Name: MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Keşfedin CRISPR/Cas9 ile makrofaj ve T hücre hatlarında gen knock-in protokolünü. Floresan reporterler ve hücre sıralama kullanarak ilaç seçimi olmadan verimli gen entegrasyonu sağlayan bu yöntem, immün hücrelerde fonksiyonel genomik araştırmaları kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Xinxiang Tıp Üniversitesi'nin akış sitometri çekirdek tesisine teşekkür ederiz. Bu teknolojinin geliştirilmesi, NSFC'nin LZ, 81471595 ve 32070898 YL'ye 81601360 vermesiyle desteklenmiştir. Çalışma ayrıca 21IRTSTHN030 sayılı Henan Eğitim Komitesi Vakfı tarafından da desteklenmektedir.

1. Rosa26 Locus'u Hedefleyen sgRNA'ların Tasarımı ve Plazmid İnşaatı
<ol><li>İstenilen ekleme sitesinin etrafında tasarım kılavuzu RNA'ları
	<ol>
<li>Fare Rosa26 için ekleme sitesinin (bundan böyle mRosa26olarak belirlenmiştir) çalma deneylerinin mRosa26'nınilk intronunda bulunduğundan emin olun; bu site önceki çalışmalarda kullanılmıştır28,29. İnsan hücrelerinde darbe deneyleri için, ekleme bölgesinin mRosa2630'uninsan homolog'u olarak tanımlanan insan ROSA26 locusunda (bundan sonra hROSA26olarak anılacaktır) bulunduğundan emin olun.</li>
		<li>Sırasıyla Fare Genom Enformatik (http://www.informatics.jax.org/) ve Ensembl genom tarayıcısından (http://www.ensembl.org/index.html) elde edilen fare ve insan türlerinin genomik dizilerini kullanın. İstenilen ekleme bölgesini kuşayan her iki tarafta mRosa26 veya hROSA26 lokusun genomik dizisinin 50 baz çiftini (bp) kopyalayın.</li>
		<li>Çevrimiçi web aracı CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31kullanarak tasarım kılavuzu RNA'lar . 100 bp giriş sırasını 1.1.2'den yapıştırın. Yüksek özgüllük puanı, yüksek verimlilik puanı ve düşük hedef dışı etkinlik içeren iki kılavuz RNA seçin. Ayrıca, daha yüksek Doench puanlarına sahip RNA kılavuzlarını seçin ve "Verimsiz" olarak etiketlenenlerden kaçının32. NOT: Alternatif CRISPR tasarım araçları da değerlidir ve örneğin Benchling CRISPR tasarım aracı (https://benchling.com/crispr) gibi herkese açıktır. CRISPR/Cas9 aracılı darbeli mutasyona uğramış hücrelerin sıklığını artırmak için, mümkün olduğunda istenen ekleme bölgesine yakın iki kılavuz RNA seçin33.</li>
		<li>mRosa26 lokus için, mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTCTAGAAGAT -3') ve mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') olarak belirlenmiş iki bitişik kılavuz RNA kullanın (Şekil 1A). hROSA26 lokus için, hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') ve hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') olmak üzere bitişik iki kılavuz RNA kullanın (Şekil 1B). NOT: mR26-sg1 ve mR26-sg2'nin genom düzenleme faaliyetleri ve hR26-sg1 ve hR26-sg2'nin genom düzenleme faaliyetleri sırasıyla RAW264.7 hücrelerinde ve Jurkat hücrelerinde değerlendirildi (Bkz. Ek Dosya, Şekil S1).</li>
	</ol></li>
	<li>Rosa26 Locus'u hedefleyen sgRNA içeren CRISPR ifade vektörlerinin klonlama
	<ol>
<li>Bir kılavuz RNA için ileri ve geri oligoları sentezle (Bkz. Tamamlayıcı Dosya). NOT: U6 promotörü tarafından yönlendirilen ifadeye yardımcı olan kılavuz dizisinin başlangıcına bir 'G' nükleotid eklemek tercih edilir. Örneğin, yukarıda belirtilen mR26-sg1'i klonlamak için, ileri oligo CACCGCTCCAGTCTCTAGAAGAT ve ters oligo AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC'dir. İleri oligodaki ek G ve ters oligodaki tamamlayıcısı kalın olarak belirtilir.</li>
		<li>Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/) tarafından geliştirilen gRNA klonlama için genel protokolü kullanarak önceki çalışmamızda üretilen pX458-DsRed2'de üretilen hepsi bir arada CRISPR ifade vektörüne kılavuz RNA'lara karşılık gelen klon sentetik oligolar21 (Şekil 1C); ancak, jel temizleme adımını atlayın ve bir PCR arıtma kiti kullanarak sindirilen vektörü arındırın (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Önceki protokollerde, BBSI sindirilen vektörün jel saflaştırılması yapıldı; ancak, bu adım zaman alıcıdır. Mevcut protokolde, sindirilen ürün bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılır ve genellikle benzer verimlilikte pozitif koloniler üreten aşağı akış ligasyon reaksiyonu için doğrudan kullanılır.</li>
		<li>Ligasyon ürününün 10 μL'lik kısmını (adım 1.2.2) üreticinin talimatlarına göre50 μL Escherichia coli DH5α yetkin hücrelere dönüştürün. Ampisilinli (100 μg/mL) bir LB agar plakasından rastgele üç koloni seçin ve her birini bir gecede kültleme için ampisilinli 3 mL LB ortamına aşıla.</li>
		<li>Sanger dizilimi için geceleme bakteri kültürünün 1 mL'sini kullanın ve yapının doğru olduğu onaylanana kadar geri kalanını 4 °C'de tutun: mRosa26 locus knock-in için pDsR-mR26-sg1 ve pDsR-mR26-sg2, ve hROSA26 lokus için pDsR-hR26-sg1 ve pDsR-hR26-sg2. </li>
		<li>Transeksiyon sınıfı plazmidlerin saflaştırılması için bir maxiprep kiti ile yüksek konsantrasyonda plazmid DNA (yaklaşık 2 μg/μL) hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Homolog Rekombinasyon Şablonları Olarak Hedefleme Vektörlerinin Tasarımı ve İnşası
<ol><li>
Homolojiye yönelik bir onarım şablonu tasarlama
	<ol>
<li>Önceki bir çalışmadan optimize edilmiş bir ifade kaseti kullanarak İçN'yi tam olarak ifade etmek için bir hedefleme vektörü tasarlayın29, bir CAG hibrit promotörü, İçN'nin cDNA'sının klonlanmasına izin veren bir AscI kısıtlama sitesi, bir IRES-EBFP2 muhabiri ve bir sığır büyüme hormonu poliadenilasyonu (bGH-polyA) sinyali (Şekil 1B ve Tamamlayıcı Dosya).</li>
		<li>Homolojiyi mRosa26 veya hROSA26 lokusun genomik dizileriyle paylaşan homoloji kolları (HAs) tasarlayın. İfade kasetinin solunda istenen ekleme sitesinden yukarı akış genomik dizisine karşılık gelen 5' HA'nın ~1 kb'ını ekleyin. Benzer şekilde, ifade kasetinin sağındaki ekleme sitesinden aşağı akış genomik dizisine karşılık gelen 3' HA'nın ~1 kb'ını ekleyin. NOT: İfade kaseti CRISPR/Cas9 dekolte sitelerine mümkün olduğunca yakın yerleştirilir34. Hedeflenen alellerin CRISPR/Cas9 tarafından yeniden kesilmesini önlemek için, nükleotid değişikliklerini hedefleme vektörü 34,35'teki protospacer bitişik motif (PAM) dizisine (5'-NGG-3') ekleyin.</li>
