Kriyojenik Olarak Korunmuş Hücrelerden Kriyo-Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobik Veri Toplama

Bu yöntem, hücresel yapıları tam olarak tanımlamak için tüm biyolojik hücrelerde süper çözünürlüklü kriyo görüntülemeyi mümkün kılar. Korelatif görüntüleme iş akışının bir parçası olarak diğer yöntemlerle birlikte de kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajları, süper çözünürlüklü görüntülemenin kriyojenik koşullarda geleneksel floroforlar ve nispeten düşük ışık dozları kullanılarak hızlı bir şekilde yapılabilmesidir.

CyroSIM, iç veya dış ipuçlarına yanıt olarak hücresel ultrayapı dinamiklerini anlamaya yönelik içgörü sağlayan güçlü bir araçtır. Uygulaması aşı üretimi ve piyasaya sürülmesi, kalite kontrol, piyasa sonrası gözetim, antikor mühendisliği ve optimizasyonun yanı sıra nano parçacık karakterizasyonunu içerir. Kriyo aşamasındaki manevra numuneleri, ızgaranın güvenliğini sağlamak için pratik gerektirir.

Veri toplamadan önce Kokpit penceresindeki kontrollere aşina olmak da en iyisidir. Başlamak için, kapağı kriyo-aşamanın dış Dewar'ından çıkarın ve yaklaşık dörtte biri dolana kadar filtrelenmiş sıvı nitrojen dökün. Daha fazla dökmeden önce ilk kaynama geçene kadar bekleyin ve kabı yaklaşık üçte iki doluya doldurun.

Kapağı dikkatlice değiştirin, sıvı nitrojen kaynarken nozüleyi işleyiciden uzağa yönlendirin. Sıvı nitrojen çıkıştan çıkmaya son verdiğinde, çıkış borusunu sahne dewar'ın üzerine kriyo sahnesinde yerleştirin. Güç kaynağını takın, USB kablosunu bağlayın ve harici Dewar'ı sahne alanına takın.

Sıvı nitrojenin teslim edildikten sonra, numune odasına girmesini sağlamak için kriyo aşamasındaki serbest bırakma düğmesine basın ve görüntü alımına başlamadan önce sistemin soğuması ve stabilize olması için 30 ila 45 dakika bekleyin. Örnek aktarım kasetinin iki plakasını açmak için kaset aracındaki onaltılık anahtarı kullanın. Plakaları ızgarayı iki plaka arasına bırakacak kadar geniş açın, ancak maksimum konuma açmayın.

Numune ızgara kutusunu sıvı nitrojenden çıkarmak için uzun uzun tokmaklar kullanın. Çentiği sahne alanının içindeki depolama konumuna hiza olacak şekilde çevirin ve sahne alanına yerleştirin. Saklama kutusu kapağını doğru numune konumuna açmak için uygun cihazı kullanın.

Ters kümesleri kullanarak, TEM ızgarasını numune tutucudan çıkarın, sıvı nitrojenin içine daldırarak karbon film tarafının yerleştirilmesini sağlayın, böylece sonuçta numune köprüsündeki hedefe bakacak ve numune transfer kasetinde konuma düşürecektir. Kaset aracındaki onaltılık anahtarı kullanarak örnek kartuşu kapatın. Izgarayı içeren kartuşu kaldırmak ve örnek köprüye monte etmek için kaset aracındaki mıknatıs noktasını kullanın.

Sıvı nitrojene dalmış veya yakın ve uygun yönde tutun. Kaseti köprünün konumlandırma pimlerinin içine düz yerleştirin ve sabit olduğundan emin olmak için hafifçe itelayın. Kalan örneklerle birlikte depolama kutusunu kapatın ve çıkarın.

