Name: Somitogenezi Yöneten Sinyal Salınımlarının Fonksiyonel Olarak İncelenmesi İçin Bir Mikroakışkan Yaklaşımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Keşfedin fare embriyolarında somitogenezi yöneten sinyal salınımlarının fonksiyonel analizi için mikroakışkan yaklaşım. Bu yöntem, endojen osilasyonların hassas modülasyonu ve senkronizasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kalıpların 3D baskısı konusunda yardım için UMC Utrecht'ten Yang Li ve Jos Malda'ya, protokol hakkında çok yararlı geri bildirimler için Sonnen grubundan Karen van den Anker'e ve mikroskop içindeki mikroakışkan çiplerin tutucusu için Hubrecht Enstitüsü'ndeki mekanik atölyeden Tjeerd Faase'ye minnettarız. Tüm Sonnen grubuna makalenin eleştirel okuması için ve hakemlere yapıcı geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi'nden K.F.S.'ye 850554 numaralı ERC başlangıç hibe anlaşması kapsamında fon aldı.

<ol><li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-cell+live+imaging+links+HES5+dynamics+with+cell-state+and+fate+in+murine+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jag1+modulates+an+oscillatory+Dll1-Notch-Hes1+Signaling+module+to+coordinate+growth+and+fate+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors.</a> Developmental Cell. , 1-17 (2020).</li>
<li>Hubaud, A., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a+plays+a+major+role+in+the+segmentation+clock+controlling+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%CE%B2-catenin+gradient+links+the+clock+and+wavefront+systems+in+mouse+embryo+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+and+propagation+of+Hes7+oscillation+are+cooperatively+regulated+by+Fgf+and+Notch+signaling+in+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock.</a> Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+types+of+oscillations+in+notch+and+Fgf+signaling+regulate+the+spatiotemporal+periodicity+of+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis.</a> Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).</li>
<li>Sonnen, K. F., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signal+encoding+-+From+cells+to+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic signal encoding - From cells to organisms.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).</li>
<li>Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+acts+upstream+of+the+NOTCH+and+WNT+signaling+pathways+to+control+segmentation+clock+oscillations+in+mouse+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis.</a> Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).</li>
<li>Sonnen, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+shift+between+Wnt+and+Notch+signaling+oscillations+controls+mesoderm+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation.</a> Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).</li>
<li>Sonnen, K. F., Merten, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+an+emerging+precision+tool+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology.</a> Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).</li>
<li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).</li>
<li>Cimetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+generating+stable+concentration+gradients+for+long+term+cell+culture%3A+Application+to+Wnt3a+regulation+of+%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling.</a> Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).</li>
<li>Demers, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development-on-chip%3A+In+vitro+neural+tube+patterning+with+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device.</a> Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Frank, T., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-switching+allows+independently+programmable%2C+extremely+stable%2C+high-throughput+diffusion-based+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).</li>
<li>Tay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+NF-B+dynamics+reveal+digital+activation+and+analogue+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing.</a> Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160 (3), 381-392 (2015).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+positioning+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subcellular positioning of small molecules.</a> Nature. 411 (6841), 1016(2001).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+treatment+of+cellular+microdomains+using+multiple+laminar+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams.</a> Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).</li>
<li>Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+pipeline+for+systematic+modulation+and+analysis+of+3D+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments.</a> Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).</li>
<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
<li>Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineers+are+from+PDMS-land%2C+biologists+are+from+polystyrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).</li>
<li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).</li>
<li>Lo, J. F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+temporal+control+of+oxygen+microenvironment+at+the+single+islet+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).</li>
<li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+of+developing+C.+elegans+larvae+with+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li>
<li>Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Drosophila+embryonic+patterning+network+perturbed+in+space+and+time+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics.</a> Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. , (2020).</li>
<li>Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D%C2%B5F+-+Interactive+design+environment+for+continuous+flow+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Yoshioka-kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+delay+controls+synchronized+oscillation+in+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock.</a> Nature. 16, (2019).</li>