		<li>Hedefleme vektörün doğrusallaştırılmasına izin vermek için, 5' HA'nın hemen yukarısına benzersiz bir EcoRI sitesi ve 3' HA'nın hemen aşağısında benzersiz bir BamHI sitesi ekleyin.</li>
		<li>Ticari bir satıcının hedefleme vektörlerini sentezlemesi ve bunları sırasıyla mRosa26 ve hROSA26 çalma için pKR26-iBFP ve pKhR26-iBFP olarak belirlemesini sağlayın. </li>
	</ol>
</li>
	<li>
Homolojiye yönelik onarım şablonu olarak hedefleme vektörü oluşturma
	<ol>
<li>İçN'yi ifade etmek için, Ensembl genom tarayıcısından cDNA dizisini (kodlama dizisi) alın ve en uzun protein dizisine sahip transkripti seçin. Örneğin, insan ACE2 geninin cDNA'si ACE2-202 ENST00000427411.2 ve insan RASGRP1 geninin cDNA'si RASGRP1 ENSG00000172575'tir.</li>
		<li>İçN'nin cDNA'sını ticari bir satıcının yardımıyla sentezleyin. CDNA'yı PCR amplifikasyonu ile klonlamak da mümkündür (burada açıklanmaz). Bir AscI kısıtlama sitesi (italik ve kalın) ve Kozak konsensüs çeviri başlatma sitesini (altı çizili) içeren GGCGCGCCACC (5' - 3'), cDNA'nın ATG başlatma kodonunun ve başka bir AscI kısıtlama sitesinin (5'- GGCGCGCC -3') cDNA'nın durdurma kodonunun hemen önüne yerleştirin.</li>
		<li>Sentezlenen diziyi AscI ile sindirin ve üreticilerin talimatlarını izleyerek kısıtlama sindirimi sonrası DNA parçalarını arındırmak için tasarlanmış bir PCR saflaştırma kiti kullanarak arındırın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Saflaştırılmış cDNA kesici ucu, üreticinin talimatlarını izleyerek T4 DNA ligase kullanarak AscI doğrusallaştırılmış omurga vektörü pKR26-iBFP veya pKhR26-iBFP'ye yapıştırın.</li>
		<li>Sıralama yaparak son hedefleme vektörü olan pKR26-POI-iBFP veya pKhR26-POI-iBFP'yi doğrulayın. Doğrulanmış yapıları üreticinin protokolüne göre saflaştırmak için maxiprep kullanın.</li>
		<li>EcoRI veya BamHI kullanarak hedefleme vektörüne sindirin ve üreticinin talimatlarına göre bir PCR arıtma kiti kullanarak sindirim ürününü arındırın. Doğrusallaştırılmış hedefleme vektörü (~0,8 μg/μL) elektroporasyona kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Makrofaj ve T Hücre Hatlarının Elektropozasyonu
<ol><li>Hücre kültürlerini elektroporasyona hazırlayın
	<ol>
<li>Jurkat T hücreleri için tam büyüme ortamı olarak %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640'ı hazırlayın. RAW264.7 makrofajları kültleme için Dulbecco'nun %10 FBS ile Modifiye Kartal Ortasını (DMEM) hazırlayın. Hücre sıralamadan önce transfeksiyon sonrası inkübasyon için kullanılan ortamlar dışında tüm komple büyüme ortamlarını 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomilin (Pen/Strep) ile destekleyin.</li>
		<li>RAW264.7 ve Jurkat T hücrelerinin alt kültürlerini tedarikçinin talimatlarına göre gerçekleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu). RAW264.7 hücrelerini alt kültüre ederken, hücreleri ayırmak için tripsin-EDTA çözeltisini (%0.25) kullanın. RAW264.7 ve Jurkat hücreleri için kriyoprezervasyon aracı olarak %10 (v/v) DMSO ile desteklenmiş FBS kullanın.</li>
		<li>RAW264.7 makrofajlar için 5 dakika ve Jurkat T hücreleri için 8 dakika boyunca 90 × g için 250 × g'da hücre toplayın. Daha sonra 5-10 mL 1× DPBS ile yıkayın (Ca2+ veya Mg2+ iyonları olmadan). DPBS'yi kaldırın.</li>
		<li>2 mL 1× DPBS kullanarak hücre peletini yeniden diriltin. 10 μL hücre kullanın ve hücre sayısını ve canlılığını tahmin etmek için% 0,2 trippan mavisi eşit hacimle karıştırın. NOT: Transfection gününde hücre kültürünün %90'> canlı olduğundan emin olun.</li>
		<li>Tek bir darbe deneyi için, beş tekrarla 10 μL nükleofeksiyon uçları ile elektroporasyon gerçekleştirin. 2.0 × 106 hücre için gereken hacmi hesaplayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın. Hücre peletini adım 3.1.3'te açıklandığı gibi 1× DPBS ile tekrar yıkayın. NOT: 10 μL nükleofeksiyon uçları kullanırken, elektroporasyon başına 4,0 ×10 5 hücreye ihtiyaç vardır. Buna göre, bir darbe deneyi için en az 2.0 ×10 6 hücre hazırlayın.</li>
		<li>Pen/Strep olmadan kuyu başına 0,5 mL tam büyüme ortamına sahip 24 kuyu plakası hazırlayın (adım 3,1,1'de hazırlanır) ve 37 °C inkübatörde ön ısıtma.</li>
	</ol></li>
	<li>CRISPR/Cas9 bileşenlerinin elektroporasyon ve hedefleme vektörü
	<ol>
<li>Elektroporasyon sistemini açın. Önceki bir çalışmada optimize edilmiş elektroporasyon parametrelerini kullanın21: RAW264.7 makrofajlar için 1.400 V/20 ms/2 darbe ve Jurkat T hücreleri için 1350 V/20 ms/2 darbe.</li>
		<li>Pipetleme nedeniyle numune kaybını hesaba katarak, her CRISPR/Cas9 vektörün 2,5 μg'sini, doğrusallaştırılmış hedefleme vektörün 2,4 μg'sini ve Resuspension Buffer R'yi içeren steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 55 μL elektroporasyon karışımı hazırlayın. NOT: Zaman kazanmak için elektroporasyon karışımı santrifüjleme sırasında hazırlanabilir (adım 3.1.5).</li>
		<li>3.2.2 adımından itibaren 55 μL elektroporasyon karışımında 2.0 × 106 hücreyi (adım 3.1.5'te hazırlanmış) yeniden biriktirin.</li>
		<li>Hücre/elektroporasyon karışımını pipetli 10 μL nükleofeksiyon ucu kullanarak adım 3.2.3'ten itibaren epire edin. NOT: Pipetleme sırasında, elektroporasyon arızasına neden olabilecek hava kabarcıklarını tanıtmaktan kaçının.</li>
		<li>Numuneyi elektroporasyon kitinden 3 mL Tampon E ile dolu bir tüpe ekleyin.</li>
		<li>Adım 3.2.1'de açıklandığı gibi iki hücre tipi için elektroporasyon parametrelerini uygulayın.</li>
		<li>Numuneyi adım 3.1.6'dan itibaren önceden ısıtılmış orta ile 24 kuyu plakasının bir kuyusuna aktarın.</li>
		<li>Diğer dört yinelemenin yanı sıra yalnızca hedefleme vektörü ve yalnızca CRISPR ifade vektörü denetimleri için 3.2.4-3.2.7 adımlarını yineleyin. NOT: Farklı bir hücre tipine/plazmid DNA'sına geçerken nükleofeksiyon ucunu ve tüpünü değiştirin.</li>
