MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Bu protokolün amacı, floresan muhabirlerin yardımıyla makrofaj ve T hücre hatlarında CRISPR/Cas9 aracılı çalma deneyini basitleştirmek ve hücre sıralamasını etkilemektir. ROSA26 Locus, transgenes yerleştirilmesi için genomik güvenli liman bölgesi olarak bilinir. 26 çekirgenin fare dünyasında veya insan orto kütüğünde saldırı olsun ya da olmasın ilgi proteinini ifade etmek olağandır.

Bölüm 1: Rosa26 Locus'u Hedefleyen sgRNA'ların Tasarımı ve Plasmid İnşaatı. İlk olarak, fare genom bilişiminden diziler kullanarak fare Rosa26 lokusundan sgRNA'lar tasarlayın ve Ensemble Genom Tarayıcısı, ardından fare Rosa26 geninin genomik dizisini indirin. Çevrimiçi web aracı CRISPOR'a gidin, Rosa26 Locus'tan giriş sırasının 100 baz çiftini yapıştırın.

Ardından bir genom seçin, örneğin, Mus kas-fare referans genomu 2011. Ardından, PAM türünü seçin.

Gönder'i tıklatın. Yüksek özgüllük puanı, yüksek yapma puanı ve daha az off hedefi olan kılavuzu seçin. Verimsiz olarak belirtilen kılavuzlardan kaçınılmalıdır.

Özellikle, rapor edildiği gibi darbe verimliliğini artırabilecek çakışan sıralara sahip iki kılavuz seçmek tercih edilir. Sıcak yemek dizisi için, fosforlu tavlanmış ve faktöre klonlamaya hazır bir ileri yasadışı ve ters bir yasadışı sentezle. Vactor başına doğrusal düşüşü hazırlayın, bbs bir sindirim tarafından muhabirlik yapmak zorunda, Neal almak gibi, son yapıyı oluşturmak için doğrusal vektörün yasalları, aynı anda kılavuz RNA ve CAS dokuz çekirdeğini bir DSRIP iki floresan muhabiri ile bağlantılı olarak ifade eder.

İkinci Bölüm:Homolog Rekombinasyon Şablonu Olarak Hedefleme Vektörü İnşaatı. İlgi proteininin ifadesi için. Örneğin, insan dayandı.

CDNA dizisini ticari kaynak ve benzeşim OST etiketi veya proteinin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılan diğer saldırılara göre sentezlemek istiyorsanız, cDNA dizisine kaynaştırılabilir. cDNA'nın başlatılmasından önce Kazak konsensüs sırasını eklemeyi unutmayın. Asc1 kısıtlama enzimi tarafından sindirilir ve CD'yi ve kesici ucu omurgaya sokun.

Vactor, yani pKhR26-IBFP IBP son hedefleme konsantresi kabı, her biri, kb beş asal ve üç asal homolog kol. İfade döküm seti, Koonin bölgesinin bir Iris'e bağlanmasını istiyorsanız, VFD muhabiri ve poli AC fonları varsa, bir CG organizatörü, UST restoranı içerir. Son olarak, EcoR1 veya BamH1 gibi benzersiz kesici enzimler kullanılarak ufuk hedefleme vektörü, sindirmeler ve ürün elektroporasyon notları üzerine eksi 20 derecelik bir mağazada saflaştırılır.

Yüksek konsantrasyonda doğrusal vektör DNA'sı elde etmek önerilir. Üçüncü bölüm:Makrofaj ve T hücre çizgilerinin elektroporasyon, Geritalk hücreleri için izlenen hücre kültürünü hazırlar. Optimal hücre yoğunluğu transfeksiyon sırasında ML başına yaklaşık 0,5 milyon hücre idi.

