Name: Küçük Moleküllerin Mikrokristal Elektron Kırınımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Öğrenin, küçük moleküller için mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) protokolünü ve nanokristallerden atomik çözünürlüklü yapı belirleme yöntemini. Bu teknik, karbamazepin gibi ilaç bileşiklerinin hızlı analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gonen laboratuvarı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nün fonlarıyla desteklenmektedir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri P41GM136508 tarafından desteklenmiştir.

1. Küçük molekül örneklerinin hazırlanması
<ol><li>Az miktarda (0.01 - 1 mg) toz, sıvı veya katı maddeyi küçük bir şişeye veya tüpe aktarın.</li>
	<li>Zaten toz halinde olan numuneler için, numuneye ihtiyaç duyulana kadar kapağı kullanarak tüpü kapatın. Yöntem 1 (adım 3) veya 2 (adım 4) denemelerinden önce sıvı numuneleri tozlar halinde kurutun. NOT: Sıvı içinde çözünmüş numuneler aşağıdaki yöntem 3'ü (5.X) kullanabilir</li>
</ol>2. TEM ızgaralarının hazırlanması
NOT: Otomatik yükleyici sistemli bazı TEM'ler, TEM kolonuna yüklenmeden önce ızgaraların kırpılmasını ve bir kasete yerleştirilmesini gerektirir. Kırpma, 3 mm'lik TEM ızgarasını, otomatik yükleyicinin manipüle edebileceği metal bir halkaya fiziksel olarak sabitlemeyi içerir. Bu adım ve sonraki adımlar, normal TEM ızgaraları veya kırpılmış TEM ızgaraları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu deneyler için, önceden kırpılmışlarsa ızgaraları manipüle etmek genellikle daha kolaydır.
<ol><li>Plastik filmi cam kapak sürgüsünün bir ucunun etrafına sarın.</li>
	<li>TEM ızgaralarını, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde kapak sürgüsünün üstündeki filmin üzerine yerleştirin. Bir ışık altında ızgaranın iki tarafını tanımlayın. Bakır tarafı parlar ve metalik görünürken, karbon tarafı sert, kahverengi bir renkte görünür (Şekil 1C, D). Kırpılmış ızgaralar için, karbon tarafı klips halkasının düz yüzüne bakmalıdır.</li>
	<li>Slaytı ızgaralarla birlikte kızdırma boşaltma odasına yerleştirin. Kızdırma, 15 pA'daki negatif ayarı kullanarak kapak kenarını yaklaşık 30 sn boyunca boşaltır. Izgaralara numune eklemeden önce ızgaraları kapak sürgüsünde filtre kağıdı ile kaplı bir cam Petri kabının içinde saklayın.</li>
</ol>3. Homojen ince toz oluşturarak ızgaralara numune uygulanması (Yöntem 1)
<ol><li>Cımbız kullanarak üzeri kapalı Petri kabından ışıltı boşaltılmış TEM ızgarasını çıkarın. Izgarayı, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde dairesel bir filtre kağıdına yerleştirin.</li>
	<li>Küçük bir spatula kullanarak, çok küçük bir toz kepçesini (yaklaşık 0.1 mg) çıkarın ve filtre kağıdındaki TEM ızgarasının hemen yanındaki küçük, kare, cam bir kapak üzerine yerleştirin. Tozun üzerine başka bir küçük kare cam slayt veya kapak kayması yerleştirin.</li>
	<li>Parmaklarınızla, ince bir toz yapmak için iki cam slaytı hafifçe ovalayın.</li>
	<li>Kapak fişlerini açın ve filtre kağıdındaki TEM ızgarasının hemen üzerine yerleştirin ve kızdırma deşarjlı TEM ızgarasının sadece birkaç cm yukarısında kapak kapaklarını birbirine sürtmeye devam edin (Şekil 1).</li>
	<li>Tozun ızgaraya doğru düşüp düşmediğini görmek için gözlemleyin. İki cam örtüden birini çıkararak ince öğütülmüş tozu ortaya çıkarın. İnce tozu bir parça filtre kağıdı kullanarak kapak kapağından nazikçe TEM ızgarasına fırçalayın (Şekil 1).</li>
</ol>4. "Sallama" yöntemi uygulanarak ızgaralara numune uygulanması (Yöntem 2)
<ol><li>Bir çift cımbız kullanarak bir ızgara alın ve toz numunesinin şişesine veya tüpüne bırakın. Çalkalandığında hiçbir malzemenin kaçmayacağından emin olmak için plastik kapağı kullanarak şişeyi kapatın.</li>
	<li>Şişeyi elinizde tutarak, şişeyi toz ve ızgaranın her ikisi de yaklaşık 10 - 30 s boyunca hareket edecek şekilde sallayın.</li>
	<li>Flakon içeriğini dairesel bir filtre kağıdına boşaltın. Izgarayı bir kenardan tutarak, fazla malzemeyi ızgaradan çıkarmak için filtre kağıdındaki ızgara kenarına hafifçe dokunun. NOT: Şişenin türüne ve boyutuna bağlı olarak, içeriği boşaltmadan TEM ızgarasını çıkarmak için cımbız da kullanılabilir.</li>
</ol>5. Evaporasyon yöntemi kullanılarak ızgaralara numune uygulanması (Yöntem 3)
<ol><li>Dairesel bir filtre kağıdı parçasının ortasına, karbon tarafı yukarı ve bakır tarafı aşağı bakacak şekilde bir ızgara (kırpılmış veya kırpılmamış) yerleştirin.</li>
	<li>10 μL gaz geçirmez bir şırınga kullanarak, ızgaranın karbon tarafına küçük bir damla (yaklaşık 1 - 3 μL) çözünmüş bileşik uygulayın.</li>