		<li>Akış sitometri analizi veya floresanla aktive hücre sıralama (FACS) öncesinde CRISPR/Cas9 bileşenlerinin elektroporasyon ve ekspresyasyonundan sonra iyileşmeye izin vermek için transfected hücreleri 48-72 saat boyunca kültüre edin. DsRed2'nin ifadesini, transfeksiyon sonrası 24 saat kırmızı bir kanalla donatılmış floresan mikroskop kullanarak inceleyin. NOT: DsRed2 floresan hücrelerini izlemenin bir yararı, elektroporasyonun verimliliğinin tahmin edilebilmesi ve daha fazla hücre sıralama için uygunluğun tahmin edilebilmesidir.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Putatif Knock-in Hücrelerini İzole Etmek için Hücre Sıralama
<ol><li>FACS sıralamadan önce, transfected hücreleri bir kez tam büyüme ortamı ile yıkayın. 3.1.3 adımında açıklandığı gibi santrifüjleme ile pelet hücreleri ve peletin 500 μL taze ortamda yeniden dirildi.</li>
	<li>Hücre sıralayıcısını (biyogüvenlik kabininde bulunur) 85 μm nozul ve düşük akış hızı ile ayarlayın. Sıralama için "tek hücre" modunu seçin ve 20-30 hücreyi 96 kuyulu mikro plakanın kapağına sıralayarak tek hücre sıralama verimliliğini ve hassasiyetini test edin. Her kuyunun ortasına lokalize edilmiş bir damlacık, cihazın uygun şekilde ayarını gösterir.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu adım 4.1'den steril FACS tüplerine aktarın ve SYTOX Kırmızı Ölü Hücre Lekesi'ni 1 nM'lik son konsantrasyona ekleyin.</li>
	<li>Hücre sıralayıcısındaki örnekleri analiz edin. SYTOX Red ve EBFP2, 405 nm lazer ile heyecanlanır ve sırasıyla V450/BV421 ve APC kanalları tarafından tespit edilir. DsRed2, 488 nm lazer ile heyecanlanır ve PE kanalı tarafından algılanır. Spektral kompanzasyon için kontrol olarak transknakte olmayan hücreleri ve EBFP2 ve DsRed2-tek pozitif hücreleri kullanın.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış tam büyüme ortamının kuyusu başına 150 μL içeren 96 kuyulu bir mikro plakanın her kuyusuna 10 tek hücre sıralayın. Jurkat T hücreleri gibi süspansiyon hücre hatlarını kültleme için yuvarlak alt mikro plakalar ve yandaş RAW264.7 makrofajlar için düz alt mikro plakalar kullanın. NOT: Kuyu başına 10 hücrenin sıralanıyor olması, hücre sağkalımını iyileştirmek ve tohumlaması gereken 96 kuyu mikro plakalarının sayısını ve akış sitometrisi ve genotipleme ile taranması gereken numune sayısını en aza indirmek için optimize edilmiş bir stratejidir; kuyu başına yalnızca bir hücre sıralanıyorsa, doğru düzenlenmiş hücreler elde etme şansını artırmak için daha fazla mikro plakanın tohumlantır.</li>
</ol>5. Pozitif Darbe hücrelerinin taranıp doğrulanması
<ol><li>
Akış sitometrisine göre aday darbe hücreleri için tarama
	<ol>
<li>Hücreleri 10-15 gün boyunca 4.5 adımından kuluçkaya yatırın ve buharlaşma yoluyla kaybedilen sıvıyı değiştirmek için her 3 günde bir tam büyüme ortamı ekleyin. Jurkat T hücreleri için, hücre çoğalmasını optimize etmek için yuvarlak alt 96 kuyu plakasında yetişen hücreleri düz bir alt plakaya aktarın.</li>
		<li>Daha fazla genişleme için genişletilmiş sıralanmış hücreleri 48 kuyu plakalarına aktarın.</li>
		<li>Hücreler birleştiğinde, akış sitometrisine göre EBFP2 ifadesini taramak için kültürün yarısını kullanın (Şekil 3). Normalde, bir arada büyümeden sonra kültürün yarısı 0,5-1,0 × 105 hücreye eşittir, bu da bir örneğin akış sitometrisi ile analizi için yeterlidir.</li>
		<li>Daha fazla çoğalma için kalan hücreleri 24 kuyu plakasına aktarın.</li>
		<li>Daha fazla genotipleme deneyi için aday hücre popülasyonlarını yüksek oranda EBFP2 pozitif hücreye sahip tutun. NOT: 10 hücre 96 kuyulu mikro plakanın her kuyusuna sıralandığı için, darbe hücrelerinin darbe genini ifade etmeyen hücrelerle büyümesi mümkündür. Bu nedenle, EBFP2 pozitif hücreleri negatif hücrelerden ayırmak için ek bir hücre sıralama turu gerçekleştirmek normaldir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR ve sıralama ile aday içeri çalma hücreleri için tarama
	<ol>
<li>2 × 105 aday hücre toplayın. DNA hazırlık kiti kullanarak genomik DNA'nınçıkarılmasını (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Tam homolojiye yönelik onarımın (HDR) aday darbe hücrelerinin genomunda rastgele bölgelerde değil, mRosa26 lokusunda meydana geldiğini doğrulamak için, HA'ların her iki tarafını kapsayan astarlarla PCR gerçekleştirin (Şekil 4). Hedefleme vektörü (dış oligo) dışında genomik bölgede bulunan bir astarı ve hedefleme vektörün (iç oligo) içinde bulunan başka bir astar seçin. NOT: Benzer bir tasarım, hROSA26 lokusunda HDR'yi doğrulamak için kullanılır. PCR astarları, İçN dizisinin eklenmesini tespit etmek için de kolayca tasarlanabilir. Ek olarak, vahşi tip ve darbeli alel genotipleri aynı anda üç astarlı PCR kullanılarak tespit edilebilir (Bkz. Ek Dosya, Şekil S2).</li>
		<li>Pozitif PCR ürünlerini hızlı klonlama kiti kullanarak klonlama (bkz. Malzeme Tablosu). Reaksiyon karışımını DH5α yetkin hücrelere dönüştürün.</li>
		<li>Dönüşüm başına rastgele 8-10 bireysel bakteri kolonisi seçin ve Sanger dizilimi ile PCR ürünlerini adım 5.2.3'ten diziler.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pozitif darbe hücrelerinin immünoblot analizi ve benzeşim saflaştırması ile doğrulanması NOT: Aday hücreler, İçN'nin yerleştirilmesinin doğrulanması için immünoblot analizine veya protein-protein etkileşimi çalışmaları için benzeşim saflaştırmasına (AP) tabi tutulur.<ol>
<li>Antikor üreticisinin talimatlarına göre immünoblot analizi yapın. Birincil antikorların ve ikincil antikorların kullanımı hakkında bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.</li>
		<li>Ost etiketli İçN'yi ifade eden darbe hücrelerinin lysates'lerini, üreticinin talimatlarını takip eden Strep-Tactin Sepharose boncuklarını kullanarak AP'ye tabidir (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Bir görüntüleyicı kullanarak chemiluminescence tespit edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Deneylerimizde, örnek olarak insan Jurkat T hücreleri ve murine RAW264.7 makrofajlarını kullanarak yapı tasarımından knock-in hücre taramasına ve doğrulamasına kadar bağışıklık hücrelerinde nasıl knock-in düzenlemenin gerçekleştirildiğini gösterdik. Hem T hücresi hem de makrofaj hücre hatları transfection36,37'yekarşı dirençlidir; bununla birlikte, CRISPR/Cas9 teslimatının düşük verimlilik sorunu, hücre sıralama ile birlikte floresan muhabirlerin yardımıyla aşıla...

