Name: Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Öğrenin DRaCALA yöntemiyle Escherichia coli'de (p)ppGpp gibi nükleotid türevli ikincil habercilerin bağlayıcı proteinlerini nasıl tanımlayacağınızı. Bu hızlı ve duyarlı sistem biyolojisi tekniği, bakteri fizyolojisi ve protein-ligand etkileşimleri alanında yeni etki proteinlerinin keşfine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışma, YEZ'e bir NNF Proje Hibesi (NNF19OC0058331) ve MlS'e Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması (Nº 801199) kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı tarafından desteklenmektedir.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Tüm hücre lysates hazırlanması
<ol><li>E. coli K-12 ASKA ORFeome toplama suşlarını 96 kuyu derinliğindeki kuyu plakalarında 25 μg/mL kloramfenikol içeren15 ile 1,5 mL Lysogeny et suyu (LB) içine aşılayın. 30 °C'de 18 saat boyunca gece boyunca (O/N) büyüyün ve 160 rpm'de sallanın. Ertesi gün, 6 saat boyunca 30 °C'de protein ekspresyona neden olmak için O/N kültürlerine izopropil β-d-1-tiyogalactopyranoside (IPTG) (son 0,5 mM) ekleyin.</li>
	<li>Pelet hücreleri 10 dakika boyunca 500 x g'da. Peletleri kullanıma kadar -80 °C'de dondurun. Hücreleri lyse etmek için 150 μL lizis tamponU L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2,peletin yeniden diriltmek için 2 mM fenillemetilsülfonil florür (PMSF), 40 μg / mL DNaz 1 ve 0.5 mg / mL lizozim) ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Hücreleri -80 °C'de 30 dakika dondurun ve ardından 37 °C'de 20 dakika çözün. Hücreleri renksiz etmek için bu döngüyü üç kez tekrarlayın. Kullanımdan önce lysates'i -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Relseq ve GppA'nın Saflaştırılması
NOT: Streptococcus equisimilis'ten Relseq ve E. coli K-12'den GppA proteinleri sırasıyla radyolabeled pppGpp ve ppGpp'yi sentezlemek için kullanılır.
<ol><li>Her proteini aşırı ifade eden hücreleri büyütün ve toplayın.<ol>
<li>E. coli BL21 DE3 zorluğunu LB suyunda üstel faza (optik yoğunluk (OD) ~0,3-0,4) kadar büyütün ve 5 dakika boyunca 6000 x g'da 1 mL kültür aşağı çevirin. Süpernatantı deklare edin ve hücreleri 100 μL buz gibi TSB suyu ile yeniden depola (LB suyu 0.1 g/mL PEG3350, 0.05 mL/ mL dimetilsüllfoksit, 20 mM MgCl2ile desteklenmiştir).</li>
		<li>Histidin etiketli relseq ve gppAtaşıyan plazmidleri, her 100 ng'yi TSB'deki yukarıdaki hücre süspansiyonlarıyla karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Hücreleri 40 s için 42 °C'de ısı şoku. Karışımı 2 dakika boyunca buza yerleştirin ve hücrelerin 160 rpm'de ajitasyonla 37 °C'de 1 saat boyunca iyileşmesini sağlamak için oda sıcaklığında 1 mL LB suyu ekleyin.</li>
		<li>Kurtarılan hücreleri LB agar plakalarında ilgili antibiyotiklerle birlikte plakalayın (Relseq:100μg/mL ampisilin; GppA: 30 μg/mL kanamycin). Ertesi gün, LB suyundaki kolonileri aşılayıp her iki türün de 37 °C'de O/N ön kültürlerine başlayın.</li>
		<li>18 saat sonra, 500 mL LB ortamını 10 mL O/N kültürleri ve ilgili antibiyotiklerle aşıla. 37 °C'de 160 rpm'de titreyerek kültürleri büyütün. OD600nm 0.5-0.7'ye ulaştığında, 0.5 mM IPTG ekleyerek ve 30 °C'de 3 saat boyunca 160 rpm'de sallanarak protein ekspresyona neden olan protein ekspresyona neden olan.</li>
		<li>4 °C'de 10 dakika boyunca 6084 x g'da dönerek hücreleri toplayın. Peleti 20 mL buz gibi 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve 1912 x g'da 4 °C'de 20 dakika boyunca yeniden santrifüjle yeniden depola. Süpernatantı dekant ve kullanmadan önce peletleri -20 °C'de dondurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nikel-nitrilotriyastik asit (Ni-NTA) benzeşim saflaştırması NOT: Bu noktadan sonra numunelerin soğuk olduğundan emin olun.<ol>
<li>40 mL buz gibi lizis tamponU L2 ekleyin (50 mM Tris pH 7.5, Peletin yeniden canlandırmak için proteaz inhibitörleri (EDTA içermeyen tablet; Malzeme Masasınabakın) ile desteklenmiş 150 mM NaCl, %5 gliserol, 10 mM imidazol, 10 mM β-mercaptoethanol. Hücreleri sonikasyon yoluyla lyse (60% genlik, 2 s ON / 4 s OFF 8 dk ON). 4 °C'de 40 dakika boyunca 23.426 x g'da dönerek lisatı temizleyin ve saflaştırma için süpernatant ile devam edin.</li>
		<li>Yukarıdaki santrifüjleme sırasında Ni-NTA reçinesini hazırlayın.<ol>
<li>500 μL homojenize Ni-NTA reçinesini ayakta duran bir polipropilen kromatografi sütununa aktarın ve 15 dakika yetinip depolama çözeltisinin akmasına izin verin. Reçineyi iki kez 15 mL ultra saf suyla yıkayın ve ardından sütunu 15 mL lizis tamponU L2 ile yıkayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Temizlenmiş hücre likırını 1. Kolonu 30 mL yıkama tamponu ile yıkayın (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, % 5 gliserol, 20 mM imidazol).</li>
