU'ya karşılık gelir) ile yeniden depolayın ve lekeleyin. NOT: Floresan phalloidin analoglarının diğer çeşitleri ticari olarak mevcuttur ve test için değiştirilebilir. Phalloidin konsantrasyonu ve toplam inkübasyon örnek hacmi, test edilen doku/numune miktarına ve türüne göre değiştirilmek ve buna göre optimal koşullar standartlaştırılmalıdır.</li>
	<li>Lekeli numuneleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>İlişkisiz phalloidin 'i (süpernatant) çıkarın.</li>
	<li>Numuneyi 200 μL Krebs tamponu ile 20.000 x g'da santrifüjleme ile 5 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>0,32 M sakkaroz içeren 200 μL Krebs tamponunda yeniden diriltme. NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.</li>
</ol>6. Florometrik analiz ve ışık saçılım
<ol><li>Alexa Fluor 647 Phalloidin lekeli örnekleri siyah 96 kuyu plakasında dağıtin.</li>
	<li>Floresan yoğunluğunu 645 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyunda ve oda sıcaklığında bir plaka okuyucuda 670 nm emisyon dalga boyunda ölçün.</li>
	<li>200 μL pipet uçları kullanarak numuneleri siyah 96 kuyu plakasından şeffaf 96 kuyu plakasına aktarın.</li>
	<li>Önceki sabitleme, permeabilizasyon ve boyama adımları sırasında meydana gelmiş olabilecek kayıpları düzeltmek için ışığın saçılmasını 540 nm olarak ölçün. NOT: Lekeli numunelerde tutulan biyolojik malzemedeki varyasyonlar, daha az miktarda başlangıç malzemesi için daha belirgin olabilir (bkz. Tartışma).</li>
	<li>Krebs tamponuna farklı konsantrasyonlarda bir dizi Alexa Fluor 647 Phalloidin ekleyin (0.05x, Standart eğri olarak testlerin her bir partisi için 25, 50, 125, 175, 250, 375 ve 500 μU'ya karşılık gelen 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x ve 1x. NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır ve özellikle F-actin düzeyleri göreceli olarak ifade edilirken tahlil sonuçlarını etkilemez (Bölüm 7). Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>7. Veri analizi
<ol><li>Numunelerdeki F-aktinin miktarı, bağlı phalloidin floresan yoğunluğu ile doğru orantılıdır. Etiketli phalloidin standardının doğrusal eğrisinden hesaplanan phalloidin bağlı birimlerinin mutlak cinsinden ifade. NOT: Örnek olarak, bkz. </li>
	<li>Kontrol örneklerinin bir kısmı olarak F-actin seviyelerini ifade edin. NOT: Örnek olarak, bkz.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan test, esasen değişikliklerle önceki bir çalışma30'dan uyarlanmış, floresan etiketle etiketlenmiş bir phallotoxin, phalloidin kullanmaktadır. Floresan phalloidin analogları sabit dokularda akrin filamentlerinin boyanmasının altın standardı olarak kabul edilir47,48,49. Aslında, özellikle actin filamentleri50'yi tanımlamak için en eski araçlardır ve özellikle sonraki ...