<li>Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+time+frequency+analysis+for+biological+data+-+pyBOAT%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+Interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Dettinger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microfluidic+system+for+dynamic+stimulation+and+tracking+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).</li>
<li>Manfrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+signaling+centers+for+the+spatially+controlled+patterning+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).</li>
<li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 965, 960-965 (2019).</li>
<li>Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for%3A+Caenorhabditis+elegans+culture+and+oxygen+consumption+rate+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements.</a> Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Sinyal dinamiğinin çok hücreli sistemleri nasıl kontrol ettiği, bu alanda uzun süredir devam eden bir soru olmuştur. İşlevsel araştırma önemli bir zorluk teşkil eder, çünkü bu dinamiklerin buna izin vermek için ince bir şekilde modüle edilmesi gerekir11. Yol pertürbasyonları üzerindeki bu tür zamansal kontrol, prensip olarak, yüksek bir mekansal kontrol sağlayan optogenetik ile sağlanabilir34. Bununla birlikte, optogenetik, söz konusu her sinyal yolunun analizi için sofistike genetik araçların kurulmasını gerektirir. Burada açıklanan mevcut protokol, herhangi bir sinyal yolunun bozulması için çok yönlü bir araç sağlar. Mikroakışkanlar deneyi, doku kültürlerinde sinyal yolaklarının dinamiklerini fonksiyonel olarak araştırmak için geçici olarak kontrol edilen ilaç darbelerinin uygulanmasına izin verir. Burada, odak noktası ex vivo kültürlerde somitogenezin incelenmesidir, ancak protokol diğer model sistemlere uyacak şekilde uyarlanabilir.
Protokoldeki belirli adımlar, başarılı bir mikroakışkanlar deneyi gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir (Tablo 1'de özetlenmiştir). Anahtar noktalar aşağıdaki gibi tartışılmaktadır. Deney sırasında orta akış nedeniyle, doku kültürü kayma stresi yaşar. Model sistemin sürekli akışa maruz kalması, hücre stresine ve aşırı durumlarda kesme etkisine bağlı hücre ölümüne neden olabilir. Fare kuyruk tomurcuklarının ex vivo doku kültürleri ve mevcut çip tasarımı için, 60 μL / s'lik bir akış hızının (maksimum 100 μL / s) minimum kesme etkisiyle iyi çalıştığı bulunmuştur. Aynı talaş için birden fazla pompa aynı anda açıldığında, toplam debide bir artışa neden olmamak için her bir pompanın akış hızının buna göre ayarlanması gerekir. Mevcut protokol diğer model sistemlere ve çip tasarımlarına uyarlandığında, akış hızı optimize edilmelidir. Alternatif olarak, ortamı sürekli olarak yıkamamak, ancak çip üzerindeki ortamı periyodik olarak değiştirmek mümkündür35. Böyle bir kurulum, fare somitogenezindeki sinyal salınımlarını kontrol etmek için de uygulanabilir (yayınlanmamış, veriler gösterilmemiştir). Dahası, doku kültürlerinin doğrudan sıvı akışına maruz kalmadığı, ancak ilaçların komşu bir kanaldan difüzyon yoluyla dokuya ulaştığı bir kurulum da öngörülebilir. Bu tür sistemler, büyüme faktörlerinin gradyanlarını ESC farklılaşmasının in vitro modellerine uygulamak için başarıyla kullanılmıştır14,36.
Mikroakışkan deneylerin önemli bir konusu, deney sırasında çip üzerinde hava kabarcıklarının oluşmasıdır. Talaş veya boru içindeki hava kabarcıkları, çip üzerindeki düzgün sıvı akışına müdahale edebilir ve embriyo kültürünün bulunduğu yerden uzaklaştırılmasına neden olabilir. Hava kabarcıklarının varlığını önlemek için, protokolün çeşitli adımları vazgeçilmezdir. İlk olarak, şırıngalar içindeki kültür ortamı ve mikroakışkan çipin kendisi bir kurutucu kullanılarak gazdan arındırılmalıdır (adım 3.1.3). İkinci olarak, numuneleri yükleme girişlerine yüklerken, numuneyle birlikte çipe hava pipetlememeye dikkat edilmelidir (adım 3.2.3). Üçüncüsü, boruyu ortamla doldururken, çip takılmadan önce tüm hava kabarcıkları dışarı pompalanmalıdır (adım 3.3.2). Aksi takdirde, bu kabarcıklar deney sırasında ana çipe itilecektir. Son olarak, deney sırasında, yarı geçirgen boru nedeniyle ortam görüntüleme odası veya inkübatör içinde dengelenir. Borunun geçirgenliği aynı zamanda ortamın buharlaşmasına da izin verir, bu nedenle tüpte yeni kabarcıkların oluşumunu önlemek için deney sırasında nemin düzenlendiğinden emin olun.
Genel olarak, mikroakışkanlar, araştırmacının özel sorusuna uyarlanabilen çok yönlü bir araçtır. Mevcut tasarım yaklaşımı, çip başına paralel olarak 12 adede kadar ex vivo kültürün görüntülenmesini sağlar. Bu sayı esas olarak deney başına embriyo sayısı ve her embriyo kültürünü yeterli çözünürlükte görüntülemek için gereken süre ile sınırlıdır. Tek bir deneyde birden fazla koşulun karşılaştırılması gerekiyorsa, tek bir cam slayta birden fazla talaş monte edilebilir. Birden fazla doku eksplantının paralel olarak görüntülenmesi için ideal olan bir çip tasarımı sağlanır, ancak kişiselleştirilmiş tasarımlar, yüksek verim analizine izin vermek ve tek bir deneyde daha fazla koşulun kombinasyonunu artırmak için numune sayısındaki sınırlamaların üstesinden gelebilir16,17. Mikroakışkanlar, bir çip üzerinde kültürlenebilen modellerle sınırlıdır ve çip üzerindeki kültürün her model sistemi için ayrı ayrı optimize edilmesi gerekecektir27,37,38.
Son 5-10 yılda, mikroakışkanlar, yüksek verimli yaklaşımlar ve sinyal dinamikleri ve gradyanlarının ince modülasyonları için potansiyeli nedeniyle çeşitli biyolojik soruları ele almak için uygulanmıştır. Günümüzde mikroakışkanlar, laboratuvarların kolaylıkla kurabileceği kolay uygulanabilir, ucuz ve çok yönlü bir araç haline gelmiştir. Burada, mevcut protokol belirli bir uygulama için, yani somitogenezi yöneten sinyal dinamiklerini incelemek için optimize edilmiştir. Bu protokolü ve tasarımı, doku biyolojisindeki bireysel araştırma sorularına uyacak şekilde uyarlamak kolaydır.