		<li>Proteinleri 400 μL elution tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, % 5 gliserol, 500 mM imidazol) ile üç kez elute edin. Ardından, başka bir 300 μL elution tamponu ile tekrarlayın. Eluted proteinleri 700 μL'lik son bir hacimde birleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jel filtrasyonu<ol>
<li>Jel filtrasyon tamponu hazırlayın (50 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl; % 5 gliserol). Boyut dışlama sütununu jel filtrasyon arabelleği bir sütun hacmi (25 mL) ile yıkayın.</li>
		<li>Yukarıdaki 700 μL örneğini 500 μL döngü kullanarak yükleyin, 0,5 mL / dak'ta çalıştırın ve ilgili proteinleri içeren her biri 0,5 mL hacimde 2-3 fraksiyon toplayın.</li>
		<li>Bir spin sütunu kullanarak proteinlerin her birini içeren fraksiyonları birleştirin ve konsantre edin ve Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 32P etiketli pppGpp ve ppGpp sentezi
<ol><li>Küçük ölçekli bir Relseq reaksiyonını bir vida kapağı tüpüne monte edin (bkz. Tablo 1). NOT: Radyoaktif reaktiflerle yalnızca lisanslı bir yerde ve kişisel koruyucu ekipmanlarla çalışın.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Hacim (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Küçük ölçekli</td>
			<td>Büyük ölçekli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ultra saf su</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Relseq arabelleği*</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP (8 mM finali)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Relseq (4 μM finali)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>
32 P-α-Guanosine trifosfat (GTP) (son 120 nM) (DİkKAT)</td>
			<td>0.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>toplam</td>
			<td>20</td>
			<td>500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: 32P etiketli pppGpp'nin küçük ve büyük ölçekli sentez reaksiyonları için bilgilerin bir araya getirilir. *10x Relseq tamponu 250 mM Tris-HCl, pH 8.6 içerir; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Kısaltma: pppGpp = guanosin pentafosfat.
<ol start="2"><li>Tüpü 37 °C'de bir termomikserde 1 saat, daha sonra 95 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve 5 dakika boyunca buza yerleştirin. Çökeltilmiş proteini 5 dakika boyunca 15.700 x g'da aşağı çevirin ve süpernatantı (sentezlenmiş 32P-pppGpp) yeni bir vida kapağı tüpüne aktarın.</li>
	<li>32P-pppGpp'den 32P-ppGpp sentezlemek için, 32p-pppGpp ürününün yarısını yeni bir vidalı kapak tüpüne aktarın ve 1 μM GppA ekleyin. Tüpü 37 °C'de 10 dakika, 95 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 5 dakika boyunca buza yerleştirin.</li>
	<li>Çökeltilmiş proteini 5 dakika boyunca 15.700 x g'da aşağı çevirin ve süpernatantı (sentezlenmiş 32P-ppGpp) yeni bir vida kapağı tüpüne aktarın.</li>
	<li>32P-pppGpp ve 32P-ppGpp'yi, 1,5 M KH2PO 4 , pH 3.4'ü mobil faz olarak kullanarak ince tabaka kromatografisi (TLC) plakasında (polietileninemiilen modifiye selüloz TLC plakaları) 1 μL çalıştırarak analiz edin. NOT: Kontrol olarak α-32P etiketli guanosin 5'-trifosfat(32P-α-GTP) kullanın.</li>
	<li>TLC plakasını tamamen kurulayın, şeffaf bir plastik klasör arasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın. Fosforimager kullanarak sinyalleri görselleştirin ve ölçün. NOT: 32P-pppGpp ve 32P-ppGpp oranları% 85'ten yüksek olduğunda, büyük ölçekli bir reaksiyon (500 μL, tarama için yeterli 20 96 kuyu plakası) Masa 1kullanılarak monte edilebilir ve sentezlenebilir.</li>
</ol>4. (p)ppGpp hedef proteinlerinin DRaCALA taraması
<ol><li>20 μL tüm hücre lysates'i çözün ve 96 kuyulu V tabanlı bir mikroter plakasına aktarın. Serratia marcescens'ten2,5 U/well endonuclease ekleyin ve lysate viskozitesini azaltmak için 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Lysates'i 20 dakika boyunca buza yerleştirin.</li>
	<li>32P-pppGpp ve 32P-ppGpp'yi 1:1 oranında karıştırın ve (p)ppGpp'nin son konsantrasyonunun 4 nM'ye eşit olmasını sağlamak için 1x lizis tampon L1 ekleyin. NOT: pppGpp ve ppGpp arasındaki kimyasal benzerlik göz önüne alındığında, her iki kimyasalın bir karışımı tarama işlemini basitleştirecektir.</li>
	<li>(p)ppGpp karışımının 10 μL'sini hücre lisatıyla eklemek ve karıştırmak için çok kanallı pipet ve filtrelenmiş pipet uçları kullanın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>96 x pin aletini 30 s için %0,01 iyonik olmayan deterjan çözeltisine yerleştirerek yıkayın ve 30 sn boyunca bir kağıt mendil üzerinde kurulayın. Pim aletinin yıkanması 3x'i tekrarlayın.</li>
