Name: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden retinal organoid üretim protokolünü. Fotoreseptör prekürsör verimini artıran bu yöntem, retinal hastalık modellemesi ve hücre nakli için ölçeklenebilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

502 laboratuvarı üyelerine makaleyle ilgili teknik destekleri ve yararlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Pekin Belediyesi Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014) ve Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2017YFA0105300) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma Capital Medical Üniversitesi, Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. H9 hESC'ler WiCell Araştırma Enstitüsü'nden elde edildi ve genetik olarak tdTomato etiketli hücre hattına göre tasarlandı.
1. İnsan RO'larının üretimi
<ol><li>hESC'leri besleyicisiz koşullar altında kültürleyin.<ol><li>6 delikli bir plakanın bir oluğunu, üreticinin talimatlarını izleyerek en az yarım saat boyunca 37 ° C'de 1 mL 0.1 mg / mL reaktif A (Malzeme Tablosu) ile kaplayın. 1x106 hESC'lik bir aliquot'u çözün. NOT: 3 mL önceden ısıtılmış reaktif B (Malzeme Tablosu) hazırlayın ve kriyokorunmuş hücreleri (1 mL) 3 mL taze ortama aktarın. hESC'leri tek hücrelere pipetlemeyin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.</li>
		<li>Hücreleri 2 mL reaktif B ile reaktif A kaplı plakaya tohumlayın ve günde 2 mL reaktif B'yi değiştirin. Pasaj hücreleri yaklaşık% 80 akıcılığa ulaştığında (genellikle yaklaşık 4 gün).</li>
	</ol></li>
	<li>0. Gün<ol><li>hESC'leri ortam I kullanarak tek hücreli bir süspansiyonla ayırın (Tablo 1). Aşağıdakileri karıştırarak ortam I hazırlayın: %20 (v/v) Nakavt serum replasmanı (KSR), 0,1 mM MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (NEAA), 1 mM piruvat,3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL COCO, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin (PS), 0,1 mM β-merkaptoetanol ve Glasgow's Eagle'ın minimal esansiyel besiyeri (GMEM). NOT: Ayrışmaya başlamadan önce, ortam I hazırlayın ve 20 μM Y-27632 ile 12 mL ortam I'i 10 cm'lik bir Petri kabına, 0,05 mg/mL reaktif D (Malzeme Tablosu) içeren 500 μL reaktif C'ye (Malzeme Tablosu) ve 1,5 mL'lik bir tüpte 20 μM Y-27632'ye aktarın. Yukarıdaki adımları karanlıkta gerçekleştirin, çünkü ortam I'deki IWR1e bileşeni ışığa duyarlıdır.</li>
		<li>hESC'leri önceden ısıtılmış 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) tamponuyla yıkayın.</li>
		<li>Hazırlanan 500 μL reaktifi (1,5 mL) tüpe ekleyin ve hESC'leri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3,5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Plakanın yan ve alt kısmını birkaç saniye boyunca hareket ettirerek hücreleri ayırın ve Petri kabından hESC plakasına 500 μL hazırlanmış ortam I ekleyin. NOT: 900 μL 1x DPBS içeren 1,5 mL'lik bir tüp hazırlayın ve hücre sayımı için bir hemositometre kullanın.</li>
		<li>Hücreleri yeni bir 1,5 mL tüpte toplayın ve hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından tüpten 100 μL çıkarın ve ardından hücre sayımı için 900 μL DPBS ile tüpe ekleyin.</li>
		<li>Sol 900 μL hücre süspansiyonunu dağıtın ve ardından Petri kabında hazırlanan ortam I ile hücreleri 9 x 104 hücre / mL'ye seyreltin. NOT: Ortamın tüm hacmi 12 mL'dir; Toplamda 1.08 x 106 hücre gereklidir.</li>