Gelişim, sinyal yolları aracılığıyla hücreler arası iletişim ile kontrol edilir. Dokuların karmaşık oluşumunu ve uzay ve zamanda uygun hücre farklılaşmasını düzenleyen sınırlı sayıda sinyal yolu vardır. Bu çok sayıda süreci düzenlemek için, bilgi bir sinyal yolunun dinamiklerinde, bir sinyalin frekansı veya süresi gibi zaman içinde bir yolun değişiminde kodlanabilir1,2.
Somitogenez sırasında, somitik doku periyodik olarak presomitik mezodermden (PSM) ayrılır3. PSM, Wnt, Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF) ve Retinoik asit sinyalizasyonu gradyanları tarafından mekansal olarak düzenlenir. Wnt ve FGF sinyallerinin düşük olduğu belirleme cephesindeki anterior PSM'de, hücreler somitlere farklılaşmak üzere hazırlanır. Farklılaşma, bir transkripsiyonel aktivasyon dalgası bu belirleme cephesine ulaştığında meydana gelir. PSM içinde Wnt, FGF ve Notch sinyal salınımı olur. Komşu hücreler fazın biraz dışına salınır, bu da Wnt, FGF ve Notch yollarının posteriordan anterior PSM'ye giden salınımlı transkripsiyonel aktivasyon dalgalarıyla sonuçlanır. Fare embriyolarında, bir transkripsiyonel dalga yaklaşık her 2 saatte bir belirleme cephesine ulaşır ve somit oluşumunu başlatır. Sinyal yollarını bozarak veya aktive ederek somitogenezi incelemek, bu yolların önemini gösterebilir4,5,6,7,8,9. Bununla birlikte, hücresel davranışın kontrolünde sinyal dinamiklerinin işlevini araştırabilmek için, sinyal yollarını kalıcı olarak aktive etmek veya inhibe etmek yerine ince bir şekilde modüle etmek önemlidir.
Segmentasyon faresi embriyosundaki sinyal yolu aktivitesini geçici olarak modüle etmek için, Sonnen ve ark. mikroakışkan bir sistem geliştirmiştir10. Bu sistem, biyolojik numuneyi içeren bir çipin mikro kanalları içindeki sıvı akışlarının sıkı bir şekilde kontrol edilmesini sağlar11. PSM'nin uygun şekilde segmentasyonu için sinyal dinamiklerinin önemini incelemek için, bu mikroakışkan kurulumu, fare segmentasyon saatinin sinyal dinamiklerini ex vivo olarak modüle etmek için kullanılır. Yol aktivatörleri veya inhibitörleri kültür odasına sırayla darbelendirerek, Wnt, FGF ve Notch sinyalizasyonunun dinamiklerinin dış kontrolü sağlanır10. Örneğin, bireysel yolların periyodunu ve çoklu salınımlı sinyal yolları arasındaki faz ilişkisini değiştirmek mümkündür. Dinamik sinyal muhabirlerinin eşzamanlı gerçek zamanlı görüntülemesi kullanılarak, sürüklenmenin yolakların kendileri, farklılaşma ve somit oluşumu üzerindeki etkisi analiz edilebilir. Sinyal dinamikleri üzerindeki bu kontrol seviyesi kullanılarak, somitogenez sırasında Wnt- ve Notch-sinyal yolları arasındaki faz ilişkisinin önemi vurgulanmıştır10.
Kişiselleştirilmiş çip tasarımları, yerel ortamdaki mekansal zamansal pertürbasyonlar için çok sayıda seçeneğe izin verir, örneğin, kararlı gradyan oluşumu12,13,14,15, pulsatil aktivasyon/inhibisyon10,16,17,18 veya lokalize pertürbasyonlar19,20 . Mikroakışkanlar ayrıca deneysel kullanımın otomasyonu sayesinde daha tekrarlanabilir bir okuma ve daha yüksek verim sağlayabilir21,22,23. Mevcut protokol, mikroakışkanları ve dokulardaki endojen sinyal salınımlarının sürüklenmesini her standart yaşam bilimleri laboratuvarına getirmeyi amaçlamaktadır. Temiz oda ve yumuşak litografi ekipmanı gibi çip üretimi için sofistike ekipmanların yokluğunda bile, mikroakışkan çipler biyolojik soruları ele almak için üretilebilir ve kullanılabilir. Kalıplar, serbestçe kullanılabilen bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak tasarlanabilir. Genellikle polidimetilsiloksandan (PDMS) oluşan mikroakışkan çiplerin üretimi için bir kalıp, bir 3D yazıcı ile basılabilir veya baskı şirketlerinden sipariş edilebilir. Bu şekilde, mikroakışkan çipler pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymadan bir gün içinde üretilebilir24. Burada, iki boyutlu (2D) ex vivo kültürlerde25 fare segmentasyon saatinin sürüklenmesi için bir kalıbın bir 3D yazıcı ile basılabileceği bir çip tasarımı sağlanmıştır.
Mikroakışkanlar tarafından sağlanan çip üstü kültürler ve hassas pertürbasyonlar, sinyal yollarının çok hücreli davranışı nasıl kontrol ettiğinin moleküler mekanizmalarını çözmede olağanüstü bir potansiyele sahiptir. Sinyalizasyon dinamikleri ve morfojen gradyanları, gelişimdeki birçok süreç için gereklidir. Daha önce, laboratuvarlar mikroakışkan çiplerde kültürlenmiş hücrelere, dokulara ve tüm organizmalara sahipti ve öncelikle 2D hücre kültürünün mekansal zamansal pertürbasyonu için protokoller başka bir yerde sağlanmıştır12,26,27,28,29. Çok hücreli sistemlerde yerel ortamları modüle etmek için mikroakışkanların uygulanması, yüksek verimli ve hassas mekansal zamansal bozulmalar için yeni perspektifler açar. Mikroakışkanlar alanı artık gelişimsel biyologlar için uzman olmayan, ucuz ve kolayca uygulanabilir bir araç haline geldiği bir noktaya ulaşmıştır.
Burada, fare segmentasyon saatinin bir Çentik sinyal inhibitörünün darbelerine sürüklenmesi için bir protokol sağlanmıştır. Böyle bir deney aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) mikroakışkan çipin üretilmesi, (2) çipin boru ve kaplamasının hazırlanması ve (3) mikroakışkan deneyin kendisi (Şekil 1A). Omurgalı model sistemlerini içeren araştırmalar, sorumlu komiteden önceden etik onay gerektirir.