	<li>Izgaralı filtre kağıdını yavaşça bir vakum kurutma odasına taşıyın. Odayı örtün ve vakumu açın. Izgaraları bir güne kadar kuruması için vakum altında bırakın.</li>
	<li>Vakumu kapatın ve odanın 5 dakika boyunca havalandırılmasına izin verin. Odanın havalandırılması, ızgaraların ortaya çıktığında hareket etmesini veya uçmasını önler.</li>
</ol>6. Izgaraların dondurulması ve TEM'e yüklenmesi
<ol><li>Bir dizi cımbız kullanarak TEM ızgarasının kenarını tutun ve uçların ızgara karelerinin hiçbirini delmediğinden emin olun. Izgarayı filtre kağıdının 1 - 2 cm yukarısına kaldırın ve ızgarayı aşağıdaki kağıda 90° açıyla açın. Gevşek tozları temizlemek için ızgarayı sıkıca cımbızlı tutarken cımbızlara hafifçe dokunun.</li>
	<li>Cımbızın ucunu ızgara ile birlikte elle doğrudan sıvı azot kabına hareket ettirerek ızgarayı dondurun. Bu konteyner tipik olarak TEM için ızgara yükleme istasyonudur, ancak sıvı azot emniyetli termos gibi herhangi bir güvenli konteyner olabilir, transfer veya depolama için kabul edilebilir. Sıvı azot -196 °C'dir.</li>
	<li>Daha fazla manipülasyondan önce ızgara ve cımbız kaynamayı bırakana kadar bekleyin.</li>
	<li>Sıvı azot altında veya azot buharlarında, ızgarayı numune tutucusuna, karbon tarafı yönlendirilmiş olarak yerleştirin, böylece numune karbon destek filminden önce ışın tarafından vurulacaktır.</li>
	<li>Numune tutucuyu TEM'e yükleyerek ızgaranın her zaman sıvı azot sıcaklıklarında tutulmasını sağlayın.<ol><li>Otomatik yükleyici sistemleri için, kırpılmış ızgaraları sıvı azot soğutmalı bir kapta bir kasete yerleştirin. Bu kaset, otomatik yükleyici robotiklerinin kaseti kabul etmesine izin verirken, numuneleri otomatik yükleyici ile sütun arasında dolaşmak için güvenli tutarken bir titreme kabına aktarılır.</li>
		<li>Yandan girişli TEM kurulumları için, ızgarayı ticari bir yandan girişli TEM tutucusuna sabitleyin. Bu tutucular, ızgaranın numuneyi ısıtmadan tutucuya aktarılmasını sağlamak için sıvı azotla doldurulmuş bir numune hazırlama kabına sahiptir. Yan giriş tutucusu, numune sonunda sabitlenmiş olarak doğrudan TEM'e yerleştirilir.</li>
	</ol></li>
</ol>7. MicroED verilerinin toplanması
<ol><li>Nanokristallerin konumlandırılması ve taranması<ol><li>TEM kolon vanalarını açın. El panellerini kullanarak büyütmeyi mümkün olan en düşük büyütmeye ayarlayın. El panellerindeki yoğunluk düğmesini, floresan ekranda yuvarlak, parlak bir alan görünecek şekilde ayarlayarak ışını bulun.</li>
		<li>Uygun yazılımı kullanarak düşük büyütmede (50 - 300x) bir all-grid atlası alın14,15,16 (Şekil 2). Yüksek çözünürlüklü MicroED verilerini toplamadan önce mikroskobun hem düşük hem de yüksek büyütmeli görüntüleme için iyi hizalandığından emin olun.</li>
		<li>Kırık karbon içermeyen ızgara karelerini tanımlayın ve film üzerinde görünür siyah veya koyu renkli bir malzeme / tanecik bulundurun (Şekil 2). Kırılmamış ve mikrokristaller içeren ızgara karelerini aramak için fiziksel olarak el panellerindeki joystick'i kullanarak veya neredeyse toplanan Atlas üzerinde ızgaranın etrafında gezinin.</li>
		<li>Bu karelerin her birinin merkezini, incelenecek ızgara konumları listesine ekleyin. Bu konumlar bir not defterine, mikroskop kullanıcı arabirimine veya mikroskop otomasyon yazılımına eklenebilir.</li>
		<li>Büyütme oranını 500-1.300x'e yükseltin ve depolanan her ızgara konumunda ösentrik yüksekliği ayarlayın ve kaydedilen Z değerini 7.1.4'te belirtilen konumlara güncelleyin.</li>
		<li>Floresan ekranda veya hızlı bir kamerada, ızgaradaki küçük siyah noktalar/tanecikler için bu yüksek büyütmede arama yapın. İyi bir numune genellikle yüksek büyütmede keskin kenarlara sahiptir, bu da kristalin düzeni gösterir.</li>
		<li>Yerleştirilmiş potansiyel bir kristali ekranın ortasına taşıyın ve büyütmeyi, TEM'in yüksek büyütme moduna girmesi için artırın. NOT: Bu, farklı enstrümanlarda yüksek büyütme, Zoom2 veya SA modu olarak adlandırılır ve tipik olarak 3.000x veya daha yüksek büyütmelere karşılık gelir.</li>
		<li>Seçili bir alan diyaframı ekleyin. Seçilen alanın kristalden sadece daha büyük olduğundan emin olmak için diyafram açıklığını daha büyük veya daha küçük bir boyuta değiştirin (Şekil 3).</li>
		<li>TEM el panellerindeki kırınım düğmesine basarak kırınım moduna geçin ve floresan eleğin takılı olduğundan emin olun. Büyütme düğmesini kullanarak kamera uzunluğunu, kenar en az 1 şçözünürlükte olacak şekilde ayarlayın. NOT: Kırınım uzunluklarının kalibrasyonu, MicroED deneylerini denemeden önce altın waffle ızgarası veya bilinen numune kullanan bir servis mühendisi tarafından yapılmalıdır.</li>
