SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Bu protokoller, iki renkli bir ddPCR sistemi kullanarak SARS-CoV-2'nin tespiti için şirket içi multipleks ddPCR testleri geliştirmek için kullanılabilir. Bu, SARS-CoV-2 ve diğer patojenlerin tespiti için kendi kitlerini geliştirmek isteyen insanlar için yararlıdır. Altın standart RT-qPCR ile karşılaştırıldığında, RT-ddPCR, standart bir eğriye ihtiyaç duymadan çoklu SARS-CoV-2 genlerini ölçmek için kullanılabilir.

ddPCR gelişmekte olan bir teknik olduğundan, mevcut ve gelecekteki kullanıcıların SARS-CoV-2 tespiti ve diğer patojenler için multipleks tahlilleri anlamalarına ve kolayca geliştirmelerine yardımcı olmak için görsel gösterim önemlidir. cDNA sentezi için, iki mikrolitre 5X ters transkripsiyon ana karışımı, ilgilenilen RNA örneğinin beş mikrolitresi ve üç mikrolitre RNaz içermeyen çift damıtılmış suyu, çözelti olarak 10 mikrolitrelik bir son hacme 10 mikrolitrelik bir PCR tüpüne ekleyin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Reaktifler eklendiğinde, numuneyi bir termal döngüleyiciye yükleyin ve cihazı 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede ters transkripsiyon, 85 santigrat derecede 5 saniye boyunca ters transkripsiyonun ısıl inaktivasyonu ve dört santigrat derecede son sonsuz tutma çalıştıracak şekilde ayarlayın.

Damlacık dijital PCR yapmadan önce, nükleaz içermeyen 96 delikli damlacık dijital PCR plakasının uygun sayıda kuyucuğuna 19,8 mikrolitre taze hazırlanmış ana karışım ekleyin. Ana karışımın her bir kuyucuğuna, kuyu başına 22 mikrolitre reaksiyon karışımının son hacmine 2.2 mikrolitre cDNA ekleyin ve plakayı tek kullanımlık bir PCR plaka sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Ardından, plakanın altındaki kuyu içeriğini toplamak için plakayı 15 ila 30 saniye boyunca santrifüjde 10 ila 15 saniye boyunca vorteks edin.

Otomatik damlacık oluşturucu dokunmatik ekranında otomatik damlacık üretimi için numune plakasını yapılandır'a tıklayın ve numunelerin numune plakasında bulunduğu sütunları seçin. Tamam'a tıklayın ve otomatik damlacık jeneratörü kapağını açın. Numune ve damlacık üretim plakalarını ve deney için gerekli diğer malzemeleri cihaz içindeki ilgili yerlere yükleyin ve kapıyı kapatın.

Dokunmatik ekran yeşile döndüğünde, tüm malzemelerin doğru konumlarına yüklendiğini gösterir, problar için yağ seçin ve damlacık oluşumunu başlatın. Damlacık üretiminin ekranda belirtilen süreye göre tamamlanmasını bekleyin. Ekran Damlacıklar hazır dediğinde, damlacıkları içeren plakayı çıkarmak için kapıyı açın ve plakayı delinebilir bir folyo contasıyla kapatmak için 180 santigrat derecede beş saniye boyunca bir plaka mühürleyici kullanın.

Damlacık oluşumundan sonraki 30 dakika içinde, kapalı damlacık plakasını 96 derin kuyulu bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Numune hacmini 40 mikrolitreye ve kapak sıcaklığını 105 santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra, PCR damlacıkları yükseltir.

Damlacık okuması için, amplifikasyondan sonra, termal döngülü 96 delikli plakayı bir damlacık okuyucuya aktarın ve beraberindeki yazılımı damlacık okuyucuya bağlı bir bilgisayarda açın. Kurulum modundan Yeni'yi seçin ve kuyu düzenleyici iletişim kutusunu açmak için herhangi bir kuyucuğa çift tıklayın. Okunacak kuyucukları seçin ve deneyi mutlak nicelemeye, süpermiksi damlacık dijital PCR süpermiksine problar için ayarlayın.

