Name: Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Öğrenin, menenjitik Escherichia coli ile enfekte nötrofillerde reaktif oksijen türlerinin gerçek zamanlı nicelemesi için floresan prob ve mikroplaka okuyucu kullanan bu yöntemi. Bağışıklık ve mikrobiyoloji araştırmalarında konak-patojen etkileşimlerini incelemek için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31670845, 31870832, 32000811) ve Liaoning Eyaleti Seçkin Profesör Programı (LJH2018-35) tarafından desteklenmiştir.

Bu araştırmada uygulanan gönüllülerden alınan periferik kan, ilk Çin Tıp Üniversitesi Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (#2020-2020-237-2).
1. Reaktiflerin ve kültür ortamının hazırlanması
<ol><li>Kırmızı kan hücresi liziz tamponunu 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO 3 ,37,2mg Na2EDTA'yı 1 L çift damıtılmış suya ekleyerek hazırlayın ve pH'ı 7,2-7,4'e ayarlayın. 0,22 μm filtreler kullanarak bakteriyi filtrasyonla çıkarın.</li>
	<li>RPMI 1640 ortamına %5 fetal sığır serumu ekleyerek nötrofiller için deneysel kültür ortamı hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına dengeyi kullanın. NOT: RPMI 1640 ortamını fenol kırmızısı olmadan kullanın.</li>
	<li>1 L cam şişeye 1 L çift damıtılmış suya 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4·2H 2O ve 0,2 g KH2PO4 ekleyerek fosfat tampon salin (PBS) hazırlayın. pH'ı 7.2-7.4 olarak ayarlayın. 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlav.</li>
	<li>50 mg/mL rifampicin çözeltisi elde etmek için 10 mL dimetil sülfit (DMSO) içinde 0,5 g rifampicin tozunu eriterek rifampicin çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>1 L çift damıtılmış suya 10 g NaCl, 10 g tryptone, 5 g maya özü ve 15 g agar tozu ekleyerek LB agar çözeltisi hazırlayın ve karışımı otoklavlayın. Petri tabaklarını 100 μg/mL rifampicin içeren sıcak LB agar çözeltisini dökerek hacmin yarısına doldurun. Soğutulmuş katı plakayı 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>37 g BHI tozunu 1 L çift damıtılmış suya eriterek bakteriyel suşlara uygun beyin kalbi infüzyonu (BHI) suyu hazırlayın. pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve otomatik olarak örtün.</li>
	<li>10 mM stok çözeltisi elde etmek için floresan prob dihidroethidium'un (DHE) DMSO çözücüsünü çözün. Kullanmadan önce hafifçe karıştırın. NOT: Stok çözeltisini hemen ışığa dayanıklı şişelere aliquot. Stok çözeltisinin raf ömrü -20 °C'de 6 aydır.</li>
</ol>2. E44 bakteri suşunun hazırlanması
NOT: E44, rifampicin direncine sahip meningitik E. coli'nin mutant bir suşudur.
<ol><li>Kriyoprezer korunmuş E44 kolonisini steril bir pipet ucuyla batırın, 100 μg/mL rifampicin içeren LB agar plakasındaki E44 suşunu çizgiler çizerek aşılayın. Plakayı bir gecede 37 °C'de inkübatöre baş aşağı koyun.</li>
	<li>Deneyden bir gün önce, steril pipet ucu ile plakadan bir E44 kolonisi seçin ve 50 mL'lik bir şişede 100 μg / mL rifampicin içeren 5 mL BHI suyuna koyun. Bakteri kültürünü 37 °C'de kuluçka çalkalayıcıda 17 saat boyunca 90 rpm ile kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>3. Nötrofillerin insan periferik kanından izolasyonu
<ol><li>Antikoagülasyon için EDTA içeren vakumlu kan alma tüpüne gönüllülerden intravenöz olarak 5 mL kan örneği çekin.</li>
	<li>Periferik kan örneklerini 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin. Kan örnekleri, aşağıdan yukarıya kırmızı kan hücresi (RBC) tabakası, beyaz kan hücresi (WBC) tabakası ve plazma tabakası olan santrifüjleme ile üç katmana ayrılır.</li>
	<li>Beyaz kan hücresi tabakasını pipetle 3x RBC lizis tamponlu yeni bir tüpe epire edin. Karışımı iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika yerleştirin.</li>
	<li>Tüpü 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı tamamen aspire edin ve atın.<ol>
<li>Lizis prosedürünü RBC lizis tamponu ile 1-2 kez, çökeltme beyaza dönene kadar tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çökeltiyi 2 mL PBS ile yeniden oluşturarak hücreleri yıkayın. Daha sonra hücrelerin tüpün dibine yerleşmesine izin vermek için 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Tortuyu 50 μL önceden solumuş manyetik hücre sıralama tamponu ile yeniden yağlayarak nötrofilleri CD16 mikrobeadlarla etiketleyin. Daha sonra 50 μL insan CD16 mikropları ile iyice karıştırın. Karışımı 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Hücre yüzeyindeki antikorların kaplanmasını ve spesifik olmayan etiketlemeyi önlemek için çözeltiler önceden soğutulmalıdır. Çoğu yetişkinin mikroliter kan başına yaklaşık 4.000 ila 10.000 beyaz kan hücresi vardır ve bunların arasında nötrofiller yaklaşık% 50-70'ini oluşturur. Tahmine göre, 5 mL insan periferik kanında toplam beyaz kan hücrelerinin sayısı genellikle 2-5 x 107'ye kadardır.</li>
