Name: Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Öğrenin, poliakrilamid jel elektroforezi ve gümüş boyama ile biyolojik örneklerden glikozaminoglikanları tespit etme ve boyutlandırma yöntemini. Bu erişilebilir teknik, glikobiyoloji araştırmalarında yüksek duyarlılık sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ve EPS) tarafından finanse edildi.

Bu protokolde analiz edilen tüm biyolojik örnekler, Colorado Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında farelerden elde edildi.
1. Heparan sülfat izolasyonu
<ol><li>Doku örneklerinin delipidasyonu NOT: Delipidasyon yağ bakımından zengin dokular için isteğe bağlı bir adımdır.<ol>
<li>Metanol ve dikloromethane karışımı 1:1 yapın. Numune başına yaklaşık 500 μL hazırlayın; daha büyük doku parçaları 1 mL'ye kadar sürebilir.</li>
		<li>Her doku örneğini, delipidasyon için kapaklı küçük bir cam kaba yerleştirin. NOT: Örnek kitle, ilgi çekici doku ve deneysel ihtiyaçlara göre değişebilir. 50 mg veya daha az genellikle yeterli GAG verimi için yeterlidir, ancak son kullanıcı tarafından bazı optimizasyon gerekebilir.</li>
		<li>Her cam kaba 500 μL metanol:dikloromethane çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Tüm katı doku örneklerinin tamamen çözücüye batırıldığından emin olun. NOT: Metanol/dikloromethane çözeltisini karıştırmak ve işlemek için serolojik pipetler veya plastik konik tüpler kullanın; diğer plastikler çözünebilir.</li>
		<li>Numuneleri kimyasal duman kaputuna bir çalkalayıcıya (güvenli rafa) yerleştirin ve 1 saat boyunca hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 17.000 x g'da karıştırmak ve santrifüj etmek için ajite edin.</li>
		<li>Organik çözücü fraksiyonunu (süpernatant) dikkatlice pipetle atın. Bu lipid fraksiyonudur - GAG içermez ve atılabilir. NOT: Küçük parçalar kaybolabileceği için dokuyu rahatsız etmemeye çalışın. Numune kaybını riske atmak yerine organik tabakanın bir kısmını numune kabında bırakmak tercih edilir.</li>
		<li>Cam kabın kapağını açık bırakın ve kaputta gece boyunca buharlaşmasına izin verin. Bu tüpler daha fazla işleme devam etmeyeceği için bir sonraki adım için tüpü değiştirin.</li>
		<li>Solvent karışımı tamamen buharlaştıktan sonra, mekanik parçalanma (artık numune >50 mg ise) veya Actinase E sindirimine (< 50 mg) devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Katı dokunun mekanik parçalanması (isteğe bağlı; daha büyük doku örnekleri için) NOT: Katı dokunun çoğu küçük parçası (yaklaşık 50 mg veya daha az) sindirim adımı sırasında tamamen çözülmelidir. Bununla birlikte, daha büyük numuneler mekanik parçalanma gerektirecektir.<ol>
<li>Uygun büyüklükteki polipropilen tüpe yerleştirerek ve kapalı tüpü sıvı nitrojene yerleştirerek ilgi çekici numuneleri flaş dondurun. Numunenin tamamen katı olana kadar donmasına izin verin.</li>
		<li>Temiz bir harç ve pestle kullanarak donmuş numuneleri toz benzeri bir kıvamda öğütün.</li>
		<li>Doğrudan Actinase E sindirimine geçin (Adım 1.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır ve yalnızca seyreltilmiş sıvı doku örnekleri (örneğin, bronko-alveolar lavaj sıvısı (BALF) veya plazma) için gereklidir.<ol>
<li>Sıvı numuneleri uygun deneysel gruplar halinde havuzlayın (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından)</li>
		<li>Toplam numune hacmini 3.000 Da moleküler ağırlık kesme (MWCO) ile 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen örnek hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa gerektiği gibi yineleyin.</li>
		<li>Her sütunu 3x 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile yıkayın. Akışı atın.</li>
		<li>Filtreyi ters çevirin ve taze, uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerinde 2.000 x g'da 1 dakika döndürün. -80 °C'de dondurun veya bir sonraki adıma geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Actinase E sindirimi NOT: Bu adım, numunenizdeki protein kirleticileri sindirmek ve sonuçta çıkarmak için gereklidir.<ol>
<li>Örnekleri 1:1 rekombinant Actinase E ile 10 mg/mL'lik istenen konsantrasyonda karıştırın. Uygun hacimde 10x sindirim tampon konsantresi ekleyin. İstenen son konsantrasyon: 0.005 M kalsiyum asetat ve 0.01 M sodyum asetat, pH 7.5. Örneğin: 190 μL sıvı numunesi, 190 μL 20 mg/mL Actinase E, 20 μL 0.05 M kalsiyum asetat, 0.1 M sodyum asetat.</li>
		<li>Örnekleri karıştırmak için hafifçe çalkalayın, ardından 55 ° C'de 48-72 saat boyunca sindirin (tüm doku için 7 güne kadar).</li>
		<li>Actinase E'yi inaktive etmek için 15-20 dakika boyunca 80 °C'ye ısıtın.</li>
		<li>Numuneyi -80 °C'de dondurun veya 1,5 adıma devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon NOT: Biyolojik numunede ilgi çekici GAG'ın düşük bir kütlesi bekleniyorsa veya sarf malzemesi reaktiflerinin (yani santrifüj filtre sütunlarının) korunması isteniyorsa, numuneler deneysel grup başına tek bir konsantre üretmek için birleştirilebilir (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından).<ol>
<li>Toplam numune hacmini 3.000 Da MWCO'lu 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen örnek hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa, gerektiği gibi yineleyin.</li>
		<li>Her sütunu 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile 3x yıkayın. Akışı atın.</li>
		<li>Filtreyi ters çevirin ve taze, uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerinde 2.000 x g'da 1 dakika döndürün (genellikle santrifüj filtre sütunlarına dahildir). -80 °C'de dondurun veya bir sonraki adıma geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tahliye<ol>
<li>1.5.5. adımdaki çözünmüş numuneleri bir gecede dönüşümlü vakum konsantratörüne yerleştirin veya numuneleri aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi liyofilize edin.</li>
		<li>Numuneleri -80 °C'de gece boyunca veya sıvı nitrojene batırarak iyice dondurun.</li>