	<li>Pim aletini yukarıdaki 96 kuyulu numune plakalarının içine yerleştirin ve 30 sn bekleyin. Pim aletini düz bir şekilde kaldırın ve 30 sn boyunca bir nitroselüloz zarı üzerine yerleştirin. NOT: Bir nokta eksikse, ilgili numunelerin 2 μL'sini pipet ve filtrelenmiş uçlarla tespit edin. Aşağıda belirtildiği gibi aynı numunenin bir kopyasının yapılması önerilir.</li>
	<li>Rt'de membranı 5 dakika kurutun. Membranı şeffaf bir plastik klasör arasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın. Fosforimager kullanarak görselleştirin.</li>
</ol>5. Potansiyel hedef proteinlerin ölçülmesi ve tanımlanması
<ol><li>Görselleştirilmiş plakaların .gel dosyasını açmak için fosforimager ile ilişkili analiz yazılımını kullanın. 12 sütun x 8 satırlık bir kılavuz ayarlayarak 96 noktayı tanımlamak için Dizi çözümleme işlevini kullanın.</li>
	<li>Tüm noktaların dış kenarını çevrelemek için büyük daireler tanımlayın (bkz. Şekil 1B). Tanımlanan büyük dairelerin Volumn+Arka Planını ve Alanını dışa aktarın ve bir elektronik tabloya kaydedin. NOT: Gerekirse, her bir daireyi lekelerle mükemmel bir şekilde örtüşecek şekilde yeniden konumlandırın ve her bir daireyi gerçek noktadan biraz daha büyük hale getirmek için yeniden boyutlandırın.</li>
	<li>Küçük iç noktaları çevrelemek için tanımlanan daireleri küçültün. Tanımlanan küçük dairelerin Volumn+Backgroundve Area alanlarını dışarı verin ve elektronik tabloya kaydedin.</li>
	<li>Şekil 1B'dekidenklemi kullanarak elektronik tablodaki bağlama kesirlerini hesaplayın ve verileri çizin. Diğer kuyuların çoğuna kıyasla yüksek bağlayıcı fraksiyonlar gösteren kuyulardaki potansiyel bağlayıcı proteinleri tanımlayın.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig02.jpg"> Şekil 2: DRaCALA tarama sürecinin genel iş akışı. Bir Escherichia coli ASKA koleksiyonundan protein üretimi indüklenir ve hücreler lysed edilir. Bu arada, rekombinant proteinler Relseq-His ve GppA-His saflaştırılarak 32P-α-GTP'den 32P etiketli pppGpp ve ppGpp sentezlemek için kullanılır. Radyoaktif olarak etiketlenmiş (p)ppGpp molekülleri daha sonra lysates ile karıştırılır ve 96 pin aracı, daha sonra bir fosfor depolama ekranına, görüntülemeye ve radyoaktif sinyallerin niceliğine maruz kalmak için karışımları nitroselüloz bir zara tespit etmek için kullanılır. Kısaltmalar: DRaCALA = Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Hareketi; (p)ppGpp = guanosine penta ve tetrafosfatlar; RT = oda sıcaklığı; IPTG = izopropil β-d-1-tiyogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-trifosfat; SDS-PAGE = sodyum dodecylsulfate-poliakrilamid jel elektroforez; TLC = ince tabaka kromatografisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide%2C+c-di-GMP%2C+c-di-AMP%2C+cGMP%2C+cAMP%2C+%28p%29ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li>
<li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+small-molecule+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins%3A+from+protein+kinase+A+to+potassium%2Fsodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li>
<li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404(2015).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+%27%2C5+%27-cAMP+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li>
<li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li>
<li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232(2015).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GIL%2C+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li>
<li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+%28p%29ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mbio%22%5BJournal%5D)">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188(2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus%2C+with+functions+distinct+from+those+of+%28p%29+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388(2020).</li>
<li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+%28DRaCALA%29+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li>
<li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+%28A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive%29%3A+Unique+resources+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li>
<li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li>
<li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p%29ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir çıkar çatışması yoktur.