Kriyo-sahne kapağı açıklığını görüntüleme konumuna getirin ve numune odası ışığını kapatın. Sahneyi objektif mercek altına hizalamak için optiklere doğru kaydırın, ardından kolu kullanarak hedefi yavaşça pozisyona bırakın, kriyo-sahnenin kapağında kalmasını sağlayın, ancak dokunmaz. Sahneyi ve optikleri opak siyah bir perde ile örtün, ardından cryoSIM PC'de kontrol yazılımı Cockpit'i başlatın. Her kamera için okuma modu düğmesine tıklayın ve CONV3 megahertz olarak ayarlayın.

Her kameranın sıcaklığının 80 santigrat derece olup olmadığını ve kamera fanının kapalı olup olmadığını kontrol edin. Yansıyan kamerayı ışık altında açın, ortam ve linkam altında seçin, kondenseri kontrol edin ve ardından video modu düğmesine tıklayın. Mozaik görünümü penceresinde, ızgara anahattını görmek için uzaklaştırın.

Görülemiyorsa Sahne Alanı Bul'u tıklatın ve dairenin ortasına çift sol tıklayarak ızgarayı ortala. Izgara destek filmi veya başka bir ilgili özellik odakta olana kadar örneği odaklamak için yukarı ve aşağı tuşlarını kullanın. Z adımını değiştirmek için sayısal peddeki dokuz ve üç tuşu kullanın.

Sahne alanı ortalandıktan sonra video modunu kapatın. Merkezden dışarı doğru sarmal görünür ışık görüntülerinin karolarını üretmek için mozaik görünümünde Mozaik Çalıştır'a tıklayarak görünür bir ışık mozaiği toplayın. Mozaiği Kaydet'e tıklayarak görünümü kaydedin.

Ortam ışığını ve kondenserini ve video modunu kapatarak önceki floresan harita görüntülerinin yanı sıra Parlak alan mozaiği de inceleyin, ardından gerekli heyecan lazerini açın ve başlangıçta 50 milisaniye pozlama süresi için 50 miliwatt'ta ilgili kamera ve filtreyi seçin. Görüntüyü ve yıldızı otomatik kontrasta tutturmak için sıfıra basın. Alternatif olarak, görüntünün altındaki kaydırıcıyı kullanarak kontrastı manuel olarak ayarlayın.

Uygun floresan içeren biyolojik olarak ilginç hücreler bulunduktan sonra, Mozaik görünümündeki işaret alanı düğmesini kullanarak konumlarını işaretleyin. Görüntü alımına başlamadan önce tüm olası siteleri işaretlemeye devam edin. Dosyalamak için siteleri kaydet'e tıklayarak mozaiği işaretli sitelerle yeniden kaydedin.

StitchEm yazılımını kullanarak mozaik görüntüyü dikmek için, metin mozaik dosyasını BAT uzantılı stitchEm dosyasına sürükleyip bırakın ve mozaik döşemelerin birleşik TIF görüntüsünü aynı klasöre kaydedin. Bir görüntüyü işaretli sitelerle kaydetmek için mozaik metin dosyasını ve işaretleyiciler metin dosyasını aynı anda simgeye sürükleyip bırakın. Kamera görünümü penceresinin altındaki floresan görüntüdeki sayımlara ve dinamik aralığa göre lazer pozlama süresini ayarlayın.

Hangi filtrenin uygulanacağını seçin ve kullanılacak her bir heyecan ışığı dalga boyu için ayarları optimize edin ve her lazeri ayrı ayrı açın. Açmak için her iki kameraya da tıklayın. İşaretli sitelerden birine dönün ve tekrar istediğiniz derinliğe odaklanın.

İlgi çekici bir alana odaklandıktan sonra, elde etmek için Z yığınının yüksekliğini seçmek için makro aşamasındaki XY penceresindeki yukarı ok tuşunu kullanarak odağın dışına çıkın ve Üstten kaydet'e tıklayın. Aşağı ok tuşunu kullanarak odağın dışına çıkın, Aşağıyı kaydet'e tıklayın, sonra Ortaya git'e gidin'de görüntünün hala odakta olduğunu doğrulayın. Kokpit penceresinde Tek siteli deneme'yi seçin.

