İnsan Hücrelerinde Protein-Ligand Etkileşimlerinin Yüksek Hücre Yoğunluklu Biyoreaktör Kullanarak Gerçek Zamanlı Kantitatif Hücre İçi NMR ile İzlenmesi

Hücre içi NMR spektroskopisi, doğrudan canlı hücrelerde protein yapısını ve işlevini incelemek ve protein-ligand etkileşimleri gibi biyolojik olarak ilgili süreçleri izlemek için benzersiz bir yaklaşım sunar. Bu NMR biyoreaktörü, spektrometrede birkaç gün boyunca çok sayıda insan hücresini canlı ve metabolik olarak aktif tutabilir, gerçek zamanlı hücre içi NMR uygulamalarına olanak tanır. Bu yöntem, konformasyonel veya kimyasal değişikliklere uğrayan çözünür, serbestçe yuvarlanan hücre içi proteinlere uygulanabilir.

İzotop etiketleme, yöntemin uygulanabilirliğini daha da genişletir. Başlamak için, akış ünitesini, daha sonra hücreleri içeren ile değiştirilecek olan ikinci bir akış ünitesi NMR tüpü kullanarak birleştirin. Doğru montaj için akış ünitesi çalıştırma talimatlarına bakın.

Akış ünitesi sıcaklık kontrolüne bağlı su banyosunu 37 santigrat dereceye ayarlayın ve rezervuar şişesini su banyosuna yerleştirin. Rezervuar şişesinin FEP borusunu pompaya bağlayın. Biyoreaktör valfini baypas etmek için çevirin ve pompayı ortamla önceden doldurun.

Ardından, biyoreaktör valfini akışa çevirin ve biyoreaktörü dakikada 0.1 mililitrede ortamla önceden doldurun. Karbondioksit inkübatöründen transfekte HEK 293 T hücrelerinden oluşan bir T75 şişesi alın ve harcanan ortamı çıkarın. Hücrelere iki mililitre tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Tripsini 20 mililitre tam DMEM ile inaktive edin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri iyice yeniden askıya alın. Ardından, bunları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800X G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.

Hücre peletini 1,5 mililitrelik kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri agaroz ipliklerine gömmek için, bir blok ısıtıcıda 85 santigrat derecede katılaşmış agarozun bir alikotunu eritin, ardından blok ısıtıcıda 37 santigrat derecede çözelti içinde tutun. Bir Pasteur pipetle, akış ünitesi NMR tüpünün tabanını 60 ila 70 mikrolitrelik %1,5 agaroz jeli ile doldurun ve beş milimetre yüksekliğinde bir alt tıkaç oluşturmak için buzun üzerine yerleştirin.

Hücre peletini blok ısıtıcıda 15 ila 20 saniye ısıtın ve hücreleri 450 mikrolitre agaroz çözeltisi içinde dikkatlice yeniden askıya alarak kabarcık oluşumunu önleyin. Hücre/agaroz süspansiyonunu, bir mililitrelik bir şırıngaya bağlı 0,75 milimetre iç çaplı 30 santimetre uzunluğunda kromatografi PEEK borusuna aspire edin. Boruyu oda sıcaklığında iki dakika soğumaya bırakın.

Akış ünitesi NMR tüpünü oda sıcaklığında 100 mikrolitre PBS ile önceden doldurun. Agaroz içine gömülü hücrelerin ipliklerini, şırıngayı hafifçe iterek akış ünitesi NMR tüpüne dökün. Boş NMR tüpünü akış ünitesinden çıkarın ve giriş borusundaki artık gaz kabarcıklarını gidermek için akış hızını birkaç dakika boyunca dakikada iki mililitreye çıkarın.

Akış hızını dakikada 0,2 mililitreye ayarlayın ve hücreleri içeren NMR tüpünü yavaşça ama istikrarlı bir şekilde yukarı doğru iterek yerleştirin. Biyoreaktör ortamını dakikada 0,1 mililitre akış hızında besleyin. NMR spektrometresindeki sıcaklığı 310 Kelvin olarak ayarlayın ve akış birimini spektrometreye yerleştirin.

Biyoreaktör NMR spektrometresine yerleştirildikten sonra, ortam değişimine izin vermek için birkaç dakika bekleyin. Proton kanalının eşleşmesini ve ayarlanmasını ayarlayın, mıknatısı şime edin ve protonun 90 derecelik sert darbe uzunluğunu hesaplayın. Her darbe dizisindeki proton güç seviyelerini proton sert darbesine göre ayarlayın.