		<li>Numune kapaklarını 18 G iğne ile delin ve liyofilzer odasına yerleştirin. Gerektiğinde paketleme için kağıt havlu ekleyin.</li>
		<li>Lyophilizer odasını liyofilzere sabitle ve bir gecede kuru dondur (en az -40 °C, 0.135 Torr)</li>
	</ol></li>
	<li>Katyon değişimi sütunu<ol>
<li>400 μL'ye kadar 8 M üre, %2 CHAPS çözeltisi (veya numuneleri birikiyorsa, en fazla (400/n) μL'ye kadar yeniden depolanmış numuneleri yeniden depolar, burada n = istenen havuzdaki numune sayısı. Deterjan çözeltisini mümkün olduğunca az kullanın.</li>
		<li>Katyon değişimi (IEX) sütununu 400 μL 8 M üre, %2 CHAPS çözeltisi ile dengeler. Oda sıcaklığında 2.000 x g'da 5 dakika döndürün.</li>
		<li>IEX sütununa 400 μL numune/havuza numune yükleyin. 2.000 x g'da 5 dakika döndürün.</li>
		<li>3x'i 400 μL 8 M üre, %2 CHAPS çözeltisi ile yıkayın. Her zaman 2.000 x g'da 5 dakika döndürün.</li>
		<li>400 μL 0,2 M NaCl ile Elute 3x. Her biri 2.000 x g'da 5 dakika döndürün. Bu düşük benzeşim fraksiyonudur - istenirse kalite kontrol amacıyla tutulabilir.</li>
		<li>2,7 M (%16) NaCl'nin 400 μL'si ile 3x elute. Her biri 2.000 x g'da 5 dakika döndürün. Bu fraksiyon, ilgi çekici izole glikozaminoglenkanları içerecektir - hepsini saklayın!</li>
		<li>Her bir eluted fraksiyonunu tuzdan arındırmak için, %80 vol'a kadar metanol ekleyin ve bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Her numuneyi 2.000 x g'da 5 dakika döndürün. Bu kurutulmuş tuzsuz glikozaminoglenik olduğu için katı kalıntıyı geri kazan. NOT: Alternatif olarak, bu adımı atlayın ve metanol olmadan eluate tuzdan arındırmak için 1.8 adımına geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon<ol>
<li>Gerekirse, havuz eluted fraksiyonları (1.7.6 itibaren) uygun deneysel gruplara (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından).</li>
		<li>Toplam numune hacmini 3.000 Da MWCO'lu 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen örnek hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa, gerektiği gibi yineleyin.</li>
		<li>Her sütunu 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile 3x yıkayın. Akışı atın. Doğrudan 1.9 adımına geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kondroitin sindirimi NOT: Bu adımın amacı, son kullanıcının ilgisini çekmeyen GAG'leri kaldırmaktır. Bu durumda, kondroitini çıkarmak için kondroitinaz kullanılır. Temsili Sonuçlar (bronko-alveolar lavaj sıvısı ve tüm akciğer) üretmek için kullanılan dokularda, kondroitin sülfatın sindirilmesi heparan sülfatını birincil artık GAG olarak bırakır. Son kullanıcıların deneysel amaçlarına bağlı olarak ek sindirim adımları eklemeleri gerekebilir.<ol>
<li>Membrana dokunmadan santrifüj filtre sütununa 350 μL sindirim tamponu (pH 7.0'a ayarlanmış 2 mM kalsiyum klorürlü 50 mM amonyum asetat) yükleyin.</li>
		<li>5 μL rekombinant kondroitinaz ABC ekleyin.</li>
		<li>Numune tüpünü 37 °C fırına yerleştirin ve 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Sütunu ters çevirin ve uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerine yerleştirin. 2000 x g'da 1 dakika döndürün.</li>
		<li>Kondroitinaz ABC'yi inaktive etmek için 15-20 dakika boyunca 80 °C'ye ısı örnekleri.</li>
	</ol></li>
	<li>Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon<ol>
<li>Gerekirse, havuz kondroitin 1.9.5 adımından uygun deneysel gruplara (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından) sindirilmiş örnekler</li>
		<li>Toplam numune hacmini 3.000 Da MWCO'lu 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen numune hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa gerektiği gibi yineleyin.</li>
		<li>Her sütunu 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile 3x yıkayın. Akışı atın.</li>
		<li>Filtreyi ters çevirin ve taze, uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerinde 2.000 x g'da 1 dakika döndürün. -80 °C'de dondurun veya bir sonraki adıma geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tahliye NOT: Bu adımda, numunelerin mümkün olan en küçük miktarda su ve çalışan tamponda yeniden kullanılabilmesi için kurutma gereklidir.<ol>
<li>1.10.5 adımındaki kondroitin sindirilmiş örnekleri bir gecede doğrudan rotasyonel vakum konsantratörüne yerleştirin veya aşağıdaki gibi liyofilize edin:</li>
		<li>Numuneleri -80 °C'de gece boyunca veya sıvı nitrojene batırarak iyice dondurun.</li>
		<li>Numune kapaklarını 18 G iğne ile delin ve liyofilzer odasına yerleştirin. Gerektiğinde paketleme için kağıt havlu ekleyin.</li>
		<li>Liyofilizör odasını liyofilzere sabitle ve bir gecede kuru dondur (en az 40 °C, 0.135 Torr)</li>
	</ol></li>
</ol>2. İzole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminolikanların poliakrilamid jel elektroforezi
<ol><li>Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) için gerekli çözümleri önceden hazırlayın (Tablo 1). NOT: Numunede olması beklenen glikozaminoglisekanların büyüklüğüne bağlı olarak jel çözeltisini çözmenin yüzde akrilamidini seçin. Daha büyük parçaların çözümü için% 15 önerilir (uzunluğu 30'dan fazla disakkarit alt biri); Daha küçük parçalar için %22 (<20 disakkarit alt birikmiş uzunlukta).</li>
	<li>PAGE tankına boş kaset yerleştirin. Çözme jelini aşağıdaki gibi dökun: 15 mL'lik tüpte, 10 mL çözelti çözeltisini, 60 μL% 10 amonyum persülfatı (taze hazırlanmış olmalıdır) ve 10 μL TEMED'i karıştırın (en son TEMED ekleyin). Tüpü hafifçe 2-3x ters çevirin. Yukarıdaki 10 mL'lik çözeltiyi kasete hızlı bir şekilde eklemek için pipet kullanın. 2 mL deiyonize, filtrelenmiş su ile kaplama ve çözme jelinin 30 dakika polimerize olmasını sağlar. NOT: Aşağıdaki PAGE protokolü, toplam hacmi yaklaşık 12mL olan 13,3 x 8,7 cm (genişlik x uzunluk) 1,0 mm kalınlığında döküm kasetler kullanılarak dikey bir PAGE sistemi için optimize edilmiştir. Diğer kaset sistemleri kullanılabilir, ancak son kullanıcı tarafından optimizasyon gerektirebilir.</li>