Bağışıklık hücreleri patojenlere karşı savunma için kritik öneme sahiptir. Enfekte edicilerin temizlenmesi ve doku homeostazının bakımı için hem doğuştan gelen hem de uyarlanabilir bağışıklık gereklidir1,2. Hücre hattı modelleri, memeli bağışıklık sisteminin moleküler temellerini anlamak için temel araçlardır; insan T hücre aktivasyonunu modellemek gibi in vitro fonksiyonel tahlillerde ve immün yanıtların etkinleştirilmesinde veya sönümlemesinde genetik faktörlerin işlevinin belirlenmesinde kullanılırlar3,4. Memeli bağışıklık sisteminin son derece heterojen olduğunu ve aynı derecede önemli olan çok sayıda molekülün belirli bir hücre tipinin farklılaşmasını, göçlerini ve işlevini kontrol ettiğini belirtmek önemlidir5,6.
Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)/Cas9 genom düzenleme araçları, genlerin kesin bir şekilde fonksiyonel ek açıklamalarını kolaylaştıran belirli hücre türlerinin genetik manipülasyonuna izin verir7,8. Yayınlanan birkaç protokol, CRISPR/Cas9'un HEK293 hücrelerinde ribonükleoproteinler (RNP' ler) olarak bilinen Cas9 kılavuzlu RNA kompleksleri, Jurkat hücre hatları, birincil T hücreleri9,10,makrofajlar11 , 12,13,kök hücreler 14 ve diğerleri15,16şeklinde teslimini tanımlamıştır. Bu protokollerde, gen etiketleme genellikle bir floresan etiketin endojen proteinlere kaynaştırılmasıyla elde edilir17,18. Bununla birlikte, özellikle bağışıklık hücrelerinde19,20darbeli deneyleri kolaylaştırmak için tek hücre sıralama ile uyumlu çift floresan muhabir kullanmak için çok az girişimde bulunulmuştır.
Yeni bir genetik faktörün bağışıklık hücrelerindeki işlevlerini anlamayı amaçlayan derinlemesine mekanistik analizler genellikle bir genin hücre tipi spesifik silinmesini, genetik kurtarma deneylerini ve etkileşimcilerinin ideal olarak tanımlanmasını gerektirir. İmmün hücrelerdeki genlerin genetik olarak silinmesinin optimizasyonu için yöntemler yayınlanmış olsa da, bağışıklık yanıtını anlamak için çok yönlü işlevlere sahip darbe alellerinin tanıtılması için9, 15,21, çok daha az yöntem bildirilmiştir. Bu nedenle, bu protokolde, hem insan hem de murine bağışıklık hücresi hatlarında güvenli liman locus Rosa26'da bir ilgi proteinini (POI) ifade etmek için verimli ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü ayrıntılı olarak tanımlamayı amaçlıyoruz. CRISPR/Cas9 (DsRed2) ifade eden plazmidlerle enfekte olmuş hücreler için zenginleştirmek için iki renkli bir muhabir sistemi ve hücre sıralama ile izole edilebilen bir rekombinant DNA şablonu (EBFP2) tasarladık. Bu protokolün ardından, kötü çalışılmış proteinlerin fonksiyonel analizleri için insan T hücre hattı Jurkat ve murine makrofaj RAW264.7'nin birden fazla darbe hattını elde ettik.
Örnek olarak, bu protokolde insan ACE2 'yi (SARS-Cov-2 reseptörü) 22'yi kasten ifade edenRAW264.7 makrofajlarının nasıl elde edeceğimizi gösteriyoruz. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri Covid-19 23 ,24 patogenezinde yer aldığı ve insan ACE2'nin replikasyondan önce hücrelere viral giriş için gerekli olan önemli bir reseptör olarak kabul edildiği için, insan ACE2'nin darbe aldığı makrofajlar, makrofajların içindeki viral çarpmanın mekanistik çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet edebilir. Buna paralel olarak, amino terminusunda Twin-Strep-tag (OST) benzeşimi ile kaynaşmış rasgrp1 proteinini ifade etmek için insan ROSA26 lokusunda bir genin çalınmasının bir örneğini de sunuyoruz. T hücreleri immün tedavilerde temel hedef hücrelerdir ve giderek artan sayıda çalışma kansere yanıt vermelerinin manipülasyonu üzerine odaklanmıştır25,26. Rasgrp1'in T hücre reseptörünün aşağı doğru önemli bir sinyal molekülü olduğu bilindiğinden ve etkileşimcileri iyi aydınlatılmamıştır27, OST-RASGRP1 knock-in modeli, T hücrelerinin tümörlere ve enfeksiyona tepkisini düzenleyen etkileşimcileri tanımlamak için temel sağlar. Birlikte ele alındığında, bu araçlar Covid-19 çalışmaları ve Rasgrp1 ile etkileşime giren yeni moleküllerin keşfi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>Ge</td><td>Kemilüminesans</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin, sodyum tuzu</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>194526</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı Antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>7074</td>, <td>1/5000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-RasGRP1 antikoru, klon 10.1</td><td>Merck</td><td>MABS146</td><td>1.0 & mu; g / mL çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Aktin (D6A8) Tavşan mAb</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>8457</td><td>1/1000 seyreltmede</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3539S</td><td></td></tr><tr><td>Cellometre Mini Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli DH5&alfa; Yetkili Hücreler</td><td>Takara</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetil Sülfoksit)</td> <td>MP Biyomedikal</td><td>196055</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Kan & Doku Kitleri</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>hücre kültürü reaktifi</td></tr><tr><td>DPBS (10X), kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun yüksek glikozlu Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria&ticaret; Biyogüvenlik</td><td>kabini ile donatılmış</td>Fusion <td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo sürüm 10.7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (D16H11) XP&nbsp; Tavşan mAb</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>5174</td>, <td>1/1000 seyreltmede</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, HRP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31430</td>, <td>1/5000 seyreltmede</td></tr><tr><td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrat</td><td>Millipore</td><td></td> WBKLS0500 <td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ PVDF Membran</td><td>Kırlangıç</td><td></td> ISEQ00010 <td></td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>194531</td><td></td></tr><tr><td>LB agar tozu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Çok Kanallı Pipet (30-300 & mu; L)</td> <td>Eppendorf veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfeksiyon Sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfeksiyon Sistemi, 10 & mu; L kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Konik Steril Santrifüj Tüpleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq&reg; Sıcak Başlangıç Hızlı Yükleme&reg; 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td> <td>(M0489)</td> <td>yüksek GC % şablonu için</td></tr><tr><td>PageRuler Önceden Boyanmış Protein Merdiveni, 10 ila 180 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Pipet ucu 0.1-20&mikro; l</td><td>Eppendorf veya benzeri</td><td>0030 075.005</td><td></td></tr><tr><td>Pipet ucu 2-200 & mikro; l</td><td>Eppendorf veya benzeri</td><td>0030 075.021</td><td></td></tr><tr><td>Pipet ucu 50-1000 & mikro; l</td><td>Eppendorf veya benzeri</td><td>0030 075.064</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Maxi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>pX458-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>112219</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>plazmiti kısıtlama sindiriminden arındırır</td></tr><tr><td>Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Sadakat 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>https://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>Rekombinant Anti-ACE2 antikoru [EPR4435(2)]</td><td>Abcam</td><td>ab108252</td>, <td>1/1000 seyreltmede</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta HyClone</td><td></td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Taktin Sefaroz boncukları</td><td>IBA Yaşam Bilimleri</td><td>2-1201-010</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX ve ticaret; Kırmızı Ölü Hücre Lekesi, 633 veya 635 nm uyarma için</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi (%0,25), fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher ile Bilimsel</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ZOE Floresan Hücre Görüntüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL mikrotüpler, PCR-clean</td><td>Eppendorf veya benzeri</td><td>0030 125.215</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu Şeffaf TC ile muamele edilmiş Çok Kuyulu Plakalar</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı Polistiren TC ile tedavi edilmiş Mikroplakalar</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu Şeffaf Yuvarlak Alt TC ile işlenmiş Mikroplaka</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr></tbody></table>