		<li>Yapışmayan, V tabanlı, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin (Malzeme Tablosu). NOT: Süreyi kısaltmak ve her bir kuyucuğun eşdeğer bir hücre numarası içerdiğinden emin olmak için çok kanallı bir pipet kullanın. 100 μL porsiyonları çıkarmadan önce Petri kabını her seferinde çalkalayın. Hücrelerin eşit olarak dağılmış olması önemlidir.</li>
		<li>96 delikli plakayı düşük hızlı bir çalkalayıcıda 5 dakika boyunca hafifçe döndürün ve ardından 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de inkübeedin. NOT: Plakayı karanlıkta tutun. Günü 0. gün olarak ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün<ol><li>% 1 reaktif A (Malzeme Tablosu) ekleyin. 2 mL orta I'e 133.4 μL reaktif A ekleyerek reaktif A'yı (10 mg / mL'lik protein konsantrasyonu) hazırlayın. NOT: Tam ve düzgün eritme elde etmek için kullanmadan önce A reaktifini gece boyunca 4 ° C'de tutun. Lütfen ürün bilgilerine dikkat edin ve her bir reaktif A şişesi farklı bir protein konsantrasyonunda olduğu için A reaktifinin protein konsantrasyonuna sahip olmak için şirketin resmi web sitesindeki katalog numarasını ve lot numarasını arayın. Protein konsantrasyonu düşükse, artan miktarda reaktif A yardımcı olacaktır.</li>
		<li>Her bir oyuğa 20 μL hazırlanmış reaktif A ekleyin ve ölü hücreleri dağıtmak için merkezde iki kez pipet ekleyin. NOT: A reaktifini ve 96 delikli plakayı serin koşullar altında saklayın ve buz üzerindeki tüm adımları tamamlayın. Plakayı karanlıkta yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Gün 2-12<ol><li>96 delikli plakanın tabanını temizleyin ve 6. güne kadar 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. 6. günde, her bir kuyucuktan ortamın 58 μL'sini çıkararak ve 60 μL ortam I ekleyerek ortamın yarısını değiştirin. NOT: Yarım ortam değişimini tamamlamak için çok kanallı pipet kullanın. Kuyudan hiçbir hücre peletinin çıkarılmadığından emin olmak için bu adımı nazikçe uygulayın. Ortamı temiz bir 10 cm Petri kabına aspire edin. İçinde hücre peletleri varsa, bunları 96 kuyucuklu plakaya geri ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>12- 18. Gün<ol><li>12. günde ortamı orta II'ye değiştirin (Tablo 1). Aşağıdakileri karıştırarak %1 (v/v) reaktif A kullanarak II. Maddeyi hazırlayın: %10 fetal sığır serumu (FBS), 0.1 mM NEAA, 1 mM piruvat, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 100 nM SAG dihidroklorür ve GMEM. Serin ve karanlık koşullar altında saklayın.</li>
		<li>Hücre peletlerini 96 delikli plakadan 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın ve peletlerin oda sıcaklığında 5 dakika boyunca doğal olarak yerleşmesine izin verin. NOT: Kabarcıkları önlemek için ortamı ve peletleri yüzeyin altından yavaşça çıkarın.</li>
		<li>Organoidlerle ilgilenirken süpernatantı çıkarın. Hücre agregalarını, reaktif A ile 18 mL hazırlanmış ortam II içeren 10 cm'lik bir süspansiyon kabına aktarın. NOT: Hazırlanan ortam II'yi 10 cm'lik kaba önceden eklemeyin, çünkü A reaktifi 4 °C'de olmalıdır.</li>