	<li>Çözme jeli tamamen polimerize olduktan sonra, kaplanmış suyu atın ve istifleme jelini aşağıdaki gibi dökin: 15 mL'lik bir tüpte, istifleme jeli çözeltisinin 3 mL'sini, 90 μL% 10 amonyum persülfatını karıştırın (taze hazırlanmış olmalıdır), 3 μL TEMED (en son TEMED ekleyin).</li>
	<li>Tüpü hafifçe 2-3x ters çevirin. İstifleme jeli çözeltisini katılaştırılmış çözümleme jelinin üzerine hızlı bir şekilde eklemek için bir pipet kullanın; kaseti ağzına kadar doldurun. Kurulumla birlikte gelen tarağı tamamen yerleştirin. İstifleme jelinin 30 dakika polimerize olmasını izin verin.</li>
	<li>Jel polimerize olduktan sonra, bant şeridinin kasetin altından çıkarıldığından emin olun ve kaseti PAGE tank tertibatına geri yerleştirin.</li>
	<li>Üst ve alt odaları sırasıyla üst ve alt oda tamponu ile doldurun.</li>
	<li>Kurutulmuş numuneleri adım 1.11.4'ten itibaren gerekli minimum deiyonize, filtrelenmiş su hacminde (PAGE jeldeki kuyuların hacminin en fazla% 50'si) çözün. 1:1'i örnek yükleme tamponu ile karıştırın. Numuneleri ve HS oligosaccharide "merdivenlerini" (bkz. Tablo 1)jel içine yükleyin.</li>
	<li>Jeli 100 V'ta 5 dakika önceden çalıştırın. Daha sonra jeli 20-25 dakika (%15 poliakrilamid çözme jeli için), 40-50 dk (%18 poliakrilamid çözme jeli için), 90-100 dk (%22 poliakrilamid çözme jeli için) için 200 V'de çalıştırın. NOT: 200 V çalışma süresinin bazı optimizasyonları gerekebilir. Fenol kırmızısı, uzunluğu 2 polimer alt biri olan heparin oligosakkaritlerin önünde göç eder (yani, polimerizasyon derecesi 2 veya dp2); bromophenol mavisi dp10-dp14'ün önüne geçirir. En iyi sonuçlar, voltaj uygulandığında, fenol kırmızı bandı neredeyse, ancak tam olarak değil, jelin dibine göç eder. Çalışma süresini buna göre ayarlayın.</li>
</ol>3. Gümüş boyama protokolü
<ol><li>Gümüş boyama için gerekli tüm çözümleri önceden hazırlayın (Tablo 2). NOT: PAGE jel lekelenene, geliştirilene ve durdurma çözeltisine yerleştirilene kadar doğrudan dokunmayın. Bunun yerine, temiz plastik veya cam aletler kullanarak jeli manipüle edin. Jelin doğrudan işlenmesi, boyamadan sonra jel üzerinde parmak izi bozulmalarına ve diğer görünür yapıtlara neden olur.</li>
	<li>Çalıştırma tamamlandıktan sonra, kaseti sökün ve deiyonize, filtrelenmiş su ile dolu temiz, orta-büyük bir kapta jel çıkarın. NOT: Jelin doğrudan işlenmesini önlemek için pipet ucu veya başka bir plastik nesne kullanarak jeli suya batırılmış halde kasetten hafifçe uzaklaştırın. Jel kırılgan olabilir - dikkatlice ele alın.<ol>
<li>Suyu atın. Jeli Alcian mavisi boyama çözeltisinde 5 dakika lekelenin.</li>
		<li>Alcian mavi lekesi atın. Alcian mavi boyama çözeltisinin çoğu çıkarılana kadar 2-3x'i deiyonize, filtrelenmiş suyla hızlı bir şekilde durulayın/yıkayın.</li>
		<li>Rocker'da bir gecede deiyonize, filtrelenmiş suda lekeyi bırakın. Artık lekelerin jelden bir gecede tamamen yıkanmasını sağlamak için bol miktarda deiyonize, filtrelenmiş su olduğundan emin olun.</li>
		<li>Jeli% 50 metanolde yıkayın (toplam 40 dk, çözeltiyi 2-3x değiştirin).</li>
		<li>Jeli deiyonize, filtrelenmiş suda 30 dakika yıkayın. Suyu atın ve her seferinde suyu değiştirerek toplam 2 saat boyunca 3 kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Taze, temiz bir kapta, jeli gümüş nitrat boyama çözeltisinde 30 dakika lekeleyin.</li>
		<li>Gümüş boyama çözeltisini tamamen çıkarmak için deiyonize, filtrelenmiş suda 2-3x hızlı bir şekilde durulayın/yıkayın.</li>
		<li>Deiyonize, filtrelenmiş suda 30 dakika yıkayın. Suyu atın ve her seferinde su banyoyu değiştirerek toplam 90 dakika boyunca 2x tekrarlayın.</li>
		<li>Suyu atın ve gelişmekte olan çözeltiyi ekleyin.</li>
		<li>Çözelti geliştikten sonra, jeli dikkatlice gözlemleyin ve bantların görünümünü izleyin. Lekenin kalitesine ve yüklenen numunenin kütlesine bağlı olarak, geliştirme birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar sürebilir.</li>
		<li>İstenilen bantlar görünür olur olmaz, gelişen çözeltiyi hemen atın ve durdurma çözeltisi ile kısa bir süre yıkayın.</li>
		<li>Durdurma çözeltisi yıkamayı atın ve yeni durdurma çözeltisi ile değiştirin. Bir rocker veya çalkalayıcı üzerinde 1 saat bekletin.</li>
		<li>Deiyonize, filtrelenmiş suda bir gecede yıkayın (ancak, jel durdurma çözeltisi yıkamadan hemen sonra görüntülenebilir).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS%3A+A+critical+role+for+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membrane%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li>
<li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+the+developing%2C+healthy%2C+and+injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li>
<li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li>
<li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratry+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li>
<li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li>
<li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li>
<li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li>
<li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li>
<li>Møller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li>
<li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels%3A+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li>
<li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels%3A+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li>
<li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+prostaglandin+E1+%28TLC+C-53%29+in+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+a+controlled%2C+randomized%2C+double-blind%2C+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li>
<li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li>
<li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li>
<li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025(2021).</li>
<li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