		<li>Kırınım odağını, merkezi nokta mümkün olduğunca keskin ve küçük olacak şekilde ayarlayın. Kırınım kaydırma düğmelerini kullanarak, merkezi kirişi floresan ekranın ortasına getirin</li>
		<li>Kiriş durdurucuyu takın ve kirişin arkasında olduğundan emin olun. Floresan ekranı kaldırın. Fotoğraf makinesinde kısa (yaklaşık 1 sn) pozlama yapın (Şekil 4).</li>
		<li>İlgili kırınım desenini inceleyin. Tam bir veri kümesi toplamak için iyi bir aday, düzenli olarak sütunlar ve satırlar halinde düzenlenmiş keskin noktalara sahip olacak ve kırınım 2 Å'nın ötesine, tercihen en az 1 Å'ya kadar uzanacaktır (Şekil 4). Kristal koordinatları TEM kullanıcı arayüzüne veya bir yere yazarak kaydedin.</li>
		<li>Mevcut ızgara karesindeki tüm potansiyel kristaller için kırınım taramasını tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri toplama<ol><li>Ekrandaki ekranlı bir kristali yüksek büyütmede (1.000x> ortalayın). Kristalin ösentrik yüksekliğini otomatik bir rutin kullanarak veya elle ayarlayın.</li>
		<li>7.1.8'de belirlenen kristal boyutuna ve şekline en uygun seçilen alan diyafram açıklığını ekleyin (Şekil 3). Görüntü ızgara çubukları tarafından tıkanana kadar sahne alanını negatif ve pozitif yönlerde eğin (Şekil 3). Veri toplama amacıyla bu açılara dikkat edin.</li>
		<li>Veri kümesinin toplam açısal dilimine yayılmak için gereken çerçeve sayısını belirleyin. Her kare için 0,5 - 1,0° kama kullanmak tipiktir, çerçeveler kameranın hassasiyetine bağlı olarak her 1 ila 5 saniyede bir okunur. Örneğin, -30° ile +30° arasında değişen, her 1 saniyede bir okunan bir çerçeve ile 1° s-1 sabit bir hızda dönen bir kama, toplam 60 kare gerektirir.</li>
		<li>-72° ila +72° arasındaki maksimum toplam eğim aralığını göz önünde bulundurarak, sahneyi 1° s-1 sabit bir hızda döndürmeye başlayın ve ardından hareketli deklanşör okuma moduna sahip modern bir kamerada her 1 saniyede bir verileri okumaya başlayın (Film 1). Bu işlem manuel olarak veya TEM'e özgü yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir.<ol><li>Maksimum eğme hızının % 'sini ve mikroskop kullanıcı arayüzünde veya özel yazılımda ne zaman durulacağını belirterek dönüş hızını ayarlayın. Bu araştırmada, bunun maksimum hızın her % 'si için 0.3 ° s-1 olduğu ölçülmüştür, ancak her mikroskop için bağımsız olarak doğrulanması gerekecektir. NOT: Eğme ve kamera veri toplama burada bağımsız olarak ayarlanır, ancak yazılım programları14 işlemi basitleştirmek için bunu koordine edebilir.</li>
			<li>Belirtilen kamanın her iki tarafında yaklaşık 1 ° 'yi atın, çoğu durumda sahne alanının istenen dönüş hızına yükseldiği veya yavaşladığı ölü zaman olarak atın.</li>
		</ol></li>
		<li>Verileri tek tek kareler veya görüntü yığını olarak çeşitli biçimlerde kaydedin (Film 1).</li>
		<li>Bu kırınım çerçevelerini, burada bulunan MicroED araçlarını kullanarak tipik bir kristalografik formata dönüştürün (https://cryoem.ucla.edu). SMV formatında kaydedilen kırınım görüntüleri, belgelenmiş kristalografik yazılım17,18 kullanılarak kolayca işlenir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345(2013).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li>
<li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li>
<li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+A+Foundations+and+Advances%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+limitations+of+neutrons%2C+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li>
<li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109(2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li>
<li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li>
<li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li>
<li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-%C3%A5ngstr%C3%B6m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li>
<li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li>
<li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+with+SerialEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li>
<li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+catalase+determined+by+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600(2014).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Numune hazırlama tipik olarak, tarama ve veri toplama oturumlarından sonra optimizasyonların yapıldığı yinelemeli bir işlemdir. Küçük moleküllü numuneler için, birçok farmasötik hidrofobik olma eğiliminde olduğundan, ızgaraları kızdırmadan ilk önce ızgara hazırlamayı denemek genellikle ihtiyatlıdır10,11. Izgaralarda çok az nanokristal birikintisi varsa, ızgaraları ilk kez kızdırdıktan sonra tekrar denemek iyi bir fikirdir. Liyofilize tozlardan elde edilen kristal...