macrophage ve t hücre hatlarında crispr/cas9 ve hücre sıralama tarafından gen knock-in

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Bağışıklık sisteminin fonksiyonel genomik çalışmaları, hem hedef genlerin silinmesini hem de elementlerin ilgi çekici proteinlere eklenmesini içeren genetik manipülasyonlar gerektirir. Hücre hattı modellerinde gen fonksiyonlarının tanımlanması, gen keşfi ve hücre içi mekanizmaların araştırılması için önemlidir. Bununla birlikte, CRISPR/Cas9 aracılı darbe kullanan T hücreleri ve makrofaj hücre hatları gibi bağışıklık hücrelerinin genetik manipülasyonları, özellikle sessiz bir durumda, bu hücrelerin düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle zordur. Bağışıklık hücrelerindeki genleri değiştirmek için, ilaç direnci seçimi ve viral vektörler tipik olarak CRIPSR/Cas9 sistemini ifade eden hücreler için zenginleştirmek için kullanılır ve bu da kaçınılmaz olarak hücrelerin istenmeyen müdahalesiyle sonuçlanır. Daha önceki bir çalışmada, CRISPR/Cas9 ile birleştiğinde elektroporasyondan sonra geçici olarak ifade edilen çift floresan muhabir tasarladık. Bu teknik çözüm bağışıklık hücrelerinde hızlı gen silinmesine yol açar; bununla birlikte, T hücreleri ve makrofajlar gibi bağışıklık hücrelerinde ilaç direnci seçimi veya viral vektörler kullanmadan gen darbesi daha da zordur. Bu yazıda, Rosa26 lokusunu hedef alan CRISPR/Cas9 yapılarını donör plazmid ile birlikte geçici olarak ifade eden hücrelerin seçimine yardımcı olmak için hücre sıralamasını kullanarak, ilaç direnci zenginleştirmesi olmadan hem T hücrelerinde hem de makrofajlarda gen darbesi elde edilebileceğini gösteriyoruz. Örnek olarak, mevcut Covid-19 salgınından sorumlu sars-Cov-2'nin bir reseptörü olan insan ACE2'nin RAW264.7 makrofajlarında nasıl ifade edilebilir olduğunu, darbe deneyleri yaparak gösteriyoruz. Bu tür gen darbeli hücreler mekanistik çalışmalar için yaygın olarak kullanılabilir.