Sitoskeletal protein aktin, yapısal destek, hücresel taşıma, hücre hareketliliği ve bölünme dahil olmak üzere birden fazla hücresel işlevde yer alır. Aktin dengede iki şekilde ortaya çıkar: monomerik globüler aktin (G-actin) ve polimerize filamentli aktin (F-actin). Akinin polimerizasyon durumundaki hızlı değişiklikler (G ve F formları arasındaki interkonversiyon) hızlı filament montajına ve sökülmesine neden olur ve hücresel fizyolojideki düzenleyici rollerinin altında yatmaktadır. Actin nöronal sitoskeletal yapının ana bileşenini oluşturur ve çok çeşitli nöronal fonksiyonları etkiler1,2. Not olarak, aktin sitoskeleton sinaptik terminallerin yapısal platformunun ayrılmaz bir parçasını oluşturur. Bu nedenle, sinaptik morfogenez ve fizyolojinin önemli bir belirleyicisidir ve sinapsların boyutunun, sayısının ve morfolojisinin kontrolünde temel bir rol oynar3,4,5. Özellikle, dinamik aksin polimerizasyon-depolimerizasyon, hafıza ve öğrenme süreçlerinin altında sinaptik plastisite ile ilişkili sinaptik yeniden şekillendirmenin önemli bir belirleyicisidir. Gerçekten de, hem presynaptik (nörotransmittersalınımı 6,7,8,9,10gibi) hem de postsinaptik fonksiyonlar (plastisite ile ilgili dinamik yeniden şekillendirme11,12,13,14)kritik olarak aktin sitoskeletonunun polimerizasyon durumundaki dinamik değişikliklere dayanır.
Fizyolojik koşullar altında, F-actin seviyeleri, posttranslational modifikasyon 4 ,15 , 16ve aksin bağlayıcı proteinler (ABP' ler)4,17 içeren multimodal bir yol ile dinamik ve sıkı bir şekilde düzenlenir. ABP'ler birden fazla düzeyde (polimerizasyonun başlatılması veya inhibe edilmesi, filament dallanmasının teşvik edilmesi, filamentlerin daha küçük parçalara kesilmesi, depolimerizasyonun teşvik edilmesi ve depolimerizasyona karşı koruma gibi) aksin dinamiklerini etkileyebilir ve sırayla çeşitli hücre dışı ve hücre içi sinyallere duyarlı sıkı bir modüler kontrol altındadır18, 19,20. Birden fazla düzeydeki bu tür düzenleyici kontroller, sinaptik sitoskeletondaki aktin dinamiklerinin sıkı bir şekilde düzenlenmesini, nöronal fizyolojinin hem bazal hem de aktivite kaynaklı durumlarda ince ayarlı ön ve postynaptik yönlerini belirler.
Aktinin nöronal fizyolojideki önemli rolleri göz önüne alındığında, çeşitli çalışmaların nörodejenerasyon, psikolojik hastalıklar ve nörogelişimsel rahatsızlıklar 3 , 21 , 22 ,23,24,25 , 26,27 dahil olmak üzere çok çeşitli nörolojik bozukluklarla bağlantılı kritik patojenik olaylar olarak aksin dinamiklerindeki değişiklikler için kanıt sağlaması şaşırtıcı değildir. Bununla birlikte, nöronal fizyoloji ve patofizyolojide aktin'in kilit rollerine işaret eden araştırma verilerinin zenginliğine rağmen, özellikle sinaptik sitoskeletonda aktin dinamikleri anlayışında hala önemli boşluklar devam etmektedir. Nöronal akinin ve patolojik koşullar altındaki değişimlerinin daha iyi anlaşılması için daha fazla araştırma çalışmasına ihtiyaç vardır. Bu bağlamda ana odak alanlarından biri aksin polimerizasyon durumunun değerlendirilmesidir. Batı blotting tabanlı ticari kitler vardır (G-Actin/F-Actin in vivo tahlil biyokimyasal kiti; Cytoskeleton SKU BK03728,29) ve F-actin seviyelerinin değerlendirilmesi için ev yapımı tahliller6. Bununla birlikte, bunlar F-actin ve G-actin'in biyokimyasal izolasyonu gerektirdiğinden ve sonraki nicelemeleri immünblotting protokollerine dayandığından, zaman alıcı olabilirler. Burada, önceki bir çalışma30'dan uyarlanmış floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil, hem F-actin bazal seviyelerini hem de montaj sökümsünü dinamik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilecek değişikliklerle rapor ediyoruz. Özellikle, 1 mL cuvette için uygun numuneleri mevcut 96 kuyu plakası formatına uygun numuneler gerektiren orijinal protokolü verimli bir şekilde değiştirdik. Bu nedenle modifiye edilen protokol, test için gerekli olan doku/numune miktarını önemli ölçüde azaltmıştır. Ayrıca, protokolün sadece beyin dokusu homojenatları için değil, aynı zamanda izole sinaptik terminaller (sinaptozomlar ve sinaptoneurozomlar) gibi hücre altı fraksiyonlar