Somitogenezi Yöneten Sinyal Salınımlarının Fonksiyonel Olarak İncelenmesi İçin Bir Mikroakışkan Yaklaşımı

Çok hücreli sistemleri kontrol eden sinyal yolları dinamiktir. Bu dinamiklerin işlevini anlamak için, genel sinyal aktivitesini etkilemeden bu dinamikleri ince bir şekilde modüle edebilmek önemlidir. Bu protokol, gelişmekte olan fare embriyolarında sinyal salınımlarının fonksiyonel diseksiyonuna izin veren mikroakışkan bir sistem kullanır.

Sinyal dinamikleri, yetişkin olanlar da dahil olmak üzere birçok dokuda bulunmuştur. Mikroakışkanlar, hücre, doku ve organoid kültürler dahil olmak üzere birçok model sistemine uyacak şekilde uyarlanabilen çok yönlü bir araçtır. Başlamak için, polimerizasyonu indüklemek için monomeri katalizörle dokuz-bir oranında karıştırarak gerekli miktarda PDMS'yi hazırlayın.

Tek kullanımlık aletler kullanın ve karıştırmanın uygun şekilde yapıldığından emin olun. PDMS karışımını bir kurutucuya yerleştirin ve havayı gidermek için yaklaşık 30 dakika vakumlayın. Talaş kalıbına yaklaşık üç ila beş milimetrelik bir PDMS tabakası dökün ve yaklaşık 30 dakika boyunca kurutucuya geri yerleştirin.

Kalıbı, kalıp malzemesine bağlı olarak gece boyunca 65 santigrat derece veya daha düşük bir sıcaklıkta bir fırına yerleştirerek kürleyin. Bir neşter kullanarak çipi kalıptan kesin. Giriş ve çıkış deliklerini, mikroakışkan haznenin içinden başlayarak bir milimetre biyopsi zımba ile delin.

Cam sürgüyü basınçlı hava ile temizleyin. Çipi cam kızağa yapıştırmak için, çipi ve cam kaydırağı, yapıştırılacak yanlar yukarı bakacak şekilde plazma fırınına yerleştirin. Kullanılan makineye özgü protokolü kullanarak plazma oluşturun, ardından aktif yüzeyleri birbirine yerleştirerek ve eşit şekilde basınç uygulayarak çipi cama bağlayın.

Tüpü ve talaşını deneye hazırlamak için, boruyu 45 derecelik bir açıyla kesin ve tüplerin her birine bir iğne takın. Boruyu iğnelerle, çiple ve tapalarla bir kaba yerleştirin ve yaklaşık 15 dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakarak sterilize edin. Çipi fibronektin ile kaplamak için, çipi oda sıcaklığında PBS artı% 1 penisilin veya streptomisin içeren bir beher içine yerleştirin.

P200 pipetle havayı temizlemek için çipi PBS ile yıkayın. Çipin her odası için üç mililitrelik bir şırınga yükleyin. İğneyi fibronektin içeren şırıngaya takın ve şırıngayı şırınga pompasına bağlayın.

Havayı çıkarmak için boruyu manuel olarak yıkayın. Çıkış borusunu çipin çıkışına takın. Boruyu dibe kadar ittiğinizden ve çipi kaplamak için düşük bir akış hızı ayarladığınızdan emin olun.

Şırınga pompasının en az iki saat veya gece boyunca çalışmasına izin verin. İşiniz bittiğinde, pompayı durdurun ve iğneden hemen sonra boruyu kesin. Deney için ortamla doldurulmuş şırıngalar hazırlayın ve PBS içinde hem kültür ortamını hem de çipi gazdan arındırın.

Hava kabarcıklarının çoğunu çipten temizlemeye veya emmeye çalışın, ardından şırıngaları pompalara takın ve giriş borusunu şırıngalara takın. Çip üzerine doku yüklemek için, kuyruğun en arka ucunu disseke edin. PBS'yi çıkarmak için çipi 25 mikromolar HEPES ile kültür ortamıyla yıkayın.

P200 pipet kullanarak mendili çipin içine yükleyin. Her doku yükleme adımından sonra, PDMS dolu bir boru parçası kullanarak ilgili doku yükleme girişini kapatın. Mikroakışkan kurulumunu monte etmek için, içeride hava kabarcıkları olmadan mikroakışkan çipe boru takın.

Bunu yapmak için, borunun sonunda bir damla orta olduğundan emin olun. Tüm borular çipe tutturulduktan sonra, beherden çıkarın ve ıslak bir doku içeren bir kaba yerleştirin. Çanağı ve yaklaşık 1,5 metre giriş borusunu gece kültürü için bir inkübatöre koyun.

Kültür sırasında hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için yüksek nem sağlayın. Alternatif olarak, çipin dışını kurutun ve bir mikroskop tutucusuna yerleştirin, ardından tutucuyu ve yaklaşık 1,5 metrelik giriş borusunu, canlı bir görüntüleme deneyi için ters çevrilmiş bir mikroskobun kuluçka odasına koyun. En az 20 dakikalık sabit akıştan sonra, deney için planlanan pompalamaya başlayın.

Parçalama fare embriyosunda çentik sinyalini yerleştirmek için, deneyin sonuna kadar, tipik olarak 24 saat boyunca tekrarlanan 100 dakikalık orta ve 30 dakikalık ilaç darbelerinden oluşan bir pompalama programı kullanın. Gerçek zamanlı görüntüleme için, en az 30 dakika sonra görüntülemeye başlayın. Sinyal salınımlarının sürüklenmesini doğrulamak için, ilaç darbelerinin zamanlaması kullanılarak çoklu deneyler hizalanır ve Cascade Blue boyası ile görselleştirilir.

Niceliksel salınımlar trendden düşülebilir ve ortalama ve standart sapma veya salınımların fazları olarak görüntülenebilir. Bağımsız posterior embriyo kültürlerinin birbirleriyle ve eksternal ilaç darbeleriyle salınımları arasındaki faz ilişkisi analiz edilebilir. Sürüklenmeyi doğrulamak için, örneğin Python tabanlı pyBOAT programını kullanarak endojen sinyal salınımlarının periyodu belirlenebilir.

130 dakikalık bir periyotla darbeler uygulanırken, çentik sinyal salınımları da 130 dakikalık bir süre gösterir. Mikroakışkan deneyi sırasında sıvının buharlaşmasını önlemek çok önemlidir. Aksi takdirde, çipte orta akışa müdahale eden hava kabarcıkları oluşacaktır.

Bunu önlemek için, ortamı ve çipi gazdan arındırın ve inkübatördeki nemin yeterince yüksek olduğundan emin olun. Bu yöntem kullanılarak, sinyal dinamikleri modüle edilebilir ve etkileri, floresan muhabirlerin gerçek zamanlı görüntülenmesi, immün boyama veya in situ hibridizasyon ile analiz edilebilir. Ayrıca, doku daha fazla analiz için çipten de çıkarılabilir.

Bu yöntem, embriyonik gelişimde sinyal salınımlarının işlevini incelemek için kullanılabilir. Fare embriyosunun segmentasyonu için iki salınımlı sinyal yolu arasındaki faz kaymasının önemini göstermek için uygulandı. Daha genel olarak, şimdi çok hücreli sistemlerde dinamik sinyal kodlama mekanizmasını incelemek için kullanılabilir.