On makro küçük nükleer moda uç formatında tam elektroporasyon, her kuyuda antibiyotik içermeyen 500 mikroliter tam büyüme içeren 24 kuyu plakası hazırlar. Plakaları nemlendirilmiş 37 derece olarak önceden ısıt, %5'i bu ayar inkübatörü kaplıyor. Jet cat veya Rosales için elektrik çalışma sistemi giriş elektroporasyon parametrelerini kısın.

Hücre DNA karışımı takipleri hazırlayın veya operasyon tavuk hücrelerini toplayın. Curchin 15 hayvanda 25 santimetrekare şişe transfer hücreleri. Tüp kullandığına göre, oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 90 kat G'de centrofugation ile hücreleri Phillip, bunu iste, süpernatantlar.

Yıkama için, hücreleri beş ML PBS ile yeniden biriktirin, ardından hücre süspansiyonunu önceki adımla aynı durumu kullanarak santrifüjleme ile döndürün. DPP'leri kaldırın. Ve iki ML DBS kullanarak hücre yastıklarını yeniden kullan.

Mikro küçük hücre süspansiyonu kalırsınız ve hücre sayısı yük örneğini sayma yuvası olarak tahmin etmek için% 0.2 Trepan Ballou eşit hacmiyle karıştırırsınız, otomatik hücre Connor'a Connie slaytı yerleştirin ve görüntünün kendilerini görüntüleyin. O zaman bir hücre sayısı sonucu alın. 2 milyon hücre hesaplayın, vurma deneyi başına elektroporasyon ününü bulacak, hücre sayısını santrifüjleme ile iki pelet hücresine 1,5 ML.Santrifüjüne aktarın.

Zaman kazanmak için, CRISPR CAS dokuz vektör 2.4 mikrogram Belinda pirinci, konuşkan vektör ve yeniden süspansiyon Buffalo'nun her birinin 2,5 mikrogramını ekleyen santrifüjizasyon sırasında elektroporasyon karışımı hazırlanabilir. Yeni bir 1,5 ML santrifüjlü tüpte toplam 55 makro çöp hacmimiz hafifçe tepe noktası ve. Kısa bir süre iyice karıştırmak için durun.

Kullanmadan önce Luxor basınç karışımını ve oda sıcaklığını bırakın. Aspart döndükten sonra, DTB esasen 30 saniye daha kaynaşır, hazırlanan elektroporasyon karışımı pipeti yavaşça yukarı ve aşağı ekleyerek hücreleri mümkün olduğunca fazla yeniden askıya alın. Elektroporasyon 10 mikro küçük nükleer fraksiyon ucu kullanarak hücre elektroporasyon mikserini istedi pipetler önemliydi.

Pi petting sırasında hava kabarcıklarından kaçının, elektroliz arızasına mal olur. Başlangı çatır.'a basın. daha sonra işlem örneği bir süre içinde aktarır.

24 kuyu, brüt ortam ön uyarı ile kuyu plakalar kalan dört çoğaltılmış numune üzerinde yukarıdaki gibi aynı elektrik basıncını ve prosedürlerini gerçekleştirmek, hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 37 derecelik inkübatörde 48 ila 72 saat kuluçkaya yatırın. Aslında, hücre sıralama Transfeksiyondan 24 saat sonra, bizim için temsilciden ayrılmış floresan mikroskopi kullanarak restoran muhabiri için disrupt two ifadesini incelemek, elektroporasyonun düzgün çalıştığını gösterir.

Bölüm 4: putatif knock-in hücrelerini izole etmek için hücre sıralama. Hücre sıralama hazırlamadan önce, 150 mikro az hücre tipine özgü brüt ortama sahip 96 kuyu plakasında, kültür ve kendisi için yanlış alt mikro yer kullanın ve tüm hücreler için düz alt mikro yer, tüpü buzda tutmak ve kutuyu pencereden yola koymak için hücreleri steril bir FACS'a aktarır, uygulanabilir olduğunda hücre sıralama odasına bağlanmak, en uygun hücre evamizliğini ve sağkalımını elde etmek için bağışıklık hücresi sıralama için 85 mikro metre nozul ve düşük akış hızına sahip hücre sıralayıcısı, doğrudan pencere köşesinden kısa bir süre numune alın ve örneği alımlara yükleyin. Champer, hücre sıralama için olgu pateni kurdu, önce Ford saçılım ve yan dağılım için satış hunilerini tanımladı, ardından set konuşmalarını kırmızı negatif hücreler kazanarak yaşam hücrelerini tanımladı.