DRaCALA taramasının yapılmasında kritik adımlardan biri iyi tüm hücre lysates elde etmektir. İlk olarak, test edilen proteinler büyük miktarlarda ve çözünür formlarda üretilmelidir. İkincisi, hücrelerin lizisi eksiksiz olmalı ve lizat viskozitesi minimum olmalıdır. Lysozyme'ın dahil edilmesi ve üç donma-çözülme döngüsünün kullanılması genellikle hücreleri tamamen iyse etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, serbest bırakılan kromozomal DNA lizozu viskoz yapar ve yüksek arka plan bağlama sinyali oluşturur, bu da <strong ...

Bakteriler sürekli değişen ortamlara uyum sağlamak için birkaç küçük sinyal molekülü kullanır1,2. Örneğin, otoindüserler, N-acylhomoserine lactones ve modifiye oligopeptidleri, popülasyon davranışını koordine etmek için bakteriler arasındaki hücreler arası iletişime aracılık eder, çekirdek algılama olarak bilinen bir fenomen2. Bir diğer küçük sinyal molekülü grubu, yaygın olarak çalışılan döngüsel adenozin monofosfat (cAMP), döngüsel di-AMP, döngüsel di-guanosine monofosfat (döngüsel di-GMP) ve guanosine penta ve tetra fosfatları (p)ppGpp1dahil olmak üzere NSM'lerdir. Bakteriler bu NSM'leri çeşitli stres koşullarına yanıt olarak üretirler. Üretildikten sonra, bu moleküller hedef proteinlerine bağlanır ve karşılaşılan streslerle başa çıkmak ve bakteriyel sağkalımını artırmak için birkaç farklı fizyolojik ve metabolik yolu düzenler. Bu nedenle, hedef proteinlerin tanımlanması, bu küçük moleküllerin moleküler fonksiyonlarını çözmek için kaçınılmaz bir ön koşuldur.
Son on yıl, esas olarak bu küçük moleküllerin hedef proteinlerini ortaya çıkaran çeşitli teknik yenilikler nedeniyle, bu küçük sinyal molekülleri hakkında bir bilgi patlamasına tanık oldu. Bunlar arasında yakalama bileşik tekniği3,4,5ve ligand tahlil (DRaCALA)6'nın diferansiyel radyal kılcal etkisi bu makalede tartışılacaktır.
Vincent Lee ve iş arkadaşları tarafından 20116'daicat edilen DRaCALA, nitroselüloz membran yeteneğini farklı olarak sequester serbest ve proteine bağlı ligandlara dağıtır. Proteinler gibi moleküller nitroselüloz bir zar üzerinde yayılamazken, NSM'ler gibi küçük ligandlar yayılabilir. NSM'yi(örneğin,ppGpp) test edilecek proteinle karıştırarak ve membran üzerinde tespit ederek, iki senaryo beklenebilir (Şekil 1): Eğer (p)ppGpp proteine bağlanırsa, radyolabeled (p)ppGpp protein tarafından noktanın merkezinde tutulur ve dışarı doğru dağılmasın, yoğun bir küçük nokta (yani. güçlü radyoaktif sinyal) bir fosforimager altında. Bununla birlikte, (p)ppGpp proteine bağlanmazsa, tekdüze arka plan radyoaktif sinyali olan büyük bir nokta üretmek için serbestçe dışa doğru dağılacaktır.
Ayrıca, DRaCALA, protein yeterli miktarda mevcutsa, tüm hücre lisatında küçük bir molekül ile amaçlanmamış bir protein arasındaki etkileşimi tespit edebilir. Bu basitlik, bir ORFeome ifade kitaplığı kullanarak protein hedeflerini hızla tanımlamada DRaCALA'nın kullanılmasına izin verir. Nitekim, cAMP7, siklik di-AMP8, döngüsel di-GMP9,10ve (p)ppGpp 11,12,13hedef proteinleri DRaCALA kullanılarak sistematik olarak tanımlanmıştır. Bu video makalesi, başarılı bir DRaCALA taraması gerçekleştirmedeki kritik adımları ve dikkat edilmesi gerekenleri göstermek ve açıklamak için örnek olarak (p)ppGpp kullanır. Not olarak, DRaCALA14'ün daha kapsamlı bir açıklamasının, DRaCALA'yı gerçekleştirmeden önce bu makaleyle birlikte okunması şiddetle tavsiye edilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Şekil 1: DRaCALA prensibi. (A) DRaCALA tahlilinin şeması. Ayrıntılar için metne bakın. (B) Bağlama fraksiyonunun nicelleştirilmesi ve hesaplanması. Ayrıntılar için metne bakın. Kısaca, DRaCALA lekeleri, tüm noktayı ve iç koyu noktayı(yani,test edilen proteinin bağlanması nedeniyle tutulan (p)ppGpp) çevreleyen iki daire çizilerek analiz edilecektir. Spesifik bağlama sinyali, spesifik olmayan arka plan sinyalini çıkardıktan sonra iç dairenin (S1) radyoaktif sinyalidir (A1 × ((S2-S1)/(A 2 -A1))) tarafından hesaplanır). Bağlama fraksiyonu, toplam radyoaktif sinyale (S2) bölünen belirli bağlama sinyalidir. Kısaltmalar: DRaCALA = Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Hareketi; (p)ppGpp = guanosine penta ve tetrafosfatlar; RT = oda sıcaklığı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>32P-&alfa;-GTP</td><td>Perkinelmer</td><td>BLU006X250UC</td><td></td></tr><tr><td>96 