Name: Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Öğrenin, Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositlerden kriyolamel hazırlama yöntemini. Kriyoelektron tomografisi ile parazit yapısını yüksek çözünürlükte inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma tamamen veya kısmen Wellcome Trust (212916 / Z / 18 / Z) tarafından finanse edilmiştir. Açık erişim amacıyla, yazar bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale versiyonuna CC BY kamu telif hakkı lisansı uygulamıştır.
Bu yöntemin geliştirildiği bu proje, Helen R. Saibil, Roland A. Fleck ve Michael J. Blackman'a verilen MR / P010288/1 Tıbbi Araştırma Konseyi hibesi ile finanse edildi. P. falciparum kültürleri, Michael J. Blackman'ın grubunun üyelerinin desteğiyle Francis Crick Enstitüsü'nde yetiştirildi. Yazarlar, ince kan yaymalarında bileşik 2 ve E64 ile tedavi edilen şizontların görüntülerini sağladığı için Dr. Ser Ying (Michele) Tan'a teşekkür eder. Lamellerin çoğu eBIC personelinin desteğiyle üretildi ve araştırma önerisi NT21004 Scios çift ışınlı kriyoFIB-SEM'e erişim için minnettarız. Yazarlar ayrıca, Royal Society Industry Fellowship planının (INF \ R2 \ 202061) CUI içindeki FIB frezeleme tekniğinin geliştirilmesine devam etmedeki desteğini de kabul etmektedir. Yazarlar ayrıca Helen R. Saibil'e bu yöntem makalesi ile ilgili yararlı tartışmalar ve projenin denetlenmesi için teşekkür eder.

İnsan kanı, İngiltere Ulusal Kan ve Nakil servisi aracılığıyla anonimleştirilmiş bağışçılardan elde edildi ve alındıktan sonraki 2 hafta içinde kullanıldı. Kullanımı için etik onay gerekmez.
1. Plasmodium falciparum ile enfekte kırmızı kan hücrelerinin hazırlanması ve daldırılması
<ol><li>Olgun şizontları% 70 (v / v) izotonik yoğunluk gradyan ortamı üzerinde santrifüjleme (1.580 x g) ile izole edin (insan eritrositlerinde 3D7 Plasmodium falciparum'un aseksüel kan aşamalarının nasıl kültürleneceğine ilişkin standart prosedürler için bakınız Blackman M.J., 