GAG'ler birçok farklı biyolojik proseste merkezi bir rol oynar. Sülfatlı GAG'lerin (HS ve CS gibi) temel işlevlerinden biri, aşağı akış sinyal fonksiyonlarını değiştirebilen ligandlarla etkileşime girmek ve ligandlara bağlanmaktır. Gag bağlama benzeşiminin konyak ligandlarına önemli bir belirleyicisi GAG polimer zincirinin uzunluğu 8,9,14. Bu nedenle, araştırmacıların biyolojik ilgi örneklerinden izole edilen GAG zincirlerinin b...

Glikozaminogllikanlar (GAG'lar), canlı organizmalarda her yerde bulunan ve birçok temel fizyolojik işleme katkıda bulunan doğrusal polisakkaritlerin çeşitli bir ailesidir1. Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi GAG'ler polisakkarit zinciri boyunca farklı konumlarda sülfatlanabilir ve negatif yük coğrafi etki alanları verebilir. Bu GAG'ler, proteoglikanlar olarak bilinen hücre yüzeyi proteinlerine bağlandığında, hücre dışı alana yansıtır ve konyak ligandlarına bağlanır, hem cis- (aynı hücreye bağlı ligand) hem de trans- (komşu hücreye bağlı ligand) sinyal işlemlerinin düzenlenmesine izin verir2. Ayrıca, GAG'ler ayrıca glomerüler bodrum membranı3, vasküler endotel glikokaleks 4 ve pulmoner epitel glikokaleks5 ve kıkırdak6gibi bağdokularında yapısal elemanlar olarak kritik roller üstlenir.
GAG polisakkarit zincirlerinin uzunluğu biyolojik bağlamlarına göre önemli ölçüde değişir ve son derece karmaşık bir enzymatic düzenleyici sistem tarafından dinamik olarak uzatılabilir, bölünebilir ve değiştirilebilir7. Daha da önemlisi, GAG polimer zincirlerinin uzunluğu, ligandlar için bağlayıcı yakınlıklarına ve daha sonra biyolojik işlevlerine önemli ölçüde katkıda bulunur8,9. Bu nedenle, endojen bir GAG işlevinin belirlenmesi, boyutunun takdirini gerektirir. Ne yazık ki, proteinlerin ve nükleik asitlerin aksine, tarihsel olarak bu çeşitli polisakkarit ailesinin biyolojik rolleri hakkında nispeten sınırlı bir araştırma ile sonuçlanan GAG'leri tespit etmek ve ölçmek için çok az sayıda hazır teknik mevcuttur.
Bu makalede, GAG'lerin çoğu biyolojik dokudan nasıl izole ve saflaştırılacağı ve ayrıca izole polimerlerin uzunluğunu adil bir özgüllük derecesiyle değerlendirmek için poliakrilamid jel elektroforezinin (PAGE) nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Diğer, son derece karmaşık (ve genellikle kütle spektrometrisi bazlı) glikonik yaklaşımların aksine, bu yöntem standart laboratuvar ekipmanları ve teknikleri kullanılarak kullanılabilir. Bu nedenle, bu pratik yaklaşım, araştırmacıların yerel GAG'lerin biyolojik rolünü ve bağlamsal olarak önemli ligandlarla etkileşimlerini belirleme yeteneklerini genişletebilir.