x pin aracı</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 404</td><td>96 Cıvata Çoğaltıcı, 9 mm merkezlerde, 4,2 mm Cıvata Çapı, 24 mm uzunluğunda</td></tr><tr><td>96 oyuklu V-tabanlı mikrotitre plakası</td><td>Sterilin</td><td>MIC9004</td><td>Sterilin Mikroplaka V Kuyusu 611V96</td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>LP0011</td><td>Agar no. 1</td></tr><tr><td>ASKA toplama suşu</td><td>NBRP, SHIGEN, JAPONYA</td><td></td><td>Ref: DNA Research, Cilt 12, Sayı 5, 2005, sayfa 291&ndash;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td></tr><tr><td>Benzonaz</td><td>SIGMA</td><td>E1014-25KU,</td><td>Serratia marcescens</td></tr><tr><td>Bradford Protein Tahlili Boyası</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Reaktif Konsantresi</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>&ge'den genetik olarak tasarlanmış endonükleaz; %99,9</td></tr> <tr><td>DNase 1</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>jel filtrasyonu10x300 sütun</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>koruyucu olarak %20 etanol içerir</td></tr><tr><td>Analiz için Gliserol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1214</td><td>Gliserol %87</td></tr><tr><td>Hiperkaset</td><td>Amersham</td><td>RPN 11647</td><td>20 x 40 cm</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>SIGMA</td><td>56750</td><td>puriss. p.a., &ge; %99,5 (GC)</td></tr><tr><td>IP Depolama Fosfor Ekran</td><td>FUJIFILM</td><td>28956474</td><td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)</td><td>SIGMA</td><td>I6758</td><td>İzopropil ve beta;-D-tiyogalaktosid</td></tr><tr><td>Lizojen Suyu (LB)</td><td>İnvitrojen - Thermo Fisher</td><td>12795027</td><td>Miller'ın LB Et Suyu</td></tr><tr><td>Tabanı Lizozim</td><td>SIGMA</td><td>L4949</td><td>tavuk yumurtası beyazından; BioUltra, liyofilize toz, & %98</td></tr> <tr><td>MgCl<alt>2</alt> (Magnezyum klorür)</td><td>SIGMA</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ su</td><td></td><td></td><td>ultra saf su</td></tr><tr><td>çok kanallı pipet</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661110</td><td>F1 - Klips Ucu; 1-10 ul, 8 x kanal</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Kimyasalları</td><td>27810</td><td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz Kurutma Membranı</td><td>Amersham Protran</td><td>10600003</td><td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td></tr><tr><td>PBS</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>BR0014G</td><td>Fosfat tamponlu salin (Dulbecco A), Tabletler</td></tr><tr><td>PEG3350 (Polietilen glikol 3350)</td> <td>SIGMA</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td> <td>SIGMA</td><td>93482</td><td>Fenilmetansülfonil florür çözeltisi - etanol içinde 0,1 M (T)</td></tr><tr><td>Fosfor görüntüleyici</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td>Typhoon FLA-7000 Fosfor görüntüleyici</td></tr><tr><td>Pipet Uçları, filtreli</td><td>Thermo Scientific</td><td>94410040</td><td>ClipTip 12.5 & mu; l steril olmayan</td></tr><tr><td>Poly-Prep Kromatografi sütunu</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td>polipropilen kromatografi sütunu</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü Mini</td><td>Pierce</td><td>A32955</td><td>Tabletler, EDTA içermeyen</td></tr><tr><td>vidalı kapaklı tüp</td><td>Thermo Scientific</td><td>3488</td><td>Mikrosantifuge Tüpleri, 2.0 ml vidalı kapaklı, steril olmayan</td></tr><tr><td>SLS 96 derin Kuyu plakaları</td><td>Greiner</td><td>780285</td><td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Alt, Doğal</td></tr><tr><td>döndürme sütunu</td><td>Millipore</td><td>UFC500396</td><td>Amicon Ultra -0.5 ml Santrifüj Filtreler</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer C</td></tr><tr><td>TLC plakası (PEI-selüloz F TLC plakaları)</td><td>Merck Millipore 105579</td><td></td><td>DC PEI-selüloz F (20 x 20 cm)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>SIGMA</td><td>BP152</td><td>Moleküler Biyoloji için Tris Tabanı</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td>viskoz iyonik olmayan deterjan</td></tr> <tr><td>ve beta;-merkaptoetanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td>%99 (GC/titrasyon)</td></tr></tbody></table>