Daha sonra, FSC H ve FSE'yi çok çeşitli bir blok kullanarak tekli gating ile canlı bir tek hücre bulurlar. Son olarak, hücrelerin CRISPR vektörü ve cep vektörü ile başarılı bir şekilde enfekte olduğunu gösteren Volvo pozitif alt nüfus ise, istenen DSR iki ve B için bir kapı ayarlayın. Yani 96'nın her kuyusunda 10 tek hücre, ön ısıtma ile desteklenmiş kuyu plakası, 96'yı kuluçkaya yatırdıktan sonra dönem modu veya tek hücre modunu kullanarak tam büyüme ortamı, hücre genişlemesi için hücre kültürü inkübatöründeki kuyu plakaları.

Bölüm beş:pozitif darbe hücrelerinin yükselmesinin taranması Hayatta kalanları yaklaşık iki hafta boyunca hücre genişlemesinden sonra, 48 kuyu plakasındaki hücreler, duvar tipi hücreleri negatif kontrol hücresi popülasyonları olarak kullanarak küçük bir çoğalma oranı kullanarak BFP veya akış sitometrisinin ekspresyonunu değerlendirir, BFP pozitif hücrelerinin daha yüksek yüzdesine sahip olmak, genomik DNA'yı ifade etmemiz gereken hücrelerden doğrulamak için tutulur. BFP, izole edilmiş genomik DNA'yı PCR ile homolog kolların her iki tarafına yayılan astarlarla, yani genomik dizideki bir birincil konumla, hedefleme vektörüne dıştan geçirir. Bu deneyde vektörle konuşmanın görülen tarafı, birincil ile yükseltilen PCR ürününün tahmini boyutu 1,2 KV'dir. Ve F iki ve R iki ile 1.2 KB Sanger sıralama sonuçlarıdır. Yani PCR ürünleri, Rosa 26 Lucas'a doğru ve darbe pozisyonunu gösteren her entegrasyon kavşağının dizilerini gösterir.

İmmün şişkinlik gibi protein seviyesi bölüm altı temsili sonuçlarda doğru vurma doğrulama sağlar diyorum. Örnek olarak, önceki çalışmada yayınlanan, 45 molekülün bir OSD etiketi ile inter'i tutturduğunu ve ödeme T hücrelerinde 26 lokus olduğunu ve daha sonra USD tact olduğunu ifade ettik. 45 ve olay yönetmeni alıyorum ya da yakınlık arınması ve kütle spektrometresine maruz kaldığım için aşağı çekiliyorum.

Verileri proteomik olarak T hücrelerinin etkileşimini ortaya çıkardı. Bu nedenle bu ürün havuzu, belirli bir proteinin işlevini aydınlatmak için yeni interkalatörlerin aranmasını büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Bu teknik sunum, geçici olarak ifade edilen, konuşan vektör ile birlikte ifade edilen dökme hat RFP başına arttığını ve Rosa 26 locus için BFP olduğunu göstermiştir.

Hem T hücrelerinde hem de makrofajlarda kalıcı gen ekspresy ekspresyonlu, genetik manipülasyonlarda gerçekleştirilmesi zor olan darbeli hücre çizgileri oluşturduk. Bu yöntemler ve öneriler, proteinin tanımlanması, protein etkileşimi çalışması gibi bağışıklık hücrelerinin mekanistik çalışmaları için büyük DNA segmentinin iddialarında izin verilen Chris için geçerlidir.