için de uygun olduğuna dair kanıtlar sunuyoruz. Son olarak, test taze parçalanmış kemirgen beyin dokuları ve uzun süreli saklanan ölüm sonrası insan beyin örnekleri için kullanılabilir. Not olarak, test nöronal bağlamda sunulurken, onlarla ilişkili diğer hücre tiplerine ve fizyolojik süreçlere uygun şekilde genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>3,5 mL, üstü açık kalın duvarlı polikarbonat tüp</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Gradyan santrifüjleme için (sinaptozom hazırlığı)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td>F-aktin spesifik ligandına</td></tr><tr><td>karşı antikor&nbsp; b-aktin</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>Sc-47778</td><td>İmmünoblotlama ile toplam aktin seviyelerinin değerlendirilmesi için</td></tr><tr><td>GAPDH'ye karşı antikor</td><td>Abcam</td><td>Ab181602</td><td>İmmünoblotlama ile GAPDH seviyelerinin değerlendirilmesi için</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Testi Boya Reaktif Konsantresi</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Bradford bazlı protein tahmini</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Krebs tampon bileşeni</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA içermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td>Numune hazırlama sırasında endojen proteaz aktivitesinin inhibisyonu için</td></tr><tr><td>Corning 96 kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı Polistiren</td><td></td><td>Corning 3596</td><td>Işık saçılma ölçümleri için</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Krebs tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Phalloidin ve latrunculin için çözücü</td></tr><tr><td>Floresan düz yataklı tarayıcı (Odyssey Kızılötesi Tarayıcı)</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>İmmünoblotlar üzerindeki immünoreaktif sinyallerin tespiti için</td>Glutaraldehit çözeltisi (suda% 25) Derece II Sigma-Aldrich G6257 Sabitleyici <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Numune hazırlama için tampon bileşeni ve Krebs tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>aktin filamentlerinin depolimerizörü</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Krebs tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Mikroplakalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitex membran filtre 5 mm</td><td>Milipore</td><td>LSWP01300</td><td>Sinaptonörozomların hazırlanması</td></tr><tr><td>Florometrik ölçümler için</td><td>Nunc F96 MicroWell Siyah Plaka</td><td>Thermo Fisher Scientific 237105</td><td></td></tr><tr><td>Naylon ağ filtre 100 mm</td><td>Kırlangıç</td><td>NY1H02500</td><td>Sinaptonörozomların hazırlanması</td></tr><tr><td>Fosfataz İnhibitörü Kokteyl IV</td><td>Abcam</td><td>ab201115</td><td>Numune hazırlama sırasında endojen fosfataz aktivitesinin inhibisyonu için</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Krebs tampon bileşeni ve sinaptik terminallerin depolarizasyonu için</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik ((KH2PO4 </td><td>)Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Krebs tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum borhidrür (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>Geçirgenlik tamponu bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL944</td><td>Krebs tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL900</td><td>Krebs tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Florometrik ölçümler için</td><td>SpectraMax i3x</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/8600/60</td><td>Numune hazırlama için tampon bileşen</td></tr><tr><td>Swimnex Filtre Tutucu</td><td>Millipore</td><td>Sx0001300</td><td>Sinaptonörozomların hazırlanması</td></tr><tr><td>Doku öğütücü 5 mL Potter-Elvehjem</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>358034</td><td>Doku homojenizasyonu için</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Geçirgenlik tamponunun</td></tr> bileşeni <tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>Numune hazırlama için tampon bileşeni</td></tr></tbody></table>