		<li>18. güne kadar 37 °C'de ve %5 CO2'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>18. günden itibaren<ol><li>Ortamı orta III olarak değiştirin (Tablo 1). Aşağıdakileri karıştırarak karanlık koşullar altında ortam III'ü hazırlayın:% 10 FBS, 1xsupplement 1, 0.5 μM retinoik asit (RA), 100 μM taurin, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve 1: 1 Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM) / besin karışımı F-12 karışımı.</li>
		<li>18. günde, yarı saydam bir optik vezikül oluşturulduğunda, organoidleri mikrocerrahi bir bıçak kullanarak kesin. NOT: Organoidi, genellikle dört parçaya, orta II'li bir Petri kabında parçalayın. Her parça sonraki haftalarda sağlam bir optik kaba dönüşmelidir.</li>
		<li>Tüm peletleri yemeğin merkezine toplayın. Hücreleri 15 mL'lik bir konik şahin tüpüne toplayın ve doğal yerleşmeye izin verin. Sonra süpernatanı yavaşça çıkarın. NOT: Organoidler, boyutlarından dolayı, Petri kabını yatay bir düzlemde birkaç kez 90° için bir yönde döndürerek merkezde toplanabilir.</li>
		<li>Peletleri, çanak başına 18 mL orta III ile iki adet 10 cm Petri kabına askıya alın ve dağıtın ve hücre kümelenmesini önlemek için bulaşıkları yavaşça inkübatöre aktarın. Orta III'te 37 °C ve% 5 CO2'de kültürlemeye devam edin ve ortayı haftalık olarak değiştirin. CRX, 45. günden sonra ve 120. güne kadar, fotoreseptörün dış segmentini tespit edebildik.</li>
	</ol></li>
</ol>2. İnsan RO'larını analiz etmek
<ol><li>FACS analizi<ol><li>Kesilmiş 1 mL uçları kullanarak bulaşıklardan üç CRX-tdDomates ve üç H9 ES türevi organoid monte edin. Organoidleri 1 mL önceden ısıtılmış (oda sıcaklığında) DPBS ile yıkayın.</li>
		<li>% 0.25 tripsin-EDTA Çözeltisini 0.05 mg / mL reaktif D ile karıştırarak sindirim tamponunu hazırlayın.</li>
		<li>Hazırlanan sindirim tamponunu 37 ° C'de 8 dakika boyunca kullanarak organoidleri tek hücrelere ayırın. Daha sonra reaksiyonu inaktive etmek için% 10 FBS ve 0.05 mg / mL reaktif D ile aynı hacimde DPBS ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri hafifçe askıya alın ve dağıtın ve ardından 100 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak filtreleyin ve CRX-tdDomates pozitif sinyallerini analiz etmek için 561 nm uyarma lazer hattında ve 780/60 filtrede bir Floresan Aktive Edilmiş Hücre Sıralama (FACS) sistemi kullanın. NOT: CRX başlangıçta 45. günde ifade eder ve organoidlerin olgunlaşmasıyla artar. Her test için on bin hücre kullanılır, her zaman noktası için en az üç tekrar tamamlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>RO'ların floresan yoğunluk ölçümü<ol><li>Canlı organoidleri görüntüleme için rastgele hazırlayın. NOT: Parametreleri ayarlayın ve tüm floresan yoğunluk monitörleri için aynı filtreleri ve parametreleri kullanın.</li>
		<li>Görüntüleri yakalayın ve uygun yazılımı (örneğin, ImageJ) kullanarak ortalama floresan yoğunluğunu analiz edin.</li>
		<li>Görüntüleri içe aktarın ve ardından Görüntü | kullanarak 8 bit'e dönüştürün Türü.</li>
		<li>Image | varsayılan parametreleri kullanarak eşiği ayarlama | ayarlama Eşik.</li>
		<li>Ölçülen alanı belirleyin ve ardından Çözümle | kullanarak gri değeri değerlendirin Ölçün. NOT: Sonuç panelindeki ortalama değerler, ölçülen alanın ortalama floresan yoğunluğudur.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247(2020).</li>
<li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).</li>
<li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286(2015).</li>
</ol>

Retinal organoid farklılaşması, bol fonksiyonel retina hücrelerinin oluşumu için arzu edilen bir yöntemdir. RO, pluripotent kök hücreler tarafından nöral retinaya doğru üretilen gangliyon hücreleri, bipolar hücreler ve fotoreseptörler gibi farklı retinal hücrelerin bir bileşimidir 4,5,8,9. Akıcı RO'lar hasat edilebilse de, uzun kültürleme süreleri (180 güne kadar) gerektirebilecek zaman alıcıdı...

Pluripotent kök hücreler (PSC'ler), kendilerini yenilemeleri ve her türlü somatik hücreye farklılaşma yetenekleri ile karakterize edilir. Böylece, PSC'lerden türetilen organoidler, rejeneratif tıp araştırmalarında önemli bir kaynak haline gelmiştir. Retina dejenerasyonu, fotoreseptörlerin (çubuklar ve koniler) ve retinal pigment epitelinin kaybı ile karakterizedir. Retinal hücre replasmanı bu hastalık için cesaret verici bir tedavi olabilir. Bununla birlikte, hastalık araştırması ve tedavisi için insan retinası elde etmek mümkün değildir. Bu nedenle, çok katmanlı doğal retina hücrelerini etkili ve başarılı bir şekilde özetleyen PSC'lerden türetilen retinal organoidler (RO'lar), temel ve translasyonel araştırmalar için faydalıdır 1,2,3. Araştırmamız, retinal dejenerasyonu incelemek için yeterli ve kaliteli hücreler sağlamak için RO farklılaşmasına odaklanmaktadır4.
RO'ları farklılaştırma yöntemleri, 2012 yılında Sasai laboratuvarı tarafından öncülük edilen üç boyutlu (3D) süspansiyon farklılaşması ile sürekli olarak ortaya çıkmaktadır5. Fotoreseptör öncü hücrelerini özel olarak izlemek için insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) CRX-tdDomates etiketini tanıttık ve Wnt, TGF-β ve BMP yollarının6 çok işlevli bir antagonisti olan COCO'nun eklenmesiyle yöntemi değiştirdik. COCO'nun fotoreseptör öncüllerinin ve konilerinin farklılaşma verimliliğini etkili bir şekilde arttırdığı gösterilmiştir 6,7.
Toplamda, klasik farklılaşma yöntemini değiştirerek, laboratuvar araştırmaları yoluyla fotoreseptörlerle ilişkili retina hastalığını analiz etmek ve daha ileri klinik uygulama / transplantasyon için insan RO'larından bol miktarda fotoreseptör öncülleri ve konileri toplamak için erişilebilir bir protokol geliştirdik.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>COCO</td><td>R& D Systems</td><td>3047-CC-050</td><td>DAN Domain BMP antagonistleri ailesi</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS), İnsan Embriyonik Kök Hücreleri için Nitelikli</td><td>Biyolojik Endüstri</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Değiştirme-Çok Türlü</td><td>Gibco</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)</td><td>sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Kalem Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primesurface 96 V-plaka</td><td>Sbio</td><td>MS9096SZ</td><td>1.2.7 Pirüvatta hücre agregasyonu</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif A</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel 1.1.1</td></tr><tr><td>Reaktif B</td><td>Kök Hücre</td><td>5990</td><td>mTeSR-E8, 1.1.2</td></tr><tr><td>Reaktif C</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>TrypLE Express 1.2</td></tr><tr><td>Reaktif D</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>DNase I, 1.2</td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Sigma</td><td>R2625-100MG</td> <td>içinde</td></tr><tr><td>SAG</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>ALX-270-426-M001</td><td></td></tr><tr><td>Ek 1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502-048</td><td>N-2 Takviyesi (100X), Sıvı, medum III'te supplemet</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>organoidlerin ayrışması 2.1.3</td></tr><tr><td>Wnt Antagonisti I, IWR-1-endo - Calbiochem'de</td> ayrışma<td>Sigma</td><td>681669</td><td>Wnt inhibitörü</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan pluripotent kök hücrelerinden retinal organoidlerin yönlendirilmiş İndüksiyonu