<table><tbody><tr><td>10 mL şırınga</td><td>Becton, Dickinson ve şirketi</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>184 Silikon Elastomer kürleme maddesi</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>184 Silikon Elastomer PDMS</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>3 ml şırınga</td><td>Becton, Dickinson ve şirket</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan bant</td><td></td><td></td><td>Scotch Magic bant veya benzeri</td></tr><tr><td>Künt uçlu forseps Bochem 18/10 Paslanmaz çelik</td><td>Fisher Scientific</td><td>10663341</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu albümini Liyofilize pH ~ 7</td><td>Biowest</td><td>P6154</td><td></td></tr><tr><td>Basınçlı hava sistemi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristalleştirici kap</td><td>VWR</td><td>10754-7</td><td>Sterilize</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz %45</td> <td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td>VWR</td><td>467-0104</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık bardaklar</td><td>Duni</td><td>173 941</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık çatallar</td><td>Zımba</td><td>511514</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon ekipmanı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hücre kültürü teknolojileri</td><td>özel</td><td>DMEM/F-12, fenol kırmızısı yok, L-glutamin yok, Glikoz</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>yok Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Akış başlığı BioVanguard Greenline</td><td>CleanAir by Baker</td><td>511514</td><td>UV ışık kaynağı için</td></tr><tr><td>Cam slayt No 1.5H yüksek hassasiyetli, 70x70 mm</td><td>Marienfeld</td><td>107999098</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Leica</td><td>Leica SP8 MP</td><td></td></tr><tr><td>İğneler 22G</td><td>Becton, dickinson ve şirket</td><td>z412139-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Fırın</td><td>VWR</td><td>390-09</td><td></td></tr><tr><td>PBS0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Plazma fırını Femto</td><td>Diener elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punch & Oslash; 1mm</td><td>Tek Çekirdekli</td><td>WB100073</td><td></td></tr><tr><td>Ölçekli</td><td>Sartorius</td><td>Entris</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>WPI</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Boru ve Oslash; 1mm</td><td>APT</td><td>AWG24T</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası</td><td>VWR</td><td>181-0308</td><td></td></tr></tbody></table>

somitogenezi yöneten sinyal salınımlarının fonksiyonel olarak İncelenmesi İçin bir mikroakışkan yaklaşımı

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

Gelişmekte olan bir fare embriyosunun presomitik mezoderminin periyodik segmentasyonu, bir sinyal yolları ağı tarafından kontrol edilir. Sinyal salınımlarının ve gradyanlarının sırasıyla segment oluşumunun zamanlamasını ve aralığını kontrol ettiği düşünülmektedir. İlgili sinyal yolları son yıllarda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, somitogenezi kontrol etmede sinyal salınımlarının işlevi için doğrudan kanıtlar eksiktir. Sinyal dinamiklerinin işlevsel olarak araştırılmasını sağlamak için, mikroakışkanlar bu dinamiklerin ince modülasyonu için önceden kurulmuş bir araçtır. Bu mikroakışkan tabanlı sürüklenme yaklaşımı ile endojen sinyal salınımları, yol modülatörlerinin darbeleri ile senkronize edilir. Bu, örneğin salınım periyodunun veya iki salınımlı yol arasındaki faz ilişkisinin modülasyonunu sağlar. Ayrıca, sinyal gradyanlarındaki spesifik değişikliklerin somitogenezi nasıl etkilediğini incelemek için yol modülatörlerinin uzamsal gradyanları doku boyunca kurulabilir.
Mevcut protokol, mikroakışkanların ilk kez kullanıcıları için mikroakışkan yaklaşımların oluşturulmasına yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Bir mikroakışkan sistem kurmak için gereken temel prensipler ve ekipmanlar tanımlanmıştır ve çip üretimi için bir kalıbın bir 3D yazıcı kullanılarak kolayca hazırlanabileceği bir çip tasarımı sağlanmıştır. Son olarak, birincil fare dokusunun mikroakışkan bir çip üzerinde nasıl kültürleneceği ve sinyal salınımlarının yol modülatörlerinin dış darbelerine nasıl bağlanacağı tartışılmaktadır.
Bu mikroakışkan sistem, diğer bağlamlarda sinyal dinamiklerinin ve morfojen gradyanlarının fonksiyonel olarak araştırılması için gastruloidler ve organoidler gibi diğer in vivo ve in vitro model sistemlerini barındıracak şekilde de uyarlanabilir.