Yukarıda açıklanan protokolün ardından murine RAW264.7 makrofajlarını kullanarak mRosa26 lokusunda darbe deneyleri yapmak için SARS-Cov-2 virüsü için bir reseptör olan insan ACE2'yi ifade etmek için bir hedefleme vektörü tasarladık (Şekil 2A). Benzer bir tasarım kullanarak, OST etiketli RASGRP1 füzyon proteininin(Şekil 2C)çalınmasıyla insan Jurkat T hücreleri oluşturduk. crispr/cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 ve mRosa26 knock-in için pDsR-mR26-sg2 ...

Bu protokol, makrofaj ve T hücre satırlarındaki darbe denemelerini basitleştirmek için floresan muhabirleri ve hücre sıralamasını kullanır. Bu basitleştirilmiş knock-in deneyleri için iki plazmid kullanılır, yani CRISPR / Cas9- ve DsRed2 ifade eden plazmid ve bağışıklık hücrelerindeki Rosa26 lokusunda kalıcı olarak entegre edilen EBFP2'yi ifade eden homolog bir rekombinasyon donör plazmid.

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Bu protokolün amacı, floresan muhabirlerin yardımıyla makrofaj ve T hücre hatlarında CRISPR/Cas9 aracılı çalma deneyini basitleştirmek ve hücre sıralamasını etkilemektir. ROSA26 Locus, transgenes yerleştirilmesi için genomik güvenli liman bölgesi olarak bilinir. 26 çekirgenin fare dünyasında veya insan orto kütüğünde saldırı olsun ya da olmasın ilgi proteinini ifade etmek olağandır.Bölüm 1: Rosa26 Locus'u Hedefleyen sgRNA'ların Tasarımı ve Plasmid İnşaatı. İlk olarak, fare genom bilişiminden diziler kullanarak fare Rosa26 lokusundan sgRNA'lar tasarlayın ve Ensemble Genom Tarayıcısı, ardından fare Rosa26 geninin genomik dizisini indirin. Çevrimiçi web aracı CRISPOR'a gidin, Rosa26 Locus'tan giriş sırasının 100 baz çiftini yapıştırın.Ardından bir genom seçin, örneğin, Mus kas-fare referans genomu 2011. Ardından, PAM türünü seçin.Gönder'i tıklatın. Yüksek özgüllük puanı, yüksek yapma puanı ve daha az off hedefi olan kılavuzu seçin. Verimsiz olarak belirtilen kılavuzlardan kaçınılmalıdır.Özellikle, rapor edildiği gibi darbe verimliliğini artırabilecek çakışan sıralara sahip iki kılavuz seçmek tercih edilir. Sıcak yemek dizisi için, fosforlu tavlanmış ve faktöre klonlamaya hazır bir ileri yasadışı ve ters bir yasadışı sentezle. Vactor başına doğrusal düşüşü hazırlayın, bbs bir sindirim tarafından muhabirlik yapmak zorunda, Neal almak gibi, son yapıyı oluşturmak için doğrusal vektörün yasalları, aynı anda kılavuz RNA ve CAS dokuz çekirdeğini bir DSRIP iki floresan muhabiri ile bağlantılı olarak ifade eder.İkinci Bölüm:Homolog Rekombinasyon Şablonu Olarak Hedefleme Vektörü İnşaatı. İlgi proteininin ifadesi için. Örneğin, insan dayandı.CDNA dizisini ticari kaynak ve benzeşim OST etiketi veya proteinin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılan diğer saldırılara göre sentezlemek istiyorsanız, cDNA dizisine kaynaştırılabilir. cDNA'nın başlatılmasından önce Kazak konsensüs sırasını eklemeyi unutmayın. Asc1 kısıtlama enzimi tarafından sindirilir ve CD'yi ve kesici ucu omurgaya sokun.Vactor, yani pKhR26-IBFP IBP son hedefleme konsantresi kabı, her biri, kb beş asal ve üç asal homolog kol. İfade döküm seti, Koonin bölgesinin bir Iris'e bağlanmasını istiyorsanız, VFD muhabiri ve poli AC fonları varsa, bir CG organizatörü, UST restoranı içerir. Son olarak, EcoR1 veya BamH1 gibi benzersiz kesici enzimler kullanılarak ufuk hedefleme vektörü, sindirmeler ve ürün elektroporasyon notları üzerine eksi 20 derecelik bir mağazada saflaştırılır.Yüksek konsantrasyonda doğrusal vektör DNA'sı elde etmek önerilir. Üçüncü bölüm:Makrofaj ve T hücre çizgilerinin elektroporasyon, Geritalk hücreleri için izlenen hücre kültürünü hazırlar. Optimal hücre yoğunluğu transfeksiyon sırasında ML başına yaklaşık 0,5 milyon hücre idi.On makro küçük nükleer moda uç formatında tam elektroporasyon, her kuyuda antibiyotik içermeyen 500 mikroliter tam büyüme içeren 24 kuyu plakası hazırlar. Plakaları nemlendirilmiş 37 derece olarak önceden ısıt, %5'i bu ayar inkübatörü kaplıyor. Jet cat veya Rosales için elektrik çalışma sistemi giriş elektroporasyon parametrelerini kısın.Hücre DNA karışımı takipleri hazırlayın veya operasyon tavuk hücrelerini toplayın. Curchin 15 hayvanda 25 santimetrekare şişe transfer hücreleri. Tüp kullandığına göre, oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 90 kat G'de centrofugation ile hücreleri Phillip, bunu iste, süpernatantlar.Yıkama için, hücreleri beş ML PBS ile yeniden biriktirin, ardından hücre süspansiyonunu önceki adımla aynı durumu kullanarak santrifüjleme ile döndürün. DPP'leri kaldırın. Ve iki ML DBS kullanarak hücre yastıklarını yeniden kullan.Mikro küçük hücre süspansiyonu kalırsınız ve hücre sayısı yük örneğini sayma yuvası olarak tahmin etmek için% 0.2 Trepan Ballou eşit hacmiyle karıştırırsınız, otomatik hücre Connor'a Connie slaytı yerleştirin ve görüntünün kendilerini görüntüleyin. O zaman bir hücre sayısı sonucu alın. 2 milyon hücre hesaplayın, vurma deneyi başına elektroporasyon ününü bulacak, hücre sayısını santrifüjleme ile iki