Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti

Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.

Bu protokol, birçok biyolojik süreç için giderek daha fazla tanınan öneme sahip moleküller olan glikozaminojlikanların varlığını tespit etmek ve uzunluğunu ölçmek için kullanılabilecek basit bir tekniği açıklar. Bu teknik çoğu yaşam bilimleri laboratuvarına kolayca uyarlanabilir. Karşılaştırılabilir glikomik teknikler genellikle sadece glikokimya araştırma laboratuvarlarında bulunan ekipman ve uzmanlık gerektirir.

Bu teknik, insan vücudunun endotel ve epitel yüzeylerini kaplayan bir polisakkarit kat olan glikokaloksisi incelemek isteyen araştırmacılar için özellikle yararlı olabilir. PAGE tankına boş bir kaset yerleştirerek başlayın. 15 mililitrelik bir tüpte%10 amonyum perülfatta taze hazırlanmış 60 mikrolitre ile 10 mililitre çözülen jel çözeltisini karıştırarak bir çözen jel atın.

Daha sonra 10 mikrolitre TEMED ekleyin. Tüpü iki ila üç kez hafifçe ters çevirin. Bir pipet kullanarak kasete 10 mililitre aktif poliakrilamid jel çözeltisi ekleyin.

İki mililitre deiyonize filtrelenmiş su ile kaplama yapın ve çözme jelinin 30 dakika polimerize olmasını bekleyin. Çözme jeli tamamen polimerize olduktan sonra, kaplanmış suyu atın. 15 mililitrelik bir tüpte üç mililitre istifleme jeli çözeltisini 90 mikrolitre taze hazırlanmış% 10 amonyum persülfat ile karıştırarak istifleme jelini dökin.

Daha sonra üç mikrolitre TEMED ekleyin ve tüpü iki ila üç kez hafifçe ters çevirin. Kaset ağzına kadar doldurulana kadar istifleme jeli çözeltisini katılaştırılmış çözme jelinin üzerine hızlı bir şekilde eklemek için bir pipet kullanın. Boş poliakrilamid jel kaseti ile birlikte verilen tarağı tamamen yerleştirin ve istifleme jelinin 30 dakika polimerize olmasını bekleyin.

Jel polimerize olduktan sonra, bant şeridini kasetin altından çıkarın ve kaseti PAGE tank tertibatına geri yerleştirin. Üst ve alt odaları ilgili tampon çözeltileriyle doldurun. Kurutulmuş glikozaminoglisecan numunelerini gerekli minimum deiyonize filtrelenmiş su hacminde çözün ve numune yükleme tamponu ile bire bir oranında karıştırın.

Numuneleri ve HS oligosaccharide merdivenlerini jel içine yükleyin. Jeli 100 voltta beş dakika önceden çalıştırın, ardından çözücü jel çözeltisinin akrilamid yüzdesine bağlı olarak 20 ila 100 dakika boyunca 200 voltta çalıştırın. Çalışma tamamlandıktan sonra, kaseti sökün ve jeli deiyonize filtrelenmiş su ile dolu büyük ve temiz bir kaba dikkatlice çıkarın.

Daha sonra suyu atın ve jeli Alcian mavisi boyama çözeltisinde beş dakika lekeleyin. Alcian mavisi lekeyi atın ve Alcian mavisi boyama çözeltisinin çoğu çıkarılana kadar deiyonize filtrelenmiş suyla iki ila üç kez hızlı bir şekilde yıkayın. Jeli gümüş nitrat boyama çözeltisinde taze temiz bir kapta 30 dakika lekeleyin.

Daha sonra gümüş boyama çözeltisini tamamen çıkarmak için her biri deiyonize filtrelenmiş suda 30 dakika boyunca iki ila üç kez yıkayın. Suyu atın ve gelişen çözeltiyi ekleyin. Bantların görünümü için jeli dikkatlice gözlemleyin.

Lekenin kalitesine ve yüklenen numunenin kütlesine bağlı olarak, geliştirme birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar sürebilir. İstenilen bantlar görünür olmaz, hemen gelişen çözeltiyi atın ve jeli STOP çözeltisi ile kısa bir süre yıkayın. İzole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminolikanlar, poliakrilamid jel elektroforezi ile yoğunluğa bağımlı çözünürlükten sonra Alcian mavisi ve gümüş boyama tekniği kullanılarak görselleştirildi.

Bu şekilde görüldüğü gibi, farklı polimer uzunluklarındaki heparan sülfat oligosakkaritleri bu PAGE tabanlı yaklaşım kullanılarak kolayca tespit edilebilen bir yapıya sahip. Bu yöntemin tespit sınırı, 0,5 mikrogram kadar düşük, tekniğin biyolojik örneklerden izole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminojlikanların tespitinde oldukça hassas olduğunu göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak görselleştirilen dört farklı heparin sülfat oligosakkaritten, kırılmamış heparin en az kolayca tespit edilebilirdi.

Kırılmamış heparinin polidispersitesi nedeniyle, bu örnekten her bir bandın yoğunluğu, eşit saflaştırılmış heparin oligosakkarit kütlesi tarafından üretilen bantlardan daha düşüktür. Sıvı biyolojik örneklerden glikozaminojlikan saflaştırmanın verimliliği, başlangıçta nispeten düşük glikozamininogllikan konsantrasyonları içeren farelerden toplanan bronkoalveoler lavaj örnekleri kullanılarak değerlendirildi. Ek olarak, bu tekniğin başarısı, kütle olarak yaklaşık 10 disakkarit alt birimine eşit olan en küçük parçalarla, geniş miktarda izole heparin sülfat veren tüm akciğer homojenatından izole edilmiş heparin sülfat kullanılarak gösterilmiştir.

Yeni hazırlanmış reaktiflerin kullanılması ve bu protokolde kullanılan her reaktifin filtrelenerek filtrelenerek kullanılması çok önemlidir. Bu tekniği başarıyla gerçekleştirmek için en yüksek saflıkta ve kalitede reaktifler kullanmak çok önemlidir.