Mikrokristal elektron kırınımı (MicroED), mikrometre altı boyutlu kristallerdenatomik çözünürlük yapılarını belirlemek için kullanılan bir elektron kriyo-mikroskopi (cryo-EM) yöntemidir 1,2. Kristaller standart transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ızgaralarına uygulanır ve sıvı etan veya sıvı azota daldırılarak dondurulur. Izgaralar daha sonra kriyojenik sıcaklıklarda çalışan bir TEM'e yüklenir. Kristaller ızgarada bulunur ve ilk kırınım kalitesi için taranır. Sürekli rotasyon MicroED verileri, verilerin film olarak hızlı bir kamera kullanılarak kaydedildiği taranmış kristallerin bir alt kümesinden toplanır3. Bu filmler standart bir kristalografik formata dönüştürülür ve bir X-ışını kristalografi deneyi4 ile neredeyse aynı şekilde işlenir.
MicroED başlangıçta protein mikrokristalleri 1,2'yi araştırmak için geliştirilmiştir. Protein kristalografisindeki bir darboğaz, geleneksel senkrotron X-ışını kırınım deneyleri için büyük, iyi düzenlenmiş kristaller büyüyor. Elektronlar, X-ışınlarından daha güçlü olan madde büyüklük sıralarıyla etkileşime girdiğinden, tespit edilebilir kırınım üretmek için gereken kristal boyutunun sınırlamaları oldukça küçüktür5. Ek olarak, elastik ve elastik olmayan saçılma olaylarının oranı elektronlar için daha elverişlidir, bu da daha küçük bir genel maruz kalma ile daha yararlı verilerin toplanabileceğini düşündürmektedir5. Sürekli gelişmeler, MicroED verilerinin en zorlu mikrokristallerdentoplanmasına izin vermiştir 6,7,8,9.
Son zamanlarda, MicroED'nin görünüşte amorf malzemelerden küçük moleküllü farmasötiklerin yapılarını belirlemek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir10,11,12,13. Bu tozlar doğrudan bir şişe satın alınan reaktiften, bir saflaştırma kolonundan veya hatta bir hapı ince bir toz haline getirmekten gelebilir10. Bu tozlar gözle amorf görünür, ancak ya tamamen nanokristallerden oluşabilir ya da sadece kristalin olmayan, amorf fraksiyonda eser miktarda nanokristalin birikintileri içerebilir. Malzemenin ızgaraya uygulanması kolaydır ve kristal tanımlama, tarama ve veri toplamanın sonraki adımları yakın gelecekte otomatikleştirilebilir14. Diğerleri numune hazırlama ve veri toplama için farklı yöntemler kullanabilirken, burada MicroED için küçük moleküllerin örneklerinin hazırlanması ve veri toplanması için Gönen laboratuvarında geliştirilen ve kullanılan protokoller detaylandırılmıştır.