kemirgen ve İnsan beyin dokularında aktüer polimerizasyon durumunu değerlendirmek için zaman verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Sitoskeletonun ana bileşeni olan Actin, nöronal yapı ve fonksiyonun korunmasında kritik bir rol oynar. Fizyolojik durumlar altında, aktin dengede iki şekilde meydana gelir: monomerik globüler (G-actin) ve polimerize filamentli (F- aktin). Sinaptik terminallerde, aktin sitoskeleton kritik pre-ve post-sinaptik fonksiyonların temelini oluşturur. Ayrıca, aktiin polimerizasyon durumundaki dinamik değişiklikler (globüler ve filamentli aktiin formları arasındaki interkonversiyon) sinaptik yapı ve işlevdeki plastisite ile ilgili değişikliklerle yakından bağlantılıdır. Burada, ex vivo koşullarda akinin polimerizasyon durumunu değerlendirmek için modifiye edilmiş floresan bazlı bir metodoloji rapor ediyoruz. Tahlil, özellikle aktüen filamentlere (F-actin) bağlanan ve polimerize filamentli aktinin doğrudan bir ölçüsünü sağlayan bir phallotoxin olan floresan etiketli phalloidin'i kullanmaktadır. İlke kanıtı olarak, tahlillerin hem kemirgen hem de ölüm sonrası insan beyin dokusu homojenliklerinde uygunluğuna dair kanıt sunuyoruz. Latrunculin A (actin filamentlerini depolymerize eden bir ilaç) kullanarak, F-actin seviyelerindeki değişiklikleri izlemede tahlilin yararını onaylıyoruz. Ayrıca, tahlilleri izole sinaptik terminallerin biyokimyasal fraksiyonlarına genişletiyoruz, burada yüksek hücre dışı K+ile depolarizasyon ile uyarılma üzerine artan aktin polimerizasyonunu onaylıyoruz.