ligand tahlilinin diferansiyel radyal kılcal etkisi ile küçük ligandların bağlayıcı proteinlerinin tanımlanması (dracala)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Son on yılda bakteriyel fizyolojide küçük sinyal moleküllerinin anlaşılmasında muazzam bir ilerleme kaydedildi. Özellikle, nükleotid türevi ikincil habercilerin (NSM) hedef proteinleri sistematik olarak tanımlanmış ve model organizmalarda incelenmiştir. Bu başarılar esas olarak, bu küçük moleküllerin hedef proteinlerini sistematik olarak tanımlamak için kullanılan ligand tahlilinin (DRaCALA) yakalama bileşik tekniği ve diferansiyel radyal kılcal etkisi de dahil olmak üzere birkaç yeni tekniğin geliştirilmesinden kaynaklanmaktadır. Bu makalede, DRaCALA tekniğinin bir örneği ve video gösterimi olarak NSM'lerin, guanosine penta ve tetrafosfatların (p)ppGpp kullanımı açıklanmaktadır. DRaCALA kullanılarak, bu tahlilin gücünü gösteren Escherichia coli K-12 model organizmasında bilinen 20'den 9'u ve (p)ppGpp'nin 12 yeni hedef proteini tanımlanmıştır. Prensip olarak, DRaCALA radyoaktif izotoplar veya floresan boyalar ile etiketlenebilen küçük ligandların incelenmesi için kullanılabilir. Bu tekniğin daha fazla uygulanması için DRaCALA'nın kritik adımları, artıları ve eksileri burada tartışılmaktadır.