Bu protokolle, mikroakışkanlar kullanılarak fare segmentasyon saatinin sinyal salınımlarının harici olarak sürüklenmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Çentik sinyal inhibitörünün darbeleri uygulanarak, bağımsız embriyo kültürlerindeki sinyal salınımları birbirleriyle senkronize edilir10. Bu sistemin segmentasyon saatinin işlevselliğini incelemek için uygulanmasının ön koşulu, sinyal dinamiklerinin ve segmentasyonun çip üzerinde hala mevcut olmasıdır. Daha önce hem Wnt hem de Notch sinyal dinamiklerinin sabit orta akışa rağmen korunduğu ve fiziksel sınır oluşumunun periferik 2D kültürlerde devam ettiği ve ön PSM10'u temsil ettiği gösterilmiştir.
Sinyal salınımlarının harici ilaç darbelerine sürüklenmesini doğrulamak için, örneğin mikroakışkan deney sırasında sarı floresan proteini Venüs'ü ifade eden Çentik sinyal muhabiri LuVeLu5'in gerçek zamanlı görüntülenmesi gerçekleştirilir. 2D kültürlerin çip üzerindeki oryantasyonunu kontrol etmek zor olduğundan, ön dokudaki sinyal salınımları analiz edilir. 2B kültürün çevresi yeniden üretilebilir şekilde tespit edilebilir. Çip üzerindeki doku kesitlerinin oryantasyonu istenildiği zaman kontrol edilemez ve çipin tüm iç yüzeyi Fibronektin ile kaplanır. Bu nedenle, bazen kültürlerin çipin yanlarına veya tavanına tutturulması olur. Numunelerin görüş alanının dışına çıkması durumunda (x, y ve z yönünde) veya kuyruğun arka ucu aşağı bakacak şekilde yapışırsa, genellikle bu örnekler hariç tutulur.
Daha fazla analiz için, bu tür sürüklenme deneylerinin birçoğu birleştirilmiştir. Bağımsız deneyler, yaklaşık 400 nm'de Cascade Blue boyası tarafından görselleştirilen ilaç darbelerinin zamanlaması kullanılarak birbirleriyle hizalanabilir. Senkronizasyonu analiz etmek ve görselleştirmek için, niceliksel salınımlar trendden arındırılabilir (Şekil 2B, D) ve daha sonra ortalama ve standart sapma olarak görüntülenebilir veya salınımların fazları hesaplanabilir. Bu, bağımsız posterior embriyo kültürlerinin birbirlerine ve eksternal ilaç darbelerine salınımları arasındaki faz-ilişkinin analizini sağlar (Şekil 2C, E). Python tabanlı pyBOAT33 programı, bu tür sinyal salınımlarının periyodunu, fazını ve genliğini belirlemek için basit ve kullanıcı dostu bir araçtır. Sürüklenmeyi doğrulamak için, örneğin, endojen sinyal salınımlarının periyodu belirlenebilir. 130 dakikalık bir periyotla darbeler uygulanırken, Çentik sinyal salınımları da 130 dakikalık bir periyot gösterir (Şekil 2F)10. Ek olarak, Cascade Blue darbeleri kullanılarak, farklı sinyal muhabirleriyle yapılan bağımsız deneyler birbirine hizalanabilir. Bu şekilde, çoklu sinyal muhabirlerinin salınımları arasındaki faz-ilişki dolaylı olarak belirlenebilir10.
Böylece, sunulan mikroakışkan sistem, gelişmekte olan fare embriyosunun ex vivo kültürlerinde sinyal salınımlarının kontrolüne izin verir. Segment oluşumu ve farklılaşması için belirteçlerin görüntülenmesi ile birlikte, bu sistem artık segmentasyon saatinin sinyal yollarının nasıl etkileşime girdiğini ve somit oluşumunu nasıl kontrol ettiklerini incelemek için uygulanabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig01.jpg"> Şekil 1: Mikroakışkanlar protokolüne şematik genel bakış. (A) Çip kalıpları, bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak tasarlanabilir. Fare somitogenezinin ex vivo modellerinde sinyal salınımlarını içine almak için bir çip tasarımı sağlanmıştır. Kalıplar, örneğin, 3D baskı ile üretilebilir veya sipariş edilebilir. Mikroakışkan çipler PDMS'nin kalıplanması ile üretilir. Sertleştirilmiş bir PDMS çipi kesilir ve bir plazma fırını kullanılarak bir cam slayta kovalent olarak bağlanır. Çip içindeki cam yüzey, disseke edilmiş dokunun yapışmasını sağlamak için fibronektin ile kaplanır. Embriyonik doku, daha sonra kapatılan yükleme girişleri yoluyla çip üzerine yüklenir. Farklı ortam koşullarına sahip pompalar talaş girişlerine bağlanır ve bir akış programı başlatılır. Deney sırasında doku konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenebilir. (Kymographs, Sonnen ve ark., 201810'dan uyarlanmıştır. Creative Commons Atıf CC BY-NC-ND 4.0'a göre Cell'den yeniden basılmış ve değiştirilmiştir.) (B) Arka fare embriyo dokusunun çip üstü kültürü için bir kalıp tasarımının şematik çizimi. Mikroakışkan kanalların yüksekliği, posterior embriyonik fare kuyruklarının kültürü için yeterli olan 500 μm'dir. Bu kalıbı yazdırmak için gereken dosya Ek Dosya 1'de sağlanır ve Ek Dosya 2'de bir alternatif verilir. (C) Çip üzerindeki PDMS sütunlarıyla çevrili E10.5 kesitli fare kuyruğunun parlak alan görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig02.jpg"> Şekil 2: Bir mikroakışkanlar deneyinden elde edilen temsili sonuçlar. (A) Orta ve ilaç pompası ile sürüklenme deneyinin şematik gösterimi. Sinyal yolu modülatörünün darbeleri, fare embriyolarının ex vivo kültürlerine uygulanır ve sinyal salınımları, dinamik sinyal muhabirlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesiyle görselleştirilebilir (örneğin, Notch sinyal muhabiri LuVeLu5 