F-actin seviyelerinin değerlendirilmesi için test doğrusallığı İlk olarak, Alexa Fluor 647 Phalloidin floresanında doğrusal artış için standart bir eğri tespit edildi ve her deney seti için tekrarlandı (Şekil 1). Tahlilin doğrusal aralığını araştırmak için kemirgenlerden (Şekil 2A ve 2B)ve ölüm sonrası insan deneklerden(Şekil 3A ve 3B)farklı miktarlarda beyin homojenliği işlenmiştir. Test, tu...

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Actin sitoskeletonun ana bileşenidir ve nöronlar da dahil olmak üzere hücresel morfoloji ve fizyolojinin çeşitli yönlerini kritik olarak düzenler. Aktin, monomerik globüler G-actin veya polimerik filamentli F-actin olmak üzere iki formu arasındaki dengede meydana gelir. Akinin polimerizasyon durumu, hem aksin bağlayıcı proteinler hem de kendi çeviri sonrası düzenlemesi ile birden fazla düzeyde sıkı bir şekilde düzenlenir.Internöronal sinaptik temaslarda, F-actin seviyelerindeki dinamik değişiklikler, hem pre hem de post sinaptik terminallerde sinyalizasyon ve plastisiteyi kontrol eden önemli bir düzenleyici olaydır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, aktüer disfonksiyon birkaç nöropatolojik durumla bağlantılıdır. Son gelişmeler nöronal fizyoloji ve patofizyolojide aksin bilgi zenginliğine yol açmıştır.Ancak çok şey hala bilinmiyor ve odaklanılması gerekiyor. Bu bağlamda, phalloidin floresan analogları akrin araştırmalarında önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Bu phallotoxin özellikle filamentli akine bağlanır ve bu nedenle F-aktilin miktarlarının ve patofizyolojik durumlardaki değişiminin doğrudan bir ölçüsü olarak kullanılabilir.Bu çalışma, toptan homojenatlar ve beyin dokularından biyokimyasal olarak izole edilmiş sinaptik terminaller gibi ex-vivo biyolojik örneklerde aktin polimerizasyon durumunun değerlendirilmesi için hızlı ve verimli bir florometrik test sunun sunun. Not olarak, test diğer hücre ve doku tiplerine ve ilişkili fizyolojik fenomenlerine uygulanabilir. Bu çalışmada kullanılan tamponların tarifleri için lütfen ayrıntılı metne bakın.Sıçanlardan veya insan deneklerden alınan beyin dokusu örnekleri Potter-Elvehjem cam tüpünde homojenize edildi ve 10 cilt homojenizasyon tamponunda buz üzerinde pestle edildi. Sinaptozom hazırlığı için homojenat önce yavaş bir hızda, daha sonra ham sinaptozomal mitokondriyal fraksiyon elde etmek için daha yüksek bir hızda döndürüldü. Bu ham fraksiyondan zenginleştirilmiş sinaptozomlar, süreksiz bir sakkaroz gradyanını takiben elde edildi.Sinaptoneurosomal preparat için homojenatlar sırayla iki 100 mikron ve bir 5 mikron filtreden geçirildi. Protein tahmini Bradford reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi ve numuneler Krebs tamponunda mL protein başına iki ila üç miligram konsantrasyonda 50 mikrolitrelik son hacimde seyreltildi. Sinaptozomlar veya sinaptoneurozomlar olmak üzere izole sinaptik terminallerin uyarılması, 37 derecede hücre dışı potasyumda kısa bir 30 saniyelik bir artışla gerçekleştirildi.Bunun için, numunelere 15 milimolar nihai konsantrasyona bir azı dişi potasyum klorür eklendi. Homojenatlar uyarılmamış ve depolarize sinaptik parçalar% 2.5 glutaraldehit ile sabitlenmiştir, gerekli hacim % 25 glutaraldehit stok çözeltisi ilavesi ile. Numuneler oda sıcaklığında iki, üç dakika kukübe edilmiş.Fiksatif, 20.000 G'de santrifüjleme ile beş dakika boyunca çıkarıldı. Numuneler daha sonra oda sıcaklığında iki ila üç dakika boyunca mL sodyum borohidrit başına %0,1 Triton X-100 ve 1 mg içeren Krebs tamponunda resüspensyon ile permeabilizasyon için ilerlenmiştir. Permeabilizasyon tamponu santrifüjleme ile tekrar çıkarıldı ve pelet yüzeysel olarak Krebs tamponu ile yıkandı ve 500 mikro phalloidin birimine karşılık gelen 1X Alexa Fluor 647 phalloidin içeren Krebs tamponunda yeniden canlandı.Bağlamanın karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika devam etmesine izin verildi. Aşırı ilişkisiz phalloidin, beş dakika boyunca 20.000 G'de santrifüjleme ile numunelerden çıkarıldı ve peletler krebs tamponu ile yüzeysel olarak yıkandı ve sinaptozomların veya sinaptoneurozomların yüzdürücülüğünü korumak için 0.32 molar sakkaroz içeren Krebs tamponunda tekrar yeniden doğdu. Floresan falloidin bağlı numuneler, bir plaka okuyucuda florometrik okuma için 96 kuyu siyah plakasında dağıtıldı.Ekscitasyon ve emisyon dalga boyları sırasıyla 645 nanometre ve 670 nanometre olarak belirlendi. Her deney seti için Krebs tamponunda 0.32 molar sakkaroz içeren farklı miktarlarda Alexa Fluor 647 phalloidin dahil ettik. Yıkama adımları sırasında numune kayıplarını hesaba katmak için, numuneler siyahtan şeffaf 96 kuyu plakasına aktarıldı.Numunelerin yakalanması daha sonra 440 nanometrede incelendi. Floresan phalloidinin tutulması, numunelerdeki aktüan filamentlerin veya F-aktibant seviyelerinin miktarı ile doğru orantılıdır. 50 ila 200 mikrogram protein aralığında phalloidin bağlanmasının doğrusallığı gözlendi.İlkenin bir kanıtı olarak, Latrunculin A tarafından aktilin filamentlerinin farmakolojik bozulmasının yanı sıra KCl aracılı izole sinaptik terminallerin uyarılması ile F-aktilin oluşumunun uyarılması kullanılarak F-aktilin depolimerizasyon modellerinde testimizin etkinliğini de test ettik. Bağlı phalloidinden kaynaklanan floresan emisyonu, standart doğrusal eğriden üretilen bağlı phalloidin birimleri olarak ifade edilebilir ve kontrol örneklerine göredir. Şekil 4 için F-actin düzeyleri bağlı phalloidin mikro birimleri olarak ifade edilir.Öte yandan, Şekil 5 için depolarize sinaptik parçalardaki F-actin seviyeleri, bozulmamış örnekleri kontrole göre ifade edilir. Aktüen filamentlerin veya F-actin'in analizi için sağlam, zaman verimli ve yüksek verimli bir test ve 96 kuyu plakası formatına uygun fizyolojik ve patofizyolojik durumlardaki değişikliklerini açıklıyoruz. Test, mevcut alternatif protokollerden çok daha hızlıdır ve tek başına veya mevcut immünhistokimya ve Batı şişkinliği bazlı tahlillerle birlikte aktüen ile ilgili çalışmalarda önemli bir araç olarak hizmet edebilir.