<table><tbody><tr><td>0.1-1.5mL Eppendorf tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-282-300</td><td>Herhangi bir flakon veya tüp yapacaktır.</td></tr><tr><td>Otomatik ızgara klipsleri</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036173</td><td>MicroED için kırpılmış ızgaralar gerekli değildir. Otomatik yükleyici sistemi ile donatılmış Thermo-Fisher TEM'ler için gereklidirler.</td></tr><tr><td>Otomatik ızgara C-halkaları</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Karbamazapin</td><td>Sigma</td><td>C4024-1G</td><td>Bu deneyler için herhangi bir miktar yeterli olacaktır</td></tr><tr><td>CMOS tabanlı dedektör</td><td>Thermo-Fisher</td><td>CetaD 16M</td><td>Bir CetaD 16M kullandık, ancak deklanşör modu veya yeterince hızlı okuma ile herhangi bir dedektör kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>Delphi yazılımı</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Thermo-Fisher TEM sistemlerinde numune aşamasının manuel olarak döndürülmesine izin veren yazılım</td></tr><tr><td>EPU-D yazılımı</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>MicroED verilerinin elde edilmesi için ticari yazılım</td></tr><tr><td>Cam kapak slaytları</td><td>Hampton</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Kızdırma boşaltıcı</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli Cımbız</td><td>EMS</td><td>78325-AC</td><td>Herhangi bir yüksek hassasiyetli cımbız işinizi görecektir</td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen kabı</td><td>Mızrak Laboratuvarı</td><td>FD-800</td><td>Sıvı nitrojen altında numunelerin işlenmesi için standart bir köpük kap - 800mL</td></tr><tr><td>SerialEM yazılımı</td><td>UC Boulder</td><td>N/A</td><td>D. Mastronarde tarafından dağıtılan ücretsiz yazılım. Moleküler, Hücresel ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü</td></tr><tr><td>TEM ızgaraları</td><td>Burada Quantifoil/EMS</td><td>Q310CMA</td><td>Multi-A 300 gözenekli ızgaralar kullanıldı, ancak herhangi bir ince karbon ızgara işe yarayacaktır. Bu küçük moleküller için sürekli karbon ile başlamanızı öneririz.</td></tr><tr><td>transmisyon elektron mikroskobu (TEM)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Talos Arctica</td><td></td></tr><tr><td>Whatman dairesel filtre kağıdı</td><td>Millipore-Sigma</td><td></td><td>WHA1001090 90mm veya daha büyük</td></tr></tbody></table>