	<li>10 dakika boyunca 4 °C, 300 x g'da 2 mL manyetik hücre sıralama tamponu ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. Süpernatantı tamamen atın ve çökeltme kısmını 500 μL sıralama tamponu ile yeniden sunun.</li>
	<li>Manyetik sütunu ve ayırma rafını birleştirin. Ayırıcıyı manyetik sütunla rafa taşıyın ve sütunu 3 mL sıralama arabelleği ile durulayın.</li>
	<li>Manyetik boncuklar tarafından etiketlenen nötrofillerin manyetik sütuna bağlanmasına izin vermek için hücre süspansiyonunu sütuna bırakın.</li>
	<li>Etiketlenmemiş hücreleri 3 mL manyetik hücre sıralama tamponu ekleyerek 3 kez yıkayın ve sütun rezervuarının her seferinde boş olduğundan emin olun.</li>
	<li>Sütunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 15 mL'lik bir tüpe koyun. Sütuna 5 mL manyetik hücre sıralama arabelleği ekleyin. Manyetik etiketli hücreleri bir piston kullanarak dışarı itin. NOT: Nötrofillerin saflığını artırmak için sıralama adımları yeni bir sütun kullanılarak yinelenebilir.</li>
	<li>Tüpü 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin, süpernatantı tamamen atın ve çökeltmeyi 1 mL kültür ortamı ile yeniden atın. Hücre sayacıyla hücre numarasını belirleyin ve hücreleri daha fazla deneme için hazırlayın.</li>
</ol>4. ROS ölçümü
<ol><li>İzole nötrofilleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin, çökeltiyi yeniden sövün ve hücre konsantrasyonu 5 μM DHE floresan probu içeren kültür ortamı ile 2 x 106/mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>DHE probunu yüklemek için nötrofilleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından hücre süspansiyonunu kuyu başına 200 μL ile 96 kuyulu siyah bir polistiren mikro plakaya tahsis edin.</li>
	<li>Mikro plaka okuyucuyu açın ve algılama yazılımını açın. Opak 96 kuyu plaka biçimini seçin ve okuma alanını belirleyin.<ol>
<li>Floresan (Ex/Em = 518/605 nm) 37 °C'de 60 dakika boyunca her 5 dakikada bir kinetik modda ayarlayın. Her okumadan önce tabağı 3 s sallayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikro plakayı inkübatörden çıkar, 3 çoğaltmalı önceden yüklenmiş nötrofiller içeren her kuyuya kültürlü E44 (MOI=100) veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) (100 ng/mL) ekleyin. PMA'yı pozitif kontrol olarak kullanın.</li>
	<li>Plakayı mikro plaka okuyucuya yerleştirin ve tahlilleri hemen başlatın.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).</li>
<li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+%3C%2F%3D60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis%3A+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31(2019).</li>
<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li>
<li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li>
<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li>
<li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Molecules%2C+Functions+and+Pathophysiological+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li>
<li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+and+ROS-induced+ROS+release%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li>
<li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li>
<li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neutrophil%27s+Role+During+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li>
<li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases%3A+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li>
<li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Neutrophil+Oxidants%3A+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li>
<li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+%28ROS%29+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+%28ETs%29+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li>
<li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neutrophil+function+test%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li>
<li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li>
<li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mitochondrial+Mass%2C+Damage%2C+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar veya diğer çıkar çatışmaları beyan etmemektedir.