Açılan listeden Yapılandırılmış Aydınlatma'yı seçin. Yığın yüksekliğini Z yüksekliğine ve bir mikro metreye eşit olacak şekilde değiştirin. Yansıyan kamera için üst sıradaki 405 ve 488 nanometre lazerler için pozlama sürelerini milisaniyeler içinde, iletilen kamera için alt sıradaki 561 ve 647 nanometre lazerlerin pozlama sürelerini girin.

Bir dosya adı girin ve önceki dosyaları geçersiz kılmadan tarih ve saati içeren yeni bir dosya oluşturmak için güncelleştirmeyi tıklatın, sonra Başlat'ı tıklatın. Sıvı nitrojen Dewar görüntü alımı sırasında kriyo aşamasını doldurursa, Kokpit yazılımındaki İPTAL düğmesine tıklayarak işlemi iptal edin. Her pozisyonda, lazerleri kapatarak ve ortam ışığını ve kondenserini açarak görünür ışığı kullanarak bir Z yığını toplayın.

Tek siteli deneme altında, Z yığınını seçin ve ortam ışığını Z yüksekliğini koruyarak 20 milisaniye pozlama olarak ayarlayın. İşaretli tüm siteler için bu işlemi yineleyin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra sahneyi çıkarın ve tüm örnekleri çıkarın.

Numune odası ışığını kapatın. Harici Dewar'ı çıkarın ve kalan sıvı nitrojeni başka bir kriyo uyumlu kaba çıkarın, böylece Dewar güvenli bir şekilde normal sıcaklığa geri dönebilir. Dewar sahnesinde daha fazla sıvı nitrojen kalmadıktan sonra kriyo-sahne ekranını pişirme seçeneği kullanıma sunulana kadar bekleyin.

Isıtma moduna girmek için fırın düğmesine basın. Kapak fişini kriyo sahnesine takın. CryoSIM'deki çözünürlük, standart epifluoresans mikroskopisündekinden önemli ölçüde daha yüksektir.

Geleneksel bir epifluoresans mikroskobundan floresan haritası, görüntüleme için ilgi çekici alanları bulmak için kullanılabilir ve ilgili cryoSIM görüntüsü ızgaradaki bir konumdan elde edilebilir. U2OS hücrelerini içeren bir örnek, yeşil mikrotübül sitoskeleton boyası ve kırmızı mitokondri boyası karışımı ile boyandı ve bu da sitoskeleton ve mitokondrilerin mikrotübül bileşeninin lekelenmesiyle sonuçlandı. Daha sonraki görüntüleme, hücre içindeki mitokondrilerin lokalizasyonunu ve mikrotübüllerin düzenlenmesini gösterdi ve hücreye sağladıkları yapısal çerçeveyi ve sitoskeletonun organellerin etrafındaki montajını vurguladı.

SIM rekonstrüksiyon süreci, ücretsiz bir imageJ eklentisi olan SIMCheck kullanılarak tanımlanabilecek eserler üretebilir. SIMCheck kullanılarak oluşturulan bu modülasyon kontrastı haritası, çekirdek alanı içindeki düşük modülasyon kontrastı alanlarını gösterir ve bu bölgenin yeniden yapılanma yapıtlarına daha duyarlı olacağını gösterir. Beyaz ok yeniden yapılandırma yapıtını gösterir.

Bu protokol denenirken, de vitrifikasyonu önlemek için numunenin her zaman su altında veya sıvı nitrojene yakın kalmasını sağlayın. Ayrıca, veri kalitesini etkilediği ve numunenin lazerle zarar görmesini önleyemediğinden, dinamik aralıktaki maruz kalma sürelerine ve sayılarına dikkat edin. Kriyo görüntülemeden sonra, aynı örnekler B24 Beamline'da bulunan kriyo-yumuşak x-ışını tomografisi gibi diğer yöntemlerle de görüntülenebilir.

CryoSIM görüntülerini hücre hakkında yapısal bilgiler içeren görüntülerle birleştirerek, hücresel ultrayapı ve işlevle ilgili önemli ek soruları yanıtlayabiliriz.