Bir türü bilinmeyen kanal 1'e ve iki türü bilinmeyen kanal 2'ye hedefleyin. Örnek adları plaka düzenine göre atayın ve uygula ve tamam'ı tıklatın. Şablonu kaydettikten sonra Çalıştır'ı tıklatın.

Yazılım tarafından istendiğinde, FAM/HEX rengini seçin. Veri toplamanın sonunda, plakayı okuyucudan çıkarın. Verileri analiz etmeden önce, toplam damlacık sayısını elde etmek için tüm kuyucuklardan gelen verileri kontrol edin.

Ve pozitif veya negatif sonuç olarak sayılacak minimum damlacık sayısını kabul etmek için bir kesim ayarlayın. Tek taraflı ve dubleks tahlil analizi için, analiz edilecek QLP dosyasına çift tıklayın ve Analiz Et'i seçin. Düğüm şablonu kontrolünü ve pozitif kontrol örneklerini kılavuz olarak kullanarak doğru kanaldaki her bir kuyu için pozitif ve negatif damlacıkları ayırt etmek için 1B genlik ve 2B genlik eşiği araçlarını kullanın.

Ardından, ek analiz için sonuçları CSV dosyası olarak dışa aktarın. Bir tripleks prob karışımı testi için, QLP dosyasını açın ve plaka düzenleyici sekmesinde analiz edilecek kuyucukları seçin. Deney türünü doğrudan nicelemeye ve testi tripleks karışımını araştırmak için ayarlayın ve hedef adı girin.

Ardından Uygula'yı tıklayın. Küme atamayı seç penceresi açılır pencere önerilerinin yönlendirdiği şekilde farklı hedef kümelere belirli renkler atamak için grafik araçlarını kullanın. Tüm hedef renkler atandığında, niceleme verileri kuyu verileri penceresinde görüntülenir.

Aşağı akış analizi için verileri CSV dosyası olarak dışa aktarın. Dörtlü bir tahlil için, deney türünü doğrudan nicelemeye ve tahlili genlik multipleksine ayarlayın. Hedef adını girin ve Uygula'yı tıklayın.

Küme atamayı seç penceresi açılır pencere önerilerinin yönlendirdiği şekilde farklı hedef kümelere belirli renkler atamak için grafik araçlarını kullanın. Tüm hedef renkler atandığında, niceleme verileri kuyu verileri penceresinde görüntülenir. Ek analiz için verileri CSV dosyası olarak dışa aktarın.

Bu temsili sıcaklık gradyanı analizinde gözlemlendiği gibi, daha yüksek diz çökme sıcaklıkları, dubleks bir tahlil yapıldığında pozitif damlacıkları negatif damlacıklardan açıkça ayırt edememiştir. Bununla birlikte, diz çökme sıcaklığındaki bir düşüşle, pozitif ve negatif damlacıklar arasında optimal bir ayrım sağlanmıştır. İki renkli RT damlacık dijital PCR algılama sistemi kullanarak, tek bir numune içinde bir, iki, üç ve dört SARS-CoV-2 hedefini tespit etmek mümkündür.

Şablonsuz bir kontrol örneği, simpleks tahlillerinde negatif eşiğin ayarlanmasına yardımcı olmak üzere negatif damlacıkları bulmak için kullanılabilir. Dubleks tahlillerde, analiz bireysel kanallarda veya 2D genliğinde gerçekleştirilebilir. Her ne kadar daha yüksek mertebeden multipleks tahlil veri analizi basit olmasa da, bu tahliller yararlıdır, çünkü tripleks prob karışımı tahlillerinde sekiz damlacık kümesine ve dörtlü genliğe dayalı analizler için 16 damlacık kümesine kadar değerlendirilmesine izin verirler.

Geliştirilecek tahlile bağlı olarak, ana karışıma doğru hedef astar ve prob konsantrasyonlarının eklendiğinden emin olun. Bu prosedürü kullanarak, yeni RT-ddPCR testleri geliştirmek için hedefler değiştirilebilir. Bu tahliller farklı araştırma amaçları için veya ortaya çıkan bulaşıcı hastalıkların teşhisi için kullanılabilir.

Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, farklı standartlarda, insan vücudunda ve çevresel örneklerde viral nükleik asit kopyalarının doğru bir şekilde belirlenmesi için kullanılmıştır.