<table><tbody><tr><td>Accuspin Micro17 tezgah üstü mikrosantrifüj</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td>14000 xG kapasiteli herhangi bir tezgah üstü mikrosantrifüj/rotor kombinasyonu uygundur</td></tr><tr><td>Akrilamid (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP170-100</td><td>Elektroforez sınıfı</td></tr><tr><td>Aktinaz E</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>S. griseus</td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX'ten proteaz karışımı (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC400460100</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum asetat (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A639-500</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit (sıvı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>sertifikalı ACS</td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>elektroforez sınıfı</td></tr><tr><td>Barnstead GenPure Pro Water Arıtma Sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10-451-217PKG</td><td>Herhangi bir su deiyonize / saflaştırma sistemi kabul edilebilir bir alternatiftir</td></tr><tr><td>Borik asit (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Bromfenol mavisi (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum asetat (katı)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18-609-432</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (katı)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC349610250</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>CHAPS deterjan (3-((3-kolamidopropil) dimetilamonya)-1-propansülfonat)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28299</td><td></td></tr><tr><td>Kondroitinaz ABC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3667</td><td></td></tr><tr><td>PAGE için kriter boş kaset (1.0 mm kalınlığında, 12+2 kuyu)</td><td>Bio-Rad</td><td>3459901</td><td>1.0 mm kalınlığındaki herhangi bir PAGE döküm kaset sistemi yeterli olacaktır</td></tr><tr><td>Criterion PAGE Hücre sistemi (hücre ve güç kaynağı)</td><td>Bio-Rad</td><td>1656019</td><td>karşılaştırılabilir herhangi bir dikey jel PAGE sistemi çalışacaktır)</td></tr><tr><td>Diklorometan (sıvı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC610931000</td><td>sertifikalı ACS</td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Buzul asetik asit (sıvı)</td> <td>thermoFisher Scientific</td><td>A35-500</td><td>Sertifikalı ACS</td></tr><tr><td>Glisin (katı)</td> <td>thermoFisher Scientific</td><td>G48-500</td><td>Elektroforez sınıfı</td></tr><tr><td>Heparanaz I / III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3917</td><td>Flavobacterium heparinum</td></tr><tr><td>Heparin türevi dekaskarit (dp10)</td> <td>galen bilimsel</td><td>HO10</td><td></td></tr><tr><td>Heparin türevi hekzasakkar (dp6)</td><td>Galen bilimsel</td><td>HO06</td><td></td></tr><tr><td>Heparin türevi oligosakkarit (dp20)</td><td>galen bilimsel</td><td>HO20</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (sıvı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A466-250</td><td></td></tr><tr><td>Liyofilizatör</td><td>Labconco</td><td>7752020</td><td>-40C ve 0.135 Torr'a ulaşabilen herhangi bir liyofilizatör çalışacaktır; ayrıca rotasyonel vakum yoğunlaştırıcı ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Metanol (sıvı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A412-500</td><td>Sertifikalı ACS</td></tr><tr><td>Moleküler Görüntüleyici Jel Doc XR Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8170</td><td>Karşılaştırılabilir herhangi bir jel görüntüleme sistemi kabul edilebilir bir ikamedir</td></tr><tr><td>N,N'-metilen-bis-akrilamid (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP171-25</td><td>Elektroforez sınıfı</td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>P74-10</td><td>Serbest asit</td></tr><tr><td>Q Mini H İyon Değişim Kolonu</td><td>Vivapure</td><td>VS-IX01QH24</td><td>İyon değişim kolonu, minimum 0,4 mL yükleme hacmine, çalışma pH'ı 2-12 ve pKa'sı 11 olan iyonik gruplar için seçiciliğe sahip olmalıdır</td></tr><tr><td>Gümüş nitrat (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S181-25</td><td>sertifikalı ACS</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat (katı)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S392-212</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz (katı)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiamin)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>Elektroforez sınıfı</td></tr><tr><td>Tris bazlı (katı)</td> <td>thermoFisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Ultra Santrifüj filtreler, 0.5mL, 3000 Da moleküler ağırlık kesme</td><td>Amicon</td><td>UFC500324</td><td>Numune boyutuna bağlı olarak daha büyük hacimli filtre üniteleri kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Üre (katı)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>Herhangi bir rotasyonel vakum yoğunlaştırıcı çalışacaktır; liyofilizatör ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Vakum filtre ünitesi, tek kullanımlık, 0.22uM gözenekli PES, 500mL hacim</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>569-0020</td><td>Alternatif hacimler ve filtre malzemeleri kabul edilebilir</td></tr></tbody></table>