Yukarıda açıklanan protokolün ardından genellikle iki tür sonuç verecektir (Şekil 3).
Şekil 3A, kuyuların çoğundan nispeten düşük arka plan bağlama sinyallerine (bağlama fraksiyonları &lt; 0.025) sahip bir plaka göstermektedir. Kuyu H3'ten gelen pozitif bağlama sinyali, diğer kuyular için gözlemlenenden çok daha yüksek olan ~0.35'in bağlayıcı bir kısmını verir. Niceleme olmadan bile, iyi H3 dikkat çekicidir, bu da iyi H3 ile ifade edi...

Ligand Assay'ın Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi (DRaCALA), orfeome kütüphanesi kullanarak bir organizmanın küçük ligand bağlayıcı proteinlerini tanımlamak için kullanılabilir.

Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Küçük sinyal molekülleri bakteriyel virülansı ve insan biyolojisini kontrol etmek için çeşitli efektör proteinleri hedef alandır. Bununla birlikte, bu efektör proteinlerin tanımlanması zordur. Bir sistem biyoloji aracı olarak DRaCALA, bir OVium kütüphanesi kullanarak bilinmeyen efektör proteinlerinin uygulanabilir, hızlı ve son derece hassas bir şekilde tanımlanmasını sağlar.DRaCALA, radyoaktif izotop veya floresan boyalarla etiketlenebildiği sürece herhangi bir küçük sinyal moleküllerini incelemek için kullanılabilir. E.coli'yi, dakikada 30 santigrat derecede ve 160 dönüşte bir gecelik inkübasyon için 96 kuyu derin kuyu plakasının her kuyusunda mililitre kloramfenikol başına 25 mikrogram ile desteklenmiş 1,5 mililitre LB'ye aşılayarak başlayın. Ertesi sabah, protein ekspresyonını teşvik etmek için 30 santigrat derecede altı saat boyunca 500 mikromoler IPTG ile gece kültürlerini tedavi edin.Kuluçkanın sonunda, hücreleri santrifüjleme ile peletin, süpernatantı çıkarın ve örnekleri eksi 80 santigrat derecede dondurun. Lizi başlatmak için, hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika eritmeden önce, peletleri 150 mikrolitre liz tamponunda eksi 80 santigrat derecede 30 dakikalık bir inküb