küçük moleküllerin mikrokristal elektron kırınımı

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük molekül örnekleri hazırlamak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. MicroED, standart elektron kriyo-mikroskopi (cryo-EM) ekipmanı kullanılarak proteinlerin ve küçük moleküllerin yapılarını çözmek için geliştirilmiştir. Bu şekilde, küçük moleküller, peptitler, çözünür proteinler ve membran proteinleri son zamanlarda yüksek çözünürlüklerde belirlenmiştir. Örnek olarak karbamazepin ilacını kullanarak küçük moleküllü farmasötiklerin ızgaralarını hazırlamak için protokoller burada sunulmuştur. Verilerin taranması ve toplanmasına yönelik protokoller sunulmaktadır. Veri entegrasyonu, yapı belirleme ve iyileştirme gibi genel süreçteki ek adımlar başka yerlerde sunulmaktadır. Küçük moleküllü ızgaraları hazırlamak için gereken sürenin 30 dakikadan az olduğu tahmin edilmektedir.

MicroED, elektronlar ve madde arasındaki güçlü etkileşimlerden yararlanan ve kaybolan küçük kristallerin araştırılmasına izin veren bir kriyoEM yöntemidir12,13. Bu adımlardan sonra, mikrokristallerden toplanan kristalografik formatta bir kırınım filmine sahip olması beklenmektedir (Film 1). Burada, teknik karbamazepin12 kullanılarak gösterilmiştir. Sonuçlar, bir TEM ızgarasında tanımlanan bir karbamazepin mikrokristalinden...