glikozamid jel elektroforez ve gümüş boyama ile glikozaminolikanların tespiti

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi sülfatlı glikozaminojenler (GAG' ler) canlı organizmalarda her yerde bulunur ve çeşitli temel biyolojik yapılarda ve süreçlerde kritik bir rol oynar. Polimerler olarak, GAG'ler 4000 Da ile 40.000 Da arasında değişebilen polisakkarit zincirleri içeren bir polidisperz karışımı olarak bulunur. Bu zincirlerde, kognate protein ligandlarının pozitif yüklü kalıntılarıyla etkileşimi kolaylaştıran bir negatif yük deseni veren sülfatlama alanları vardır. GAG'lerin sülfatlı etki alanları, bu elektrostatik etkileşimlere izin vermek için yeterli uzunlukta olmalıdır. GAG'lerin biyolojik dokulardaki işlevini anlamak için, araştırmacı GAG'lerin boyutunu izole edebilmeli, arındırabilmeli ve ölçebilmelidir. Bu rapor, çeşitli biyolojik doku tiplerinden izole edilen GAG'ler arasındaki nispeten küçük boyut farklılıklarını çözmek için yararlanılabilen pratik ve çok yönlü poliakrilamid jel elektroforez bazlı bir tekniği açıklar.

Alcian mavisi sülfatlı GAG 10'ulekelemede kullanılır; bu sinyal, sonraki gümüş leke 11kullanılarak yükseltilir. Şekil 1, gümüş boyama geliştirme sürecinin görsel bir gösterimini sağlar. Gösterildiği gibi, elektroforez ile ayrılmış GAG'leri temsil eden Alcian mavi sinyali, gelişen ajan poliakrilamid jeline nüfuz ettikçe yükseltilir. Tipik olarak, gelişen süreç gümüş ve Alcian mavi lekeli GAG'leri yoğunluğa bağlı bir şekilde azaltacak, her bandın...

Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.

Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Bu protokol, birçok biyolojik süreç için giderek daha fazla tanınan öneme sahip moleküller olan glikozaminojlikanların varlığını tespit etmek ve uzunluğunu ölçmek için kullanılabilecek basit bir tekniği açıklar. Bu teknik çoğu yaşam bilimleri laboratuvarına kolayca uyarlanabilir. Karşılaştırılabilir glikomik teknikler genellikle sadece glikokimya araştırma laboratuvarlarında bulunan ekipman ve uzmanlık gerektirir.Bu teknik, insan vücudunun endotel ve epitel yüzeylerini kaplayan bir polisakkarit kat olan glikokaloksisi incelemek isteyen araştırmacılar için özellikle yararlı olabilir. PAGE tankına boş bir kaset yerleştirerek başlayın. 15 mililitrelik bir tüpte%10 amonyum perülfatta taze hazırlanmış 60 mikrolitre ile 10 mililitre çözülen jel çözeltisini karıştırarak bir çözen jel atın.Daha sonra 10 mikrolitre TEMED ekleyin. Tüpü iki ila üç kez hafifçe ters çevirin. Bir pipet kullanarak kasete 10 mililitre aktif poliakrilamid jel çözeltisi ekleyin.İki mililitre deiyonize filtrelenmiş su ile kaplama yapın ve çözme jelinin 30 dakika polimerize olmasını bekleyin. Çözme jeli tamamen polimerize olduktan sonra, kaplanmış suyu atın. 15 mililitrelik bir tüpte üç mililitre istifleme jeli çözeltisini 90 mikrolitre taze hazırlanmış% 10 amonyum persülfat ile karıştırarak istifleme jelini dökin.Daha sonra üç mikrolitre TEMED ekleyin ve tüpü iki ila üç kez hafifçe ters çevirin. Kaset ağzına kadar doldurulana kadar istifleme jeli çözeltisini katılaştırılmış çözme jelinin üzerine hızlı bir şekilde eklemek için bir pipet kullanın. Boş poliakrilamid jel kaseti ile birlikte verilen tarağı tamamen yerleştirin ve istifleme jelinin 30 dakika polimerize olmasını bekleyin.Jel polimerize olduktan sonra, bant şeridini kasetin altından çıkarın ve kaseti PAGE tank tertibatına geri yerleştirin. Üst ve alt odaları ilgili tampon çözeltileriyle doldurun. Kurutulmuş glikozaminoglisecan numunelerini gerekli minimum deiyonize filtrelenmiş su hacminde çözün ve numune yükleme tamponu ile bire bir oranında karıştırın.Numuneleri ve HS oligosaccharide merdivenlerini jel içine yükleyin. Jeli 100 voltta beş dakika önceden çalıştırın, ardından çözücü jel çözeltisinin akrilamid yüzdesine bağlı olarak 20 ila 100 dakika boyunca 200 voltta çalıştırın. Çalışma tamamlandıktan sonra, kaseti sökün ve jeli deiyonize filtrelenmiş su ile dolu büyük ve temiz bir kaba dikkatlice çıkarın.Daha sonra suyu atın ve jeli Alcian mavisi boyama çözeltisinde beş dakika lekeleyin. Alcian mavisi lekeyi atın ve Alcian mavisi boyama çözeltisinin çoğu çıkarılana kadar deiyonize filtrelenmiş suyla iki ila üç kez hızlı bir şekilde yıkayın. Jeli gümüş nitrat boyama çözeltisinde taze temiz bir kapta 30 dakika lekeleyin.Daha sonra gümüş boyama çözeltisini tamamen çıkarmak için her biri deiyonize filtrelenmiş suda 30 dakika boyunca iki ila üç kez yıkayın. Suyu atın ve gelişen çözeltiyi ekleyin. Bantların görünümü için jeli dikkatlice gözlemleyin.Lekenin kalitesine ve yüklenen numunenin kütlesine bağlı olarak, geliştirme birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar sürebilir. İstenilen bantlar görünür olmaz, hemen gelişen çözeltiyi atın ve jeli STOP çözeltisi ile kısa bir süre yıkayın. İzole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminolikanlar, poliakrilamid jel elektroforezi ile yoğunluğa bağımlı çözünürlükten sonra Alcian mavisi ve gümüş boyama tekniği kullanılarak görselleştirildi.Bu şekilde görüldüğü gibi, farklı polimer uzunluklarındaki heparan sülfat oligosakkaritleri bu PAGE tabanlı yaklaşım kullanılarak kolayca tespit edilebilen bir yapıya sahip. Bu yöntemin tespit sınırı, 0,5 mikrogram kadar düşük, tekniğin biyolojik örneklerden izole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminojlikanların tespitinde oldukça hassas olduğunu göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak görselleştirilen dört farklı heparin sülfat oligosakkaritten, kırılmamış heparin en az kolayca tespit edilebilirdi.Kırılmamış heparinin polidispersitesi nedeniyle, bu örnekten her bir bandın yoğunluğu, eşit saflaştırılmış heparin oligosakkarit kütlesi tarafından üretilen bantlardan daha düşüktür. Sıvı biyolojik örneklerden glikozaminojlikan saflaştırmanın verimliliği, başlangıçta nispeten düşük glikozamininogllikan konsantrasyonları içeren farelerden toplanan bronkoalveoler lavaj örnekleri kullanılarak değerlendirildi. Ek olarak, bu tekniğin başarısı, kütle olarak yaklaşık 10 disakkarit alt birimine eşit olan en küçük parçalarla, geniş miktarda izole heparin sülfat veren tüm akciğer homojenatından izole edilmiş heparin sülfat kullanılarak gösterilmiştir.Yeni hazırlanmış reaktiflerin kullanılması ve bu protokolde kullanılan her reaktifin filtrelenerek filtrelenerek kullanılması çok önemlidir. Bu tekniği başarıyla gerçekleştirmek için en yüksek saflıkta ve kalitede reaktifler kullanmak çok önemlidir.