ve Wnt sinyal muhabiri Axin2T2A10). Kesikli çizgiler, zaman içinde analizler için kullanılan bölgeyi gösterir. (B-F) LuVeLu muhabir salınımları, Çentik sinyal inhibitörü DAPT'ın periyodik darbeleri tarafından sürüklenir. (B,D) DAPT veya DMSO kontrolü kullanılarak sürüklenme üzerine ön PSM'deki Çentik sinyal salınımlarının nicelleştirilmesi. (C,E) Çentik sinyal salınımlarının fazı ile harici DAPT/DMSO darbelerinin zamanlaması arasındaki faz-faz ilişkisi grafikleri. Sürüklenme durumunda, istikrarlı bir faz ilişkisi kurulur. (F) DMSO ve DAPT darbeleri ile sıkıştırılmış numuneleri karşılaştıran muhabir salınımlarının ortalama periyodunun ve SEM'inin ölçülmesi. (Şekil Sonnenet al., 201810'dan uyarlanmıştır. Creative Commons Atıf CC BY-NC-ND 4.0'a göre Cell'den yeniden basılmış ve değiştirilmiştir.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sorun</td>
			<td>Önerilen çözüm(ler)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">PDMS cama yapışmaz.</td>
			<td>- Hem PDMS'nin hem de camın temiz olduğundan emin olun.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Odanın etrafında yapıştırma için yeterli PDMS olduğundan emin olun.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Plazma fırının ayarlarını optimize edin.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Çipimde hava kabarcıkları var.</td>
			<td>- Pompanın açık olup olmadığını kontrol edin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Çip üzerine doku yüklemeden önce çipin gazını çözün.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Deney başlamadan önce ortamın gazını boşaltın.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Kuluçka odasındaki nemin yeterince yüksek olduğundan emin olun.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Doku deneyin başında ölür.</td>
			<td>- Çipi yüklerken ve monte ederken ortama HEPES ekleyin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Yükleme sırasında dokuyu çok sık içeri ve dışarı yıkamayın.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Akış hızının çok yüksek olmadığını kontrol edin.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Doku görüntüleme sırasında ölür.</td>
			<td>- Görüntülemeden fototoksisite olmadığından emin olun</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Kirlenme olmadığından emin olun.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Debi çok yüksek olmamalıdır.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Görüntüleme sırasında odak değişir.</td>
			<td>- Görüntüleme slaytının sürüklenmesini ayarlamak için görüntüleme sırasında otomatik netleme kullanın.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Çipin mikroskop içindeki sıcaklığa en az 30 dakika eşit olmasına izin verin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çıkışlar/girişler ayrılır.</td>
			<td>- Tüm boruları tamamen aşağıya doğru itin.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Çipin camı kırılır.</td>
			<td>- Daha dikkatli olun, cam çok kırılgandır.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- İnce cam sadece görüntüleme için gereklidir. Görüntüleme yapılmazsa, normal bir kalın cam slayt kullanılabilir.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Kırılma çipin dışındaysa, sorun olmayabilir. Talaşa giden cam conta kırılırsa, sıvı dışarı sızacak ve hava içeri girecektir.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Çipimde bir kirlenme var.</td>
			<td>- Kültür ortamına antibiyotik ekleyin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Tüm ekipman ve boruları sterilize edin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Hızlı ve temiz çalışın.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Sorun Giderme
Ek Dosya 1: 3D yazıcı ile bir kalıp yazdırmak için STL dosyası. Bu kalıp, arka embriyonik dokunun çip üstü kültürü için mikroakışkan bir çip oluşturmak için kullanılır (tasarım Şekil 1'de gösterilmiştir). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-1.stl" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 2: STL dosyası, arka embriyonik dokunun çip üstü kültürü için mikroakışkan bir çip oluşturmak üzere 3D yazıcı ile bir kalıbı yazdırmak için. Ek Dosya 1'in ve Şekil 1'de gösterilen tasarımın aksine, bu tasarım, az miktarda havanın ana mikroakışkan odaya girmesini önlemek için tüm girişlerde kabarcık tuzakları içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-2.stl" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 3: Çipi mikroskopa yerleştirmek için bir tutucunun oluşturulması için tasarım dosyası. Bu tutucu 96 delikli bir plakanın boyutlarına sahiptir ve çoğu mikroskobun standart tutucularına uymalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-3.dwg" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Mikroakışkan bir çip üzerinde fare embriyonik dokusunun kültürü ve manipülasyonu için bir protokol sağlanır. Yol modülatörlerinin darbelerini uygulayarak, bu sistem fare somitogenezinin fonksiyonel araştırması için sinyal salınımlarını harici olarak kontrol etmek için kullanılabilir.