Burada, mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük moleküllü kristallerin tozlarının hazırlanması için laboratuvarımızda geliştirilen prosedürleri açıklıyoruz.

Küçük Moleküllerin Mikrokristal Elektron Kırınımı

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Bu prosedürde, küçük moleküllü bir tozdan üç boyutlu bir yapıya dakikalar içinde nasıl geçileceğini gösteriyoruz. Bu, kimya topluluğu için dönüştürücü bir tekniktir. Birçok bileşik kolayca büyük kristallere dönüşmez.MicroED ile nanometre boyutundaki kristallerden atomik çözünürlük yapılarını belirleyebiliyoruz. Prosedürü gösteren, UCLA'da profesör olan Dr. Mike Martynowycz olacak. Başlamak için, az miktarda toz, sıvı veya katı maddeyi küçük bir şişeye veya tüpe aktarın.Zaten toz halinde olan numuneler için, numuneye ihtiyaç duyulana kadar kapağı kullanarak tüpü kapatın. Benzer şekilde, sıvı numuneleri tozlar halinde kurutun. Plastik filmi cam kapak sürgüsünün bir ucunun etrafına sarın.TEM ızgaralarını, kahverengi renkli karbon tarafı yukarı bakacak şekilde kapak sürgüsünün üstündeki film üzerine yerleştirin. Ardından, slaytı ızgaralarla birlikte kızdırma boşaltma odasına yerleştirin ve 15 pikoamperdeki negatif ayarı kullanarak kapak slaytını yaklaşık 30 saniye boyunca kızdırın. Izgaraları kapak sürgüsünde, numuneyi ızgaralara eklemeden önce filtre kağıdı ile kaplı cam bir Petri kabının içinde saklayın.Kızdırma deşarjı TEM ızgarasını cımbız kullanarak kapalı Petri kabından çıkarın ve karbon tarafı yukarı bakacak şekilde dairesel bir filtre kağıdına yerleştirin. Küçük bir spatula kullanarak, çok küçük bir toz kepçesini çıkarın ve filtre kağıdındaki TEM ızgarasının hemen yanındaki küçük bir kare cam kapak kayması üzerine yerleştirin. Tozun üzerine başka bir küçük kare cam slayt veya kapak kayması yerleştirin.Parmaklarınızla, ince bir toz yapmak için iki cam slaytı hafifçe ovalayın. Kapak kaymalarını açın ve filtre kağıdındaki TEM ızgarasının hemen üzerine yerleştirin ve kapak kaymalarını parıltıdan boşaltılmış TEM ızgarasının sadece birkaç santimetre yukarısında ovalamaya devam edin. Tozun ızgaraya doğru düşüp düşmediğini gözlemleyin.İki cam kapak fişinden birini çıkararak ince öğütülmüş tozu ortaya çıkarın. Daha sonra ince tozu kapak fişinden bir parça filtre kağıdı kullanarak TEM ızgarasına nazikçe fırçalayın. Bir dizi cımbız kullanarak TEM ızgarasının kenarını tutun ve uçların ızgara karelerinin hiçbirini delmediğinden emin olun.Izgarayı filtre kağıdının bir ila iki santimetre yukarısına kaldırın ve ızgarayı aşağıdaki kağıda 90 derece açın. Gevşek tozları temizlemek için ızgarayı sıkıca cımbızlı tutarken cımbızlara hafifçe dokunun. Cımbızın ucunu ızgara ile doğrudan sıvı azot kabına elle hareket ettirerek ızgarayı dondurun ve ızgara ve cımbız kaynamayı bırakana kadar bekleyin.Sıvı azot altında, ızgarayı numune tutucuya, karbon tarafı yönlendirilmiş olarak yerleştirin, böylece numune karbon destek filminden önce ışın tarafından vurulacaktır. Numune tutucuyu TEM'e yükleyerek ızgaranın her zaman sıvı azot sıcaklıklarında tutulmasını sağlayın. Otomatik yükleyici sistemleri için, kırpılmış ızgaraları sıvı azot soğutmalı bir kapta bir kasete yerleştirin, bu da otomatik yükleyici robotiklerinin kaseti kabul etmesini sağlarken numuneleri otomatik yükleyici ile sütun arasında sıkışmaya karşı güvende tutar.TEM kolon vanalarını açın ve el panellerini kullanarak büyütmeyi mümkün olan en düşük büyütmeye ayarlayın. El panellerindeki yoğunluk düğmesini, floresan ekranda yuvarlak parlak bir alan görünecek şekilde ayarlayarak ışını bulun. Yüksek çözünürlüklü MicroED verilerini toplamadan önce mikroskobun hem düşük hem de yüksek büyütmeli görüntüleme için iyi hizalandığından emin olmak için uygun yazılımı kullanarak düşük büyütmede tüm ızgara atlasını alın.Kırık karbon ve film üzerinde görünür siyah veya koyu tanecikler olmadan ızgara karelerini tanımlayın. El panellerindeki joystick'i fiziksel olarak kullanarak veya kırılmamış ve mikro kristaller içeren ızgara karelerini aramak için toplanan atlasın üzerinde sanal olarak ızgaranın etrafında gezinin. Bu karelerin her birinin merkezini, mikroskop kullanıcı arabiriminde veya mikroskop otomasyon yazılımında bir not defterine eklenebilecek araştırma için ızgara konumları listesine ekleyin.Büyütme oranını 500 ile 1300x arasında ayarlayın. Depolanan her ızgara konumunda merkezsel yüksekliği ayarlayın ve kaydedilen z değerini belirtilen konumlara güncelleyin. Floresan ekranda veya düz bir kamerada ızgaradaki küçük siyah noktalar veya tanecikler için arama yapın.İyi bir numune genellikle kristali sırayla düşündüren yüksek büyütmede keskin kenarlara sahip olacaktır. Yerleştirilmiş potansiyel bir kristali ekranın ortasına taşıyın ve büyütmeyi, TEM'in yüksek büyütme moduna girmesi için artırın. Seçilen alanın kristalden daha büyük olduğundan emin olmak için seçilen alan diyafram açıklığını daha büyük veya daha küçük bir boyuta değiştirin.TEM el panellerindeki kırılma düğmesine basarak floresan eleğin takılı olduğundan emin olarak kırılma moduna geçin. Büyütme düğmesini kullanarak kamera uzunluğunu, kenar en az bir angstrom çözünürlüğü olacak şekilde ayarlayın. Kırınım odağını, merkezi nokta mümkün olduğunca keskin ve küçük olacak şekilde ayarlayın.Kırınım kaydırma düğmelerini kullanarak, merkezi kirişi floresan ekranın ortasına getirin. Kirişin arkasında olduğundan emin olmak için ışın durdurmayı takın. Floresan ekranı kaldırın ve fotoğraf makinesine kısa bir pozlama yapın.İlgili kırılma desenini inceleyin, desenin düzenli olarak sütunlar ve satırlar halinde düzenlenmiş keskin noktalara sahip olacağından emin olun. Kristal koordinatlarını TEM kullanıcı arayüzüne kaydedin veya bir yere yazın, ardından mevcut ızgara karesindeki tüm potansiyel kristaller için kırınım taramasını tekrarlayın. Elenmiş kristali 1000x'ten daha büyük bir büyütmede ortalayın ve kristalin merkezsel yüksekliğini otomatik bir rutin kullanarak veya elle ayarlayın.Kristal boyutuna ve şekline en uygun seçili alan diyafram açıklığını yerleştirin. Görüntü ızgara çubukları tarafından tıkanana kadar sahne alanını negatif ve pozitif yönlerde eğin. Ayrıca, panjur okuma moduna sahip modern bir kamerada verileri her saniye okuyarak veri toplama amacıyla bu açıları not edin.Maksimum eğme hızının yüzdesini ve mikroskop kullanıcı arayüzünde veya özel yazılımda ne zaman durulacağını belirterek dönüş hızını ayarlayın. Verileri tek tek kareler veya bir görüntü yığını olarak çeşitli biçimlerde kaydedin. Mikro kristallerden toplanan kristalografik formattaki bir kırılma filmi, bir TEM ızgarasında tanımlanan bir karbamazepin mikro kristalinden sürekli dönen bir MicroED veri kümesini gösterir.Veri toplama, tümleştirme ve yapı çözümünden sonra, yüksek çözünürlüklü bir yapı belirlenir ve netliği, verilerin kalitesine ve eksiksizliğine bağlıdır. Numunenin ızgaraya uygulanması, iyi veriler elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu yöntemi takiben, veriler standart kristalografik yazılım kullanılarak daha fazla işlenebilir.MicroED'in küçük moleküller için güçlü bir yöntem olduğunu göstermek, kritik öneme sahip moleküllerin yeni yapılarını çözmek için dünya çapında kullanımını açmıştır.

microcrystal-electron-diffraction-of-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu çalışma, standart bir elektron geri yansıma difraksiyon sistemi ile donatılmış bir tarama elektron mikroskobu kullanılarak ultra-ince taneli ve nano malzemelerin mikro karakterize etmek için detaylı bir yöntem sağlar. Metal alaşımları ve rafine mikro yapılar sunan mineraller muhtemel uygulamaların çeşitliliğini gösteren bu tekniği kullanılarak analiz edilir.