pelet hücresine 1,5 ML.Santrifüjüne aktarın.Zaman kazanmak için, CRISPR CAS dokuz vektör 2.4 mikrogram Belinda pirinci, konuşkan vektör ve yeniden süspansiyon Buffalo'nun her birinin 2,5 mikrogramını ekleyen santrifüjizasyon sırasında elektroporasyon karışımı hazırlanabilir. Yeni bir 1,5 ML santrifüjlü tüpte toplam 55 makro çöp hacmimiz hafifçe tepe noktası ve. Kısa bir süre iyice karıştırmak için durun.Kullanmadan önce Luxor basınç karışımını ve oda sıcaklığını bırakın. Aspart döndükten sonra, DTB esasen 30 saniye daha kaynaşır, hazırlanan elektroporasyon karışımı pipeti yavaşça yukarı ve aşağı ekleyerek hücreleri mümkün olduğunca fazla yeniden askıya alın. Elektroporasyon 10 mikro küçük nükleer fraksiyon ucu kullanarak hücre elektroporasyon mikserini istedi pipetler önemliydi.Pi petting sırasında hava kabarcıklarından kaçının, elektroliz arızasına mal olur. Başlangı çatır.'a basın. daha sonra işlem örneği bir süre içinde aktarır.24 kuyu, brüt ortam ön uyarı ile kuyu plakalar kalan dört çoğaltılmış numune üzerinde yukarıdaki gibi aynı elektrik basıncını ve prosedürlerini gerçekleştirmek, hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 37 derecelik inkübatörde 48 ila 72 saat kuluçkaya yatırın. Aslında, hücre sıralama Transfeksiyondan 24 saat sonra, bizim için temsilciden ayrılmış floresan mikroskopi kullanarak restoran muhabiri için disrupt two ifadesini incelemek, elektroporasyonun düzgün çalıştığını gösterir.Bölüm 4: putatif knock-in hücrelerini izole etmek için hücre sıralama. Hücre sıralama hazırlamadan önce, 150 mikro az hücre tipine özgü brüt ortama sahip 96 kuyu plakasında, kültür ve kendisi için yanlış alt mikro yer kullanın ve tüm hücreler için düz alt mikro yer, tüpü buzda tutmak ve kutuyu pencereden yola koymak için hücreleri steril bir FACS'a aktarır, uygulanabilir olduğunda hücre sıralama odasına bağlanmak, en uygun hücre evamizliğini ve sağkalımını elde etmek için bağışıklık hücresi sıralama için 85 mikro metre nozul ve düşük akış hızına sahip hücre sıralayıcısı, doğrudan pencere köşesinden kısa bir süre numune alın ve örneği alımlara yükleyin. Champer, hücre sıralama için olgu pateni kurdu, önce Ford saçılım ve yan dağılım için satış hunilerini tanımladı, ardından set konuşmalarını kırmızı negatif hücreler kazanarak yaşam hücrelerini tanımladı.Daha sonra, FSC H ve FSE'yi çok çeşitli bir blok kullanarak tekli gating ile canlı bir tek hücre bulurlar. Son olarak, hücrelerin CRISPR vektörü ve cep vektörü ile başarılı bir şekilde enfekte olduğunu gösteren Volvo pozitif alt nüfus ise, istenen DSR iki ve B için bir kapı ayarlayın. Yani 96'nın her kuyusunda 10 tek hücre, ön ısıtma ile desteklenmiş kuyu plakası, 96'yı kuluçkaya yatırdıktan sonra dönem modu veya tek hücre modunu kullanarak tam büyüme ortamı, hücre genişlemesi için hücre kültürü inkübatöründeki kuyu plakaları.Bölüm beş:pozitif darbe hücrelerinin yükselmesinin taranması Hayatta kalanları yaklaşık iki hafta boyunca hücre genişlemesinden sonra, 48 kuyu plakasındaki hücreler, duvar tipi hücreleri negatif kontrol hücresi popülasyonları olarak kullanarak küçük bir çoğalma oranı kullanarak BFP veya akış sitometrisinin ekspresyonunu değerlendirir, BFP pozitif hücrelerinin daha yüksek yüzdesine sahip olmak, genomik DNA'yı ifade etmemiz gereken hücrelerden doğrulamak için tutulur. BFP, izole edilmiş genomik DNA'yı PCR ile homolog kolların her iki tarafına yayılan astarlarla, yani genomik dizideki bir birincil konumla, hedefleme vektörüne dıştan geçirir. Bu deneyde vektörle konuşmanın görülen tarafı, birincil ile yükseltilen PCR ürününün tahmini boyutu 1,2 KV'dir. Ve F iki ve R iki ile 1.2 KB Sanger sıralama sonuçlarıdır. Yani PCR ürünleri, Rosa 26 Lucas'a doğru ve darbe pozisyonunu gösteren her entegrasyon kavşağının dizilerini gösterir.İmmün şişkinlik gibi protein seviyesi bölüm altı temsili sonuçlarda doğru vurma doğrulama sağlar diyorum. Örnek olarak, önceki çalışmada yayınlanan, 45 molekülün bir OSD etiketi ile inter'i tutturduğunu ve ödeme T hücrelerinde 26 lokus olduğunu ve daha sonra USD tact olduğunu ifade ettik. 45 ve olay yönetmeni alıyorum ya da yakınlık arınması ve kütle spektrometresine maruz kaldığım için aşağı çekiliyorum.Verileri proteomik olarak T hücrelerinin etkileşimini ortaya çıkardı. Bu nedenle bu ürün havuzu, belirli bir proteinin işlevini aydınlatmak için yeni interkalatörlerin aranmasını büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Bu teknik sunum, geçici olarak ifade edilen, konuşan vektör ile birlikte ifade edilen dökme hat RFP başına arttığını ve Rosa 26 locus için BFP olduğunu göstermiştir.Hem T hücrelerinde hem de makrofajlarda kalıcı gen ekspresy ekspresyonlu, genetik manipülasyonlarda gerçekleştirilmesi zor olan darbeli hücre çizgileri oluşturduk. Bu yöntemler ve öneriler, proteinin tanımlanması, protein etkileşimi çalışması gibi bağışıklık hücrelerinin mekanistik çalışmaları için büyük DNA segmentinin iddialarında izin verilen Chris için geçerlidir.