Nötrofiller, insan kan dolaşımındaki beyaz kan hücrelerinin en bol bileşeni olarak işlev görür. Patojenlerin istilasına karşı ilk savunma hattını oluşturan doğuştan gelen insan bağışıklık sisteminde önemli efektör hücrelerdir11. ROS'un üretimi, fagositoz11'itakiben nötrofillerin önemli bakterisidal mekanizmalarından birini temsil eder. Son çalışmalar, nötrofil hücre dışı tuzak (NET) adı verilen bir nötrofil tarafından salınan net benzeri bir yapının bakteri öldürme işlemi<s...

Yenidoğan bakteriyel menenjit yaygın bir pediatrik bulaşıcı hastalıktır. Bir K1 kapsülü ile Escherichia coli (E. coli), yenidoğan bakteriyel menenjite neden olan en yaygın Gram negatif patojendir ve toplam insidansin yaklaşık% 80'ini oluşturur1,2,3. Antimikrobiyal kemoterapi ve destekleyici bakımdaki gelişmelere rağmen, bakteriyel menenjit hala yüksek morbidite ve mortalite ile en yıkıcı durumlardan biridir4.
Yenidoğan bakteriyel menenjitin oluşumu genellikle patojenik bakterilerin yenidoğanların lokal lezyonlarından periferik dolaşıma girmesinden kaynaklanan bakteriyemi ile başlar, ardından kan-beyin bariyerinden (BBB) beyne nüfuz ederek menenjlerin iltihaplanmasına neden olur4. Bakteriseminin başlangıcı, nötrofiller ve makrofajlar vb. Beyaz kan hücrelerinin ~ 50-70% 'ini oluşturan nötrofiller, bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır5,6. Bakterilerin istilası sırasında, aktif nötrofiller enfeksiyöz bölgelere alınır ve süperoksit anion, hidrojen peroksit, hidroksil radikalleri ve singlet oksijen7dahil olmak üzere reaktif oksijen türlerini (ROS) serbest bırakır. ROS hücre zarı, nükleik asit molekülleri ve bakteri proteinleri ile redoks reaksiyonlarına maruz kalan ve istilacı bakterilerin yaralanmasına ve ölümüne neden olan8. Mitokondri, ökaryotik hücrelerde ROS üretiminin ana alanıdır ve çeşitli oksidazlar (örneğin, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz kompleksi, lipoksijenaz sistemi, protein kinaz C ve siklooksijenaz sistemi) ROS9,10üretimine aracılık eder. Nötrofillerdeki birincil antimikrobiyal mekanizmayı temsil eden ROS üretiminin gerçek zamanlı ölçümü, bakteri-konak etkileşimi sırasında konak savunmasını incelemek için yararlı bir yöntemdir.
Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağlı ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ros probu DHE ile ölçüldü. Bu yöntem, patojen-konak etkileşimi sırasında diğer memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>15 mL polipropilen konik santrifüj tüpleri</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3025</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>DINGGUO</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>Bio-rad</td><td>508BR03397</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik Güvenlik Karabina</td><td>Şangay Lishen</td><td>Hfsafe-1200Lcb2</td><td></td></tr><tr><td>Beyin kalp infüzyonu</td><td>BD</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Mikro boncuklar, insan</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-701</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Changsha Xiangyi</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetidyum (DHE)</td> <td>MedChemExpress</td><td>104821-25-2</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Heraeus</td><td>Hera Cell</td><td></td></tr><tr><td>MACS ayırma tamponu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)</td><td>Beyoitme</td><td>S1819-1mg</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS ayırma Ünitesi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rifampisin</td><td>Solarbio</td><td>13292-46-1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 orta</td><td>Sangon Biotech</td><td>E600027-0500</td><td></td></tr><tr><td>Termostatik çalkalayıcı</td><td>Şangay Zhicheng</td><td>ZWY-100D</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

meningitik escherichia coli ile enfekte olan nötrofillerde reaktif oksijen türlerinin gerçek zamanlı nicelemesi

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) yenidoğan menenjite neden olan en yaygın Gram-negatif bakteridir. Kan-beyin bariyeri yoluyla bakteriyemi ve bakteriyel penetrasyon oluşumu E. coli menenjit gelişimi için vazgeçilmez adımlardır. Reaktif oksijen türleri (ROS), istila edilen patojenleri yok etmek için nötrofillerin başlıca bakterisidal mekanizmalarını temsil eder. Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağımlı hücre içi ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ROS probları kullanılarak ölçüldü. Bu yöntem, patojen konak etkileşimleri sırasında memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.