Numune içeriğini alan homojenliğinde kaydetmek için ilk zgesgp proton NMR spektrumunu kaydedin. Zgesgp ve p3919gp veya SOFAST-HMQC deneylerini istenen sayıya kopyalayın ve bunları edinme biriktiricisinde sıraya koyun. Silikon boruyu steril, uzun iğneli bir şırınga ile delerek dış molekülün konsantre bir çözeltisini orta rezervuar şişesine enjekte edin.

NMR deneyinin sonunda, hücreleri içeren tüpü boş bir tüple değiştirin ve akış birimini suyla durulayın. Etiketlenmemiş karbonik anhidraz eksprese eden hücreler için, sıfır doldurma ve üstel çizgi genişletici pencere fonksiyonu uygulayarak p3919gp spektrumlarını işleyin. Azot-15 etiketli, süperoksit dismutazı eksprese eden hücreler için, her iki boyutta da sıfır doldurma ve kare işaretli zil penceresi işlevi uygulayarak SOFAST-HMQC spektrumlarını işleyin.

MATLAB'da, Load_ascii_spectra özel komut dosyasını kullanarak spektral bölgeleri içeri aktarın. 1B spektrumlardan zaman damgalarını ayıklamak için Load_acqus komut dosyasını çalıştırın. mcr_main komut dosyasını çalıştırarak MCR-ALS 2.0 GUI'sini açın ve Veri seçimi sekmesinde spektrum matrisini yükleyin.

Verileri çizerek kontrol edin. Bileşenlerin sayısını, tekil değer ayrışması yoluyla veya manuel olarak değerlendirin ve saf spektrumların ilk tahmini için bir yöntem seçin. En saf değişken tespiti veya gelişen faktör analizi kullanılabilir.

Veri kümesi seçiminde Devam'ı seçin. Konsantrasyonlar için kısıtlamaları Constraints:satır modu penceresinde ayarlayın. Olumsuzluk olmayan bir kısıtlama uygulayın, Uygulama olarak fnnls'yi ve tür sayısı olarak iki tane seçin.

Ardından, bir kapatma kısıtlaması uygulayın, kısıtlamayı bir, kapanış kısıtlaması koşulunu eşittir olarak ayarlayın ve tüm türlere uygulayın. Kısıtlamalar:sütun modu penceresinde spektrum için kısıtlamaları ayarlayın. Olumsuzluk olmayan bir kısıtlama uygulayın, uygulama olarak fnnl'leri ve tür sayısı olarak iki tane seçin.

Son pencerede, 50 yineleme ve 0,01 Yakınsama ölçütü ayarlayın. Konsantrasyonlar, spektrumlar ve standart sapma için Çıktı adlarını belirtin. MCR-ALS donanımını çalıştırmak için Devam'a tıklayın.

Biyoreaktördeki hücreler, bir tripan mavisi testi ile onaylandığı gibi, 72 saate kadar canlı tutulabilir. Biyoreaktör, HEK 293 T hücrelerinin sitozololünde aşırı eksprese edilen karbonik anhidraz için iki inhibitörün, asetazolamid ve metazolaminin bağlanmasının gerçek zamanlı izlenmesi için kullanıldı. Aşırı eksprese proteinden gelen sinyallerin varlığı ve alan homojenliği, ilk uyarım-heykel proton spektrumu ile değerlendirildi.

Karbonik anhidraz durumunda, iki inhibitörün hücre içi bağlanması, çinko koordine edici histidinler ve diğer aromatik kalıntılardan kaynaklanan WATERGATE spektrumunun milyonda 11 ila 16 parçası arasındaki bölgedeki proton sinyallerini gözlemleyerek izlendi. Başarılı bağlama, ek sinyallerin ortaya çıkmasıyla doğrulandı. MCR-ALS, serbest ve bağlı karbonik anhidrazdan kaynaklanan NMR sinyallerini ayırmak ve iki türün nispi konsantrasyon profillerini sağlamak için kullanıldı.

Biyoreaktör, bir glutatyon peroksidaz taklidi olan ebselen tarafından teşvik edilen çinkoya bağlı süperoksit dismutaz intramoleküler disülfit bağının oluşumunu izlemek için uygulandı. 2D spektrumun seçilmiş bölgeleri üzerinde MCR-ALS analizi, iki türden kaynaklanan sinyalleri ayırdı ve göreceli konsantrasyon profillerini sağladı. Kabarcık oluşumuna neden olabilecek basınç sıçramalarını önlemek için akış ünitesi NMR tüpünün yavaşça ve istikrarlı bir şekilde takılması ve çıkarılması önemlidir.

NMR biyoreaktörlerinin geliştirilmesi, canlı hücrelerde redüks regülasyonu ve ilaç / hedef etkileşimlerinin çizilmesi gibi atomik çözünürlük zamana bağlı süreçleri incelemenin yolunu açmıştır.