gene-knock-crisprcas9-cell-sorting-macrophage-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, Cas9 ve sgRNA'nın hücrelere tek bir plazmit yapısı olarak sağlandığı kültürlenmiş hücrelerde hepsi bir arada CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenlemeyi gösteriyoruz. CRISPR-Cas9 sistemi ve eklenmesi istenen gen, başarılı gen düzenlemesini kolaylaştırmak için elektroporasyon tekniği ile hücrelere sokuldu.

Hepsi Bir Arada CRISPR Genom Düzenleme: CRISPR-Cas9 Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Homoloji Odaklı Onarım Tabanlı Gen Knock-In İçin Bir Yöntem

Bu video, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak insan T hücrelerinde gen düzenlemesi yapmak için bir testi göstermektedir. Birincil CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin bir karışımı, nakavt için spesifik genleri hedefleyen bir CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi ile birleştirilir. Elektroporasyon üzerine, sgRNA, Cas9'u hedef DNA dizisine yönlendirerek hassas kesimler oluşturur. Bu kesikler daha sonra hücrenin homolog olmayan uç birleştirme mekanizması tarafından onarılır ve bu da gen nakavtına yol...

T Hücrelerinde Gen Düzenleme için Bir CRISPR-Cas9 Tekniği

Bu protokolde, Amaxa Nucleofector 96 kuyulu Mekik Sistemini kullanarak murin makrofaj hücre hatlarını siRNA'larla verimli bir şekilde transfekte etmek, makrofajları lipopolisakkarit ile uyarmak ve inflamatuar sitokin üretimi üzerindeki etkileri izlemek için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

CRISPR/Cas9 kullanarak hedeflenen gen düzenleme büyük ölçüde anlayış genlerin biyolojik fonksiyonların kolaylaştırdı. Burada, biz oncogenic faaliyetlerini incelemek için model calreticulin mutasyonların sitokin bağımlı hematopoetik hücreler için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmaktadır.

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

Bu protokol, in vitro olarak bir araya getirilen ve elektroporasyon yoluyla iletilen Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksleri kullanılarak fare kemik iliği türevi makrofajlarda genom düzenleme prosedürünü açıklar.

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

CRISPR ile ilgili protokoller giderek daha kullanışlı ve erişilebilir hale geldikçe, belirli deneysel koşullar altında komplikasyonlar ve engeller hala ortaya çıkabilir. Bu protokol, CRISPR/Cas9 kullanarak reseptörle etkileşime giren bir serin/treonin-protein kinaz 1 (RIPK1/RIP1) nakavt insan hücre hattının oluşturulmasını ana hatlarıyla belirtir ve bu işlem sırasında karşılaşılan potansiyel zorlukları vurgular.

CRISPR-Cas1 Sistemini Kullanarak Bir RIP937 Nakavt U9 Hücre Hattının Oluşturulması

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Keşfedin CRISPR/Cas9 ile makrofaj ve T hücre hatlarında gen knock-in protokolünü. Floresan reporterler ve hücre sıralama kullanarak ilaç seçimi olmadan verimli gen entegrasyonu sağlayan bu yöntem, immün hücrelerde fonksiyonel genomik araştırmaları kolaylaştırır.

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Daha fazla video keşfet