Bu makalede özetlenen protokol kullanılarak, nötrofiller insan periferik kanından izole edildi ve E44 enfeksiyonuna yanıt olarak ROS seviyelerinin değişikliklerini tespit etmek için floresan probu DHE ile yüklendi. Burada, bir mikro plaka okuyucu tarafından gerçek zamanlı olarak belirlenen E44 suşu tarafından uyandırılan ROS üretimini gösteren temsili veriler sunuyoruz. 100 MOI'de E44 suşları eklenerek, ROS seviyeleri hemen arttı ve zamana bağlı bir şekilde sürekli bir yükseliş eğilimi gösterdi (Şeki...

Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli'yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli, yenidoğan menenjite neden olan en yaygın gram negatif bakteridir. Yenidoğan bakteriyel menenjitin oluşumu tamamen bakteriyemi ile başlar ve daha sonra kandaki bakteriler menenjite neden olmak için kan beyin bariyerine nüfuz eder. Nötrofiller bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır.Bakteri istilası sırasında, aktif nötrofiller ROS'yi serbest bırakır. ROS, istilacı patojenleri yok etmek için konak hücrelerin ana bakterisidal mekanizmalarını temsil eder. Nötrofillerde ROS üretimini ölçmek, bakteri-konak etkileşimi sırasında konağın savunmasına başlamak için yararlı bir yöntemdir.Steril pipet ile plakadan tek bir bakteri kolonisi alın ve içbükey bir şişede Rifampicin içeren beş mililitre Beyin-Kalp infüzyon ortamına koyun. Bakteri kültürünü 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, kuluçka çalkalayıcıda 17 saat boyunca 90 RPM ile. Periferik kan örneklerini 2000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.Santrifüjden sonra, kan örnekleri üç katmana ayrılır. Aşağıdan yukarıya, kırmızı kan hücreleri tabakası, beyaz kan hücreleri tabakası ve plazma tabakası. Beyaz kan hücreleri tabakasını steril pipetli yeni bir tüpe epire edin.Üç kat kırmızı kan hücresi liziz tamponu ekleyin. Karışımı iyice karıştırın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığına yerleştirin. Tüpü 2000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.Süpernatantı tamamen aspire edin ve atın. Çökeltiler beyazlayıncaya kadar kırmızı kan hücrelerinin liziz prosedürünü bir veya iki kez tekrarlayın. Tortuyu iki mililitre PBS ile yeniden askıya alarak hücreleri yıkayın.Sonra tüpü 1000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Tortuyu 15 milyon hücre için 15 mikroliter önkodlu manyetik hücre sıralama tamponu ile yeniden biriktirin. 15 mikroliter manyetik mikrobead ekleyin ve iyice karıştırın.Karışımı 30 dakika boyunca dört santigratta kuluçkaya yatırın. Normal koşullar altında, yetişkin insan mikroliter kan başına yaklaşık 4 ila 10.000 beyaz kan hücresine sahiptir. Yani beş mililitre insan periferik kanındaki toplam beyaz kan hücrelerinin maliyeti, neredeyse 50 milyondan az.Ve 15 mikroliter manyetik ayırma tamponunda 50 mikroliter manyetik boncuk yeterlidir. Nötrofillerin normal yüzdesi toplam beyaz kan hücrelerinin% 50 ila 70'idir. Yani beş mililitre kandan yaklaşık 10 milyon nötrofil elde edilebilir.Tüpe 10 milyon hücre başına iki mililitre manyetik sıralama tamponu ve 10 dakika boyunca dört santigrat, 1.200 RPM'de santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. Manyetik sütunu ve ayırma rafını birleştirin. Süpernatantı tamamen atın ve tortuları 100 milyon hücreye kadar 500 mikroliter manyetik sıralama tamponu ile yeniden biriktirin.Sütunu üç mililitre manyetik sıralama arabelleği ile durulayın. Sütuna bağlı manyetik boncuklar tarafından etiketlenmiş nötrofillere izin vermek için hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın. Sütun rezervuarı her seferinde boşaldıktan sonra, üç kez üç mililitre arabellek ekleyerek spesifik olmayan belirli hücreleri yıkadı.Sütunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir tüpe koyun. Sütuna beş mililitre manyetik sıralama arabelleği ekleyin. Manyetik etiketli hücreleri bir piston kullanarak dışarı itin.Tüpü 1,200 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı tamamen emiş ve tortuyu bir mililitre kültür ortamı ile yeniden canlandırmak. Sayaçla hücre numarasını belirleyin.DHE floresan probu içeren kültür ortamında hücre konsantrasyonu mililitre başına 2 milyon olarak ayarlandı. DHE probını yüklemek için nötrofilleri 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Hücre süspansiyonu, kuyu başına 200 mikroliter ile 96 kuyulu siyah bir mikro plakaya tahsis edin.Mikro plaka okuyucuyu açın. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın, floresan okuma modunu, kinetik okuma türünü seçin, floresan dalga boyunu ayarlayın. Plaka biçimini seçin.Okuma alanını belirleyin. Bir saat boyunca her beş dakikada bir floresan yoğunluğunu ölçün. Her okumadan önce tabağı üç saniye sallayın.Kuvözdeki mikro plakayı çıkar. Üç tekrarlı PMA veya E44 suşları ekleyin. Plakayı mikro plaka okuyucuya koyun, teste hemen başlamak için başlat düğmesine basın.Bu makaledeki protokol ana hatlarını kullanarak, nötrofiller insan periferik kanından izole edildi ve floresan probu DHE ile yüklendi. Nötrofillerde hücre içi ROS PMA eklenerek 20 dakikadan 40 dakikaya kadar önemli bir artış gösterdi ve 60 dakikada zirveye ulaştı. Ancak E44'ün zorlandığını, ROS üretiminin hemen gerçekleştiğini ve zamanı bağımlı olarak artırdığını düşünüyorum.E44 suşunun neden olduğu ROS ifadesi PMA'nın neden olduğu ifadeye benzer. Nötrofillerde ROS üretiminin tespiti, nötrofillerin bakteriyoidal mekanizmalarının daha fazla incelenmesine katkıda bulunabilir. Bu protokolde nötrofillerdeki ROS üretimini gerçek zamanlı olarak tespit etmenin daha kolay bir yolunu sunuyoruz.Basit yöntem, konak bakteri etkileşimleri sırasında diğer konak hücre tiplerinde ROS üretimini izlemek için de kullanılabilir.