identifying-binding-proteins-small-ligands-with-differential-radial

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, hareketlilik kaymalı afinite kapiler elektroforezi ile protein-ligand etkileşimini analiz etme yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir proteinin çeşitli yüklü ligandlarla bağlanma davranışını karakterize etmek için kullanılabilir.

Hareketlilik Kayması Afinite Kapiler Elektroforezi: Protein-Ligand Komplekslerinin Diferansiyel Migrasyonuna Bağlı Olarak Numune-Ligand Etkileşimlerini Analiz Etmek İçin Bir Yöntem

Bu video, hücre içi nükleotid ikinci haberci bağlayıcı proteinlerin sistematik yüksek verimli taraması için bir teknik olan ligand testinin diferansiyel radyal kılcal etkisini göstermektedir. Bu teknik, habercilerin hücre lizatındaki aşırı eksprese edilen hedef proteine doğrudan bağlanmasına izin verir - protein saflaştırma ihtiyacını atlar.

Ligand Testinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi: Bakteriyel Nükleotid İkinci Haberci Bağlayıcı Hücre İçi Proteinleri Tanımlamak İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Sunulan protokoller, ligand-reseptör etkileşimlerinin hızlı araştırılması için iki enzim bağlı immünosorban testi (ELISA) tabanlı tekniği tanımlar: İlk test, ligand ve reseptör arasındaki ayrışma sabiti tayinini sağlar. İkinci test, ligand-reseptör etkileşimleri için blokaj peptidlerinin hızlı bir şekilde taranmasını sağlar.

Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

İletişim kuralı küçük molekül lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) ile arıtılmış hEAG1 iyon kanal protein etkileşimleri açıklar. Ölçüm BLI roman küçük molekül iyon kanal ligand tarama için potansiyel bir yöntem olabilir gösterir.

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

Titrasyon ELISA gerçekleştirmek için detaylı bir protokol açıklanmıştır. Ayrıca, yeni bir algoritma titrasyon ELISAs değerlendirmek için ve plaka immobilize microtiter reseptör için çözünür bir ligand bağlayıcı bir ayrışma sabiti edinmek için sunulmaktadır.

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

Burada, üretim ve arıtma etiketlenir proteinlerin için bir protokol kararlı izotop ve protein-protein etkileşimleri nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve MicroScale kullanarak sonraki karakterizasyonu ile mevcut Thermophoresis (MST) deneyler.

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Autoradiography yöntemi radioligands doku bölümlerine bağlama nitel veya nicel Farmakoloji belirlenmesi için incelemek için düzenli olarak kullanılır.

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

Öğrenin DRaCALA yöntemiyle Escherichia coli'de (p)ppGpp gibi nükleotid türevli ikincil habercilerin bağlayıcı proteinlerini nasıl tanımlayacağınızı. Bu hızlı ve duyarlı sistem biyolojisi tekniği, bakteri fizyolojisi ve protein-ligand etkileşimleri alanında yeni etki proteinlerinin keşfine olanak tanır.

Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA)

Daha fazla video keşfet