Somitogenezi Yöneten Sinyal Salınımlarının Fonksiyonel Olarak İncelenmesi İçin Bir Mikroakışkan Yaklaşımı

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

Çok hücreli sistemleri kontrol eden sinyal yolları dinamiktir. Bu dinamiklerin işlevini anlamak için, genel sinyal aktivitesini etkilemeden bu dinamikleri ince bir şekilde modüle edebilmek önemlidir. Bu protokol, gelişmekte olan fare embriyolarında sinyal salınımlarının fonksiyonel diseksiyonuna izin veren mikroakışkan bir sistem kullanır.Sinyal dinamikleri, yetişkin olanlar da dahil olmak üzere birçok dokuda bulunmuştur. Mikroakışkanlar, hücre, doku ve organoid kültürler dahil olmak üzere birçok model sistemine uyacak şekilde uyarlanabilen çok yönlü bir araçtır. Başlamak için, polimerizasyonu indüklemek için monomeri katalizörle dokuz-bir oranında karıştırarak gerekli miktarda PDMS'yi hazırlayın.Tek kullanımlık aletler kullanın ve karıştırmanın uygun şekilde yapıldığından emin olun. PDMS karışımını bir kurutucuya yerleştirin ve havayı gidermek için yaklaşık 30 dakika vakumlayın. Talaş kalıbına yaklaşık üç ila beş milimetrelik bir PDMS tabakası dökün ve yaklaşık 30 dakika boyunca kurutucuya geri yerleştirin.Kalıbı, kalıp malzemesine bağlı olarak gece boyunca 65 santigrat derece veya daha düşük bir sıcaklıkta bir fırına yerleştirerek kürleyin. Bir neşter kullanarak çipi kalıptan kesin. Giriş ve çıkış deliklerini, mikroakışkan haznenin içinden başlayarak bir milimetre biyopsi zımba ile delin.Cam sürgüyü basınçlı hava ile temizleyin. Çipi cam kızağa yapıştırmak için, çipi ve cam kaydırağı, yapıştırılacak yanlar yukarı bakacak şekilde plazma fırınına yerleştirin. Kullanılan makineye özgü protokolü kullanarak plazma oluşturun, ardından aktif yüzeyleri birbirine yerleştirerek ve eşit şekilde basınç uygulayarak çipi cama bağlayın.Tüpü ve talaşını deneye hazırlamak için, boruyu 45 derecelik bir açıyla kesin ve tüplerin her birine bir iğne takın. Boruyu iğnelerle, çiple ve tapalarla bir kaba yerleştirin ve yaklaşık 15 dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakarak sterilize edin. Çipi fibronektin ile kaplamak için, çipi oda sıcaklığında PBS artı% 1 penisilin veya streptomisin içeren bir beher içine yerleştirin.P200 pipetle havayı temizlemek için çipi PBS ile yıkayın. Çipin her odası için üç mililitrelik bir şırınga yükleyin. İğneyi fibronektin içeren şırıngaya takın ve şırıngayı şırınga pompasına bağlayın.Havayı çıkarmak için boruyu manuel olarak yıkayın. Çıkış borusunu çipin çıkışına takın. Boruyu dibe kadar ittiğinizden ve çipi kaplamak için düşük bir akış hızı ayarladığınızdan emin olun.Şırınga pompasının en az iki saat veya gece boyunca çalışmasına izin verin. İşiniz bittiğinde, pompayı durdurun ve iğneden hemen sonra boruyu kesin. Deney için ortamla doldurulmuş şırıngalar hazırlayın ve PBS içinde hem kültür ortamını hem de çipi gazdan arındırın.Hava kabarcıklarının çoğunu çipten temizlemeye veya emmeye çalışın, ardından şırıngaları pompalara takın ve giriş borusunu şırıngalara takın. Çip üzerine doku yüklemek için, kuyruğun en arka ucunu disseke edin. PBS'yi çıkarmak için çipi 25 mikromolar HEPES ile kültür ortamıyla yıkayın.P200 pipet kullanarak mendili çipin içine yükleyin. Her doku yükleme adımından sonra, PDMS dolu bir boru parçası kullanarak ilgili doku yükleme girişini kapatın. Mikroakışkan kurulumunu monte etmek için, içeride hava kabarcıkları olmadan mikroakışkan çipe boru takın.Bunu yapmak için, borunun sonunda bir damla orta olduğundan emin olun. Tüm borular çipe tutturulduktan sonra, beherden çıkarın ve ıslak bir doku içeren bir kaba yerleştirin. Çanağı ve yaklaşık 1,5 metre giriş borusunu gece kültürü için bir inkübatöre koyun.Kültür sırasında hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için yüksek nem sağlayın. Alternatif olarak, çipin dışını kurutun ve bir mikroskop tutucusuna yerleştirin, ardından tutucuyu ve yaklaşık 1,5 metrelik giriş borusunu, canlı bir görüntüleme deneyi için ters çevrilmiş bir mikroskobun kuluçka odasına koyun. En az 20 dakikalık sabit akıştan sonra, deney için planlanan pompalamaya başlayın.Parçalama fare embriyosunda çentik sinyalini yerleştirmek için, deneyin sonuna kadar, tipik olarak 24 saat boyunca tekrarlanan 100 dakikalık orta ve 30 dakikalık ilaç darbelerinden oluşan bir pompalama programı kullanın. Gerçek zamanlı görüntüleme için, en az 30 dakika sonra görüntülemeye başlayın. Sinyal salınımlarının sürüklenmesini doğrulamak için, ilaç darbelerinin zamanlaması kullanılarak çoklu deneyler hizalanır ve Cascade Blue boyası ile görselleştirilir.Niceliksel salınımlar trendden düşülebilir ve ortalama ve standart sapma veya salınımların fazları olarak görüntülenebilir. Bağımsız posterior embriyo kültürlerinin birbirleriyle ve eksternal ilaç darbeleriyle salınımları arasındaki faz ilişkisi analiz edilebilir. Sürüklenmeyi doğrulamak için, örneğin Python tabanlı pyBOAT programını kullanarak endojen sinyal salınımlarının periyodu belirlenebilir.130 dakikalık bir periyotla darbeler uygulanırken, çentik sinyal salınımları da 130 dakikalık bir süre gösterir. Mikroakışkan deneyi sırasında sıvının buharlaşmasını önlemek çok önemlidir. Aksi takdirde, çipte orta akışa müdahale eden hava kabarcıkları oluşacaktır.Bunu önlemek için, ortamı ve çipi gazdan arındırın ve inkübatördeki nemin yeterince yüksek olduğundan emin olun. Bu yöntem kullanılarak, sinyal dinamikleri modüle edilebilir ve etkileri, floresan muhabirlerin gerçek zamanlı görüntülenmesi, immün boyama veya in situ hibridizasyon ile analiz edilebilir. Ayrıca, doku daha fazla analiz için çipten de çıkarılabilir.Bu yöntem, embriyonik gelişimde sinyal salınımlarının işlevini incelemek için kullanılabilir. Fare embriyosunun segmentasyonu için iki salınımlı sinyal yolu arasındaki faz kaymasının önemini göstermek için uygulandı. Daha genel olarak, şimdi çok hücreli sistemlerde dinamik sinyal kodlama mekanizmasını incelemek için kullanılabilir.