detection-glycosaminoglycans-polyacrylamide-gel-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

SDS-PAGE ile takip glikoproteinler şekerler kaldırmak için belirli glycosidases kullanarak protein örnekleri üzerinde glukanıdır değişiklikler tespit etmek için değerli bir yöntemdir ve ilk Glikobiyoloji çalışmaları için iyi bir seçimdir. Deglycosylation aşağıdaki değişiklikler, jel hareketlilik vardiya olarak veya glukanıdır duyarlı reaktifler boyama ile tespit edilebilir.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Bu videoda, florojenik problar kullanarak toplam proteinin görselleştirilmesi için poliakrilamid jellerin gümüş boyama yöntemini gösteriyoruz.

Floresan Gümüş Boyama: Poliakrilamid Jellerdeki Toplam Proteini Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, sülfatlanmış glikozaminoglikan oligosakkarit fragmanlarının kombine Alcian mavisi ve gümüş boyaması için bir prosedür gösteriyoruz. Bu kombine boyama tekniği, poliakrilamid jellerdeki farklı uzunluklardaki glikozaminoglikan polimerlerinin bantlarını önemli ölçüde çoğaltır.

Sülfatlanmış Glikozaminoglikanların Gümüş Boyanması: Poliakrilamid Jellerde Sülfatlanmış Glikozaminoglikanların Görselleştirilmesi İçin Bir Boyama Yöntemi

Bu video, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak fare akciğer dokusundan izole edilen heparan sülfatların ayırma prosedürünü göstermektedir.

Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Fare Akciğer Dokusundan İzole Edilen Değişen Zincir Uzunluklarına Sahip Heparan Sülfatları Tespit Etmek İçin Analitik Bir Teknik

Bu videoda, insan fonksiyonel olmayan hipofiz adenomunun (NFPA) tümör dokularından elde edilen karmaşık bir protein karışımından tek tek proteinleri ayıran iki boyutlu bir jel elektroforezi yöntemi gösteriyoruz. Proteinler, birinci boyutta elektrik yüklerine göre ayrılır ve ikinci boyutta moleküler ağırlıklara göre daha da ayrılır.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

O-bağlı glikanların çeşitliliğini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, permetilasyon ve hızlı bir faz bölme yöntemi ile birlikte jel içi indirgeyici β-eliminasyon için yeni bir prosedür, SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinlerden doğrudan salınan O-bağlı glikanların analizine uygulanır ve kütle spektrometresi ile müteakip glikomik analize uygundur.

Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Bu kağıt, ECM protein bileşiminin (1) analizi, glikozilasyon yerleri (2) tespit edilmesi ve glıkan formlarının (3) yapısal karakterizasyon için sağlar, MS analizi için kardiyovasküler doku örnekleri hazırlamak için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji, diğer dokularda ECM'nin çalışma, minör modifikasyonlarla, uygulanabilir.

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Burada, sadece üç reaktifler ve 7 min işleme gerektirir ve yüksek kaliteli SSR veri genetik analiz hızlı üretimi için uygundur Protokolü boyama basit ve düşük maliyetli bir gümüş raporu.

Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag+algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

İmmünoglobulin G (IgG) N-glikan hidrofilik etkileşim kromatografiu UPLC ile karakterizedir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır. Burada sunulan yaygın araştırma ortamlarında kullanılabilir, böylece bu deneysel yönteme bir giriştir.

Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi

Öğrenin, poliakrilamid jel elektroforezi ve gümüş boyama ile biyolojik örneklerden glikozaminoglikanları tespit etme ve boyutlandırma yöntemini. Bu erişilebilir teknik, glikobiyoloji araştırmalarında yüksek duyarlılık sağlar.

Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti

Daha fazla video keşfet