a-time-efficient-fluorescence-spectroscopy-based-assay-for-evaluating

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, mikroskopi için sıçan kortikal nöronlarının floresan olarak boyanması prosedürünü göstermektedir. Yapısal bütünlüğü analiz etmek ve nöronal fonksiyon ve sağlığı incelemek için çok önemli olan F-aktin yoğunluğunu hesaplamak için F-aktin ve dendritik proteinleri hedefler.

Sıçan Kortikal Nöronlarında Filamentli Aktin Punktasının Miktar Tayini

Filamentli aktin (F-aktin), spinogenez, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilitede önemli bir rol oynar. F-aktin punkta'nın miktar tayini bu nedenle sinaptik yapıların bütünlüğünü incelemek için yararlı bir araçtır. Bu protokol, düşük yoğunluklu primer kortikal nöronal kültürlerde Phalloidin ile etiketlenmiş F-aktin punktasının miktar tayini prosedürlerini açıklar.

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Sunulan işte kültür için değiştirilmiş silindir tüp yöntemi ve hassas photoetched coverslips üzerinde yeniden konumlandırma ile birçok hafta boyunca zaman zaman yüksek çözünürlüklü görüntüleme kemirgen beynin dilimler. Nöronal canlılığı ve dilim Morfoloji korunur. Sağlanan virüsler hücre tipi için belirli ifade kullanarak bu tamamen kapalı sistem uygulamaları.

Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Bir prosedür protein kinaz görselleştirmek için sunulmuştur baş-sabit, davranan fareler bir aktivite. Gelişmiş A-kinaz aktivite muhabiri, tAKARα, kortikal nöronlar içinde ifade edilir ve kafatası penceresinden görüntüleme için erişilebilir hale gelmiştir. İki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, uygulanan lokomotif sırasında PKA etkinliklerini görselleştirmek için kullanılır.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Burada, İmmünohistokimya ve yüksek çözünürlüklü beyin bölgelerinin proteinleri için tarama ile birlikte yakın kızılötesi boyalar kullanan bir protokol sunuyoruz.

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Öğrenin, kemirgen ve insan beyin dokularında aktin polimerizasyonunu floresan spektroskopi ile hızlıca ölçmek için yüksek verimli bir yöntem. Bu teknik, sinaptik plastisite ve nöropatolojik araştırmalarda F-aktin düzeylerini doğrudan nicelendirir.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil (Video) | JoVE Journal

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Daha fazla video keşfet