a-microfluidics-approach-for-functional-investigation-signaling

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz temiz oda ya da yumuşak litografi gerek kalmadan, birden çok farklı suşları için benzer dinamik koşullar uygulanarak yeteneğine microfluidic cihazlar üretmek için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

Somitogenesis ritmik bir gelişimsel süreç olduğu mekansal desenler, embriyonun vücut ekseni. Daha önce, biz bu süreci götürmek döngüsel genleri gözlemlemek için floresan gazetecilere kullanmak transgenik zebra balığı hatları geliştirdik. Burada, kültür in vitro zamanla bu satırları ve görüntü onların salınımların hücreleri dağınık.

Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi

Parametrik optomekanik uyarımlar, optik radyasyon basıncı ve uyarılmış Brillouin saçılması yoluyla mikroakışkan optomekanik rezonatörlerde yakın zamanda deneysel olarak gösterilmiştir. Bu makale, optomekanik salınımların üretilmesi ve doğrulanması için metodolojilerle birlikte bu mikroakışkan rezonatörlerin imalatını açıklamaktadır.

Fabrikasyon ve mikroakışkan optomechanical Osilatörler Testi

Bu video makalede sistematik ve verimli birçok omurgasız embriyolar karmaşık sinyal yolları ve düzenleyici ağları bileşenleri karakterize etmek için kullanılabilir in vivo metodolojisi basit ayrıntıları.

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri

Segmentasyon saati, somitik öncesi mezoderm (PSM) boyunca salınımlı gen ekspresyonunu yönlendirir. Dinamik Çentik etkinliği bu sürecin anahtarıdır. Delta ligand ve Notch reseptör ekspresyonunun omurgalı PSM'de salındığını göstermek için uzamsal ifade verilerinden zamansal dinamikleri çıkarmak için görüntüleme ve hesaplamalı analizler kullanıyoruz.

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

Malzeme özellikleri ve tensional parametreleri içinde vivo ölçmek için Araçlar eksikliği onların rolleri geliştirme sırasında doğrulama engeller. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ve mekanik özellikleri bozulmamış Zebra balığı embriyo sarısı cep epiboly sırasında ölçmek için nanopartikül izleme çalıştırmaya başladık. Bu, güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir müdahaleci müdahaleler kaçınarak yöntemlerdir.

AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

Protokol, mikrokanallarda 10-1000 Hz'den harmonik salınımlı akış üretmek için uygun bir yöntem göstermektedir. Bu, bilgisayar kontrollü bir hoparlör diyaframının mikrokanala modüler bir şekilde yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir.

Mikrokanallarda Sub-Kilohertz Salınımlı Akış Üretimi için Harici Bir Sürücünün Montajı ve Karakterizasyonu

Mevcut protokol, yüzlerce Drosophila melanogaster embriyosunu minimum kullanıcı müdahalesiyle hizalayabilen, hareketsiz hale getirebilen ve hassas bir şekilde sıkıştırabilen mikroakışkan bir sistemin tasarımını, üretimini ve karakterizasyonunu açıklamaktadır. Bu sistem, stimülasyon sonrası analiz için numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini ve geri kazanılmasını sağlar ve diğer çok hücreli biyolojik sistemlere uyum sağlayacak şekilde ölçeklendirilebilir.

Çok Hücreli Organizmaların Yüksek Verimli Bir Mikroakışkan Sıkıştırma Sistemi Aracılığıyla Mekanostimülasyonu

Burada, endotel hücrelerini senkronize salınımlı hiperglisemi ve pulsatil kayma stresine maruz bırakan mikrofluidik bir sistem üretip çalıştırmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, diyabetik endotel disfonksiyonunu incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model sunar. Bu protokol, oksidatif stres ve endotel hücre yanıtlarının nicel ölçümünü sağlar.

Kombine Fizyolojik Pulsatil Kayma Stresi ve Salınım Hiperglisemi Altında Endotel Disfonksiyonunu Modellemek İçin Mikrofluidik Bir Sistem

Keşfedin fare embriyolarında somitogenezi yöneten sinyal salınımlarının fonksiyonel analizi için mikroakışkan yaklaşım. Bu yöntem, endojen osilasyonların hassas modülasyonu ve senkronizasyonunu sağlar.

Somitogenezi Yöneten Sinyal Salınımlarının Fonksiyonel Olarak İncelenmesi İçin Bir Mikroakışkan Yaklaşımı

Daha fazla video keşfet