real-time-quantification-reactive-oxygen-species-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Neisseria meningitidis (Nm), gram negatif bir insana özgü solunum patojen, insan α-aktinin bağlayabilirsiniz . Burada insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) içine bakteriyel girmesinden sonra intraselüler α-aktinin bakterinin colocalisation görselleştirilmesi için bir protokol mevcut.

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis</emKonfokal Görüntüleme α-aktinin> ve İnsan

Bu videoda, opsonize bir bakteriyel biyofilme maruz kaldıktan sonra nötrofiller tarafından reaktif oksijen türlerinin oluşumunu tespit etmek için bir in vitro kemilüminesans testi gösteriyoruz.

Opsonize Biyofilm ile Etkileşim Üzerine Nötrofiller Tarafından ROS Üretiminin Belirlenmesi

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda...

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

Biz, kalitatif ve kantitatif çalışmalar için çeşitli amoeba ve memeli hücre modellerinde uygulanabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçümü için protokoller kümesi uyarlanmıştır.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Neonatal farelerin biyolüminesans E. coli O1:K1:H7 ile enfeksiyonu, önemli pulmoner inflamasyon ve akciğer patolojisi ile septik enfeksiyona neden olur. Burada, sistemik bakteriyel yüklerin numaralandırılmasına paralel olarak uzunlamasına intravital görüntüleme, inflamatuar profilleme ve akciğer histopatolojisi ile birlikte neonatal sepsisin modellenmesi ve incelenmesi için yapılan prosedürleri açıklıyoruz.

Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli

Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC'ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.

Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

Mevcut protokol, nötrofil-biyofilm etkileşimlerinin incelenmesini açıklamaktadır. Staphylococcus aureus biyofilmleri in vitro olarak kurulur ve periferik kan kaynaklı insan nötrofilleri ile inkübe edilir. Nötrofillerden oksidatif patlama tepkisi ölçülür ve biyofilm içindeki nötrofil lokalizasyonu mikroskopi ile belirlenir.

İnsan Nötrofiller ve Staphylococcus aureus Biyofilmleri Arasındaki Etkileşimleri Görselleştirmek ve Ölçmek için Standartlaştırılmış In vitro Testler

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Öğrenin, menenjitik Escherichia coli ile enfekte nötrofillerde reaktif oksijen türlerinin gerçek zamanlı nicelemesi için floresan prob ve mikroplaka okuyucu kullanan bu yöntemi. Bağışıklık ve mikrobiyoloji araştırmalarında konak-patojen etkileşimlerini incelemek için uygundur.

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Daha fazla video keşfet