İletim Kikuchi difraksiyonu kullanılarak ultra-ince taneli ve Nanokristal Malzemelerin Karakterizasyonu

Protein mikro kristalleri kullanılarak X-ışını kristalografisi için bir protokol sunulmuştur. Saflaştırmadan sonra ya da selüloda in vivo büyümüş mikrokristalleri analiz eden iki örnek karşılaştırılmıştır.

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

X-ışınları yoğun, femtosecond darbeleri tarafından Bukminsterfuleren (C60) nanocrystals içinde indüklenen elektronik hasar soruşturma için tasarlanmış bir deney tarif. Doğal olarak, Stokastik olmak yerine, röntgen dynamics C60 yılında son derece correlated, elektron kristalleri1birim hücrenin yüzlerce üzerinde uzanan indüklenen, deneme bulundu.

Bukminsterfuleren Nanocrystals üzerinde gerçekleştirilen Femtosecond kırınım deneyler sırasında uzun menzilli elektronik korelasyon ölçümleri

Bu protokolü nasıl imal ve mikrosıvısal cihazlar x-ışını kırınım veri toplama oda sıcaklığında için ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Ayrıca, protein kristalizasyon tarafından dinamik ışık saçılma izlemek açıklar ve nasıl işlemek ve analiz kırınım veri elde.

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

Biz dışarı hızlı iki boyutlu x-ışını floresans ve x-ışını microdiffraction eşleme örnekleri Laue (renkliden radyasyon) ya da (tek renkli radyasyon) toz difraksiyon kullanarak tek kristal veya toz taşımak istedim beamline kurulumunu açıklayan. Elde edilen haritalar zorlanma, yönlendirme, faz dağıtım ve plastik deformasyon hakkında bilgi vermek.

Sinkrotron x-ışını Microdiffraction ve Mineral ve kaya örneklerini floresans görüntüleme

Burada sunulan memeli hücrelerde membran proteinleri etiketleme ve sıvı faz lı iletim elektron mikroskopisi için grafen ile örnek kaplama için bir protokoldür. Örneklerin radyasyonun neden olduğu hasara karşı stabilitesi de bu protokol ile incelenebilir.

Sıvı Fazlı Elektron Mikroskobu için Kimyasal Olarak Sabit Memeli Hücrelerinin Grafen Muhafazası

Azınlık türlerinden, ışık elementlerinden, oksijen boşluklarından ve diğer nokta/çizgi/düzlemsel kusurlardan güvenilir bir şekilde bilgi alan olay elektron ışını sallama koşulları altında elektron kanallama fenomenlerinden yararlanarak safsızlıkların ve kimyasal durumlarının saha doluluklarını tahmin etmek için nicel mikroanaliz yöntemlerinin genel bir taslağını sunuyoruz.

Kristal Malzemelerdeki Fonksiyonel Dopant/Nokta Kusurlarının Elektron Kanalize-Geliştirilmiş Mikroanaliz ile Nicel Atomik Saha Analizi

Verilerin sinyal-gürültü oranı, mikrokristallerden X-ışını kırınım ölçümlerinin yapılmasında en önemli hususlardan biridir. VMXm kiriş çizgisi, bu tür deneyler için düşük gürültülü bir ortam ve mikrobülans sağlar. Burada, VMXm ve diğer mikro odak makromoleküler kristalografi kiriş hatları için mikrokristallerin montajı ve soğutulmasından dolayı örnek hazırlama yöntemlerini açıklıyoruz.

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

Burada, uzun dalga boyu makromoleküler X-ışını kristalografi deneyleri için Diamond Light Source'daki I23 kiriş hattında kriyojenik numune hazırlama ve kristallerin vakum endstationına aktarılması için bir protokol sunuyoruz.

Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü

Bu katkı, kristal üzerinde kristal cihazlarda protein kristalizasyonunun nasıl kurulacağını ve çip üzerinde kristalizasyon platformunu kullanarak oda sıcaklığında otomatik seri veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Öğrenin, küçük moleküller için mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) protokolünü ve nanokristallerden atomik çözünürlüklü yapı belirleme yöntemini. Bu teknik, karbamazepin gibi ilaç bileşiklerinin hızlı analizini sağlar.

Küçük Moleküllerin Mikrokristal Elektron Kırınımı

Daha fazla video keşfet