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Retina hücre transplantasyonu, retina mimarisini geri yükleyebilen ve dejenere olmuş retinanın görsel yeteneklerini stabilize edebilen veya hatta geliştirebilen umut verici bir terapötik yaklaşımdır. Bununla birlikte, hücre replasman tedavisindeki ilerleme, şu anda yüksek kaliteli ve standartlaştırılmış insan retinalarının hazır bir kaynağına ihtiyaç duymanın zorluklarıyla karşı karşıyadır. Bu nedenle, deneyler için kolay ve kararlı bir protokole ihtiyaç vardır. Burada, eksojen moleküllerin ve reaktif A'nın yanı sıra üç boyutlu insan retina organoidlerini (RO) üretmek için manuel eksizyonun kullanıldığı kendi kendini organize eden bir yönteme dayanan optimize edilmiş bir protokol geliştiriyoruz. İnsan Pluripotent Kök Hücreleri (PSC'ler) kaynaklı RO, fotoreseptörler için spesifik belirteçleri ifade eder. Çok fonksiyonlu bir antagonist olan COCO'nun eklenmesiyle, fotoreseptör öncüllerinin ve konilerinin farklılaşma etkinliği önemli ölçüde artar. Hücre hatlarının ve birincil hücrelerin faydalarına sahip olan ve ikincisiyle ilişkili kaynak sorunları olmadan bu sistemin verimli kullanımı, özellikle fotoreseptörler olmak üzere akan retinal hücreler üretebilir. Bu nedenle, PSC'lerin RO'ya farklılaşması, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre nakli için optimal ve biyoilgili bir platform sağlar.

Şematik çizim, COCO ile öncü hücreleri geliştirmek için farklılaşma protokolünü göstermektedir (Şekil 1). PSC'den RO'lara kadar çok sayıda ayrıntı sonuç farklılıklarına neden olabilir. Tüm prosedürü izlemek için her adımın ve hatta her ortamın katalog numarasının ve lot numarasının kaydedilmesi önerilir.
Burada, 6, 12, 18 ve 45. günler için parlak alan görüntüleri sağlıyoruz (Şekil 2). 6. günde, organoidler genellikle 96 delikli bir p...

Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Bu retina hastalığı için bir modeldir ve in vivo retinayı taklit eder. Bir dereceye kadar, hayvan deneylerinin yerini alabilir. Protokol, retinal organoidlerdeki fotoreseptör öncüllerinin kalitesi ve miktarı için optimize edilmiştir ve fotoreseptör, birkaç geri dönüşümsüz körlük koşulunun anahtarıdır.İnsan embriyotik kök hücrelerini veya hESC'leri besleyicisiz koşullar altında kültürleyerek başlayın. Bunu yapmak için, altı delikli bir plakanın bir kuyuğunu mililitre reaktif A başına bir mililitre 100 mikrogram ile kaplayın ve plakayı en az yarım saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir milyon hESC'lik bir aliquot'u çözün ve beş dakika boyunca 200 xg'de santrifüj yapın.Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri önceden kaplanmış plakaya, iki mililitre reaktif B. ile birlikte tohumlayın.Yaklaşık dört günde yaklaşık% 80 akıcılığa ulaştıktan sonra hücreleri geçirin. Akıcılığa ulaştıktan sonra, hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın ve 500 mikrolitre taze hazırlanmış reaktife aktarın. Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 3,5 dakika inkübe edin.Plakanın yan ve alt kısımlarını birkaç saniye hareket ettirerek hücreleri ayırın ve 500 mikrolitre hazırlanmış orta olanı ekleyin. Ayrılan hücreleri 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe toplayın ve hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre sayımı için, 900 mikrolitre DPBS'ye 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.Kalan hücre süspansiyonunun 900 mikrolitresini, mililitre başına dokuz kez 10 ila dördüncü güç hücresi elde etmek için Petri kabındaki orta bir mikrolitre ile seyreltin. Yapışmayan, V tabanlı, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı beş dakika boyunca düşük hızlı bir çalkalayıcıda hafifçe döndürün ve ikinci güne kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.İkinci günde, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 20 mikrolitre% 1 reaktif A ekleyin ve ölü hücreleri dağıtmak için merkezde iki kez pipet ekleyin. Plakanın dibini altıncı güne kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe etmeden önce temizleyin. Altıncı günde, ortamın 58 mikrolitresini 60 mikrolitre taze ortamla değiştirin ve inkübasyona devam edin.12. günde, hücre peletlerini 96 kuyucuklu plakadan 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve peletlerin oda sıcaklığında beş dakika boyunca doğal olarak yerleşmesine izin verin. Peletler çöktüğünde, organoidleri rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve hücre agregalarını, reaktif A ile 18 mililitre orta iki içeren 10 santimetrelik bir süspansiyon kabına aktarın. 18. günde, çanakta yarı saydam bir optik vezikülün oluşumunu onaylayın ve üretilen organoidleri mikrocerrahi bir bıçak kullanarak kesin.Tüm kesilmiş peletleri kabın ortasına toplayın. Ardından, hücreleri 15 mililitrelik konik bir Falcon tüpüne toplayın. Hücreler yerleştiğinde, süpernatanı yavaşça çıkarın ve peletleri, her tabak için üç tane olmak üzere 18 mililitre orta ile iki adet 10 santimetrelik Petri kabında yeniden askıya alın.Hücre kümelenmesini önlemek için bulaşıkları yavaşça inkübatöre aktarın. Hücreleri kültürlemeye devam edin, ortamı haftalık olarak değiştirin. CRX ifadesini 45. günden 120. güne kadar analiz edin.Bu temsili analizde, insan retina üretiminin çeşitli aşamaları görüntülenir. Altıncı günde, organoidler yaklaşık 600 mikrometre çapında parlak bir jant içinde yoğun bağlantıların bir toplamı olarak ortaya çıktı. 12. günde, optik vezikül benzeri yapıların ilk nesli gerçekleşti.Uygun vezikül benzeri mimariye sahip olmayan organoidler, 18. günde bir Petri kabında kültürlenmeden önce atıldı. Kültürün 30. gününde, vezikül benzeri mimari daha belirgindi ve daha düşük RO'lar kolayca ayırt edilebilir ve çıkarılabilirdi. 45. günden başlayarak, organoidler CRX, RCVRN ve OTX2 gibi fotoreseptör öncüllerinin çeşitli belirteçlerini ifade ettiler.Üstün retinal organoidleri parçalayarak, farklılaşma verimliliği önemli ölçüde artar ve 96 plakadan 100'den fazla üstün organoid toplanabilir.

directed-induction-retinal-organoids-from-human-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kök hücre kaynaklı retina pigment epitel (RPE) hücreleri, retina dejenerasyonu için hücre bazlı tedaviler, hastalık modellemesi ve ilaç çalışmaları dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılabilir. Burada, kök hücrelerden RPE'nin tekrarlanabilir bir şekilde türetilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Bu iletişim kuralı, retina pigment epitel hücreleri (RPE) pluripotent kök hücre üretmek açıklar. Yöntem farklılaşma kök hücre içine olgunlaşmamış RPE on dört gün ve olgun, fonksiyonel RPE üç ay sonra büyüme faktörleri ve küçük moleküller bir arada kullanır.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerini kullanarak vasküler organoidler oluşturmak için bir yöntem sunar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi

Bu protokol, tam montajlı retinal organoidlerin tam hacimli konfokal görüntülemesi için optik temizleme ve immün etiketlemeyi birleştirir. 3D yapıyı koruyarak, temel nöronal yolların ayrıntılı görselleştirilmesini sağlar, retina olgunlaşması, mekansal organizasyon ve hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıptaki potansiyel uygulamalarının incelenmesini geliştirir.

Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu...

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Doğrudan insan dokularından kanser kök hücreler (rulmanları) izolasyonu biyolojik karakterizasyonu için bir koşuldur. Ayrıca zor sorun giderme adımları konusunda ipuçları sağlarken Bu makale, insan dokularından prostat CSCS izolasyonu için bir yöntem anlatılmaktadır.

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden retinal organoid üretim protokolünü. Fotoreseptör prekürsör verimini artıran bu yöntem, retinal hastalık modellemesi ve hücre nakli için ölçeklenebilir bir platform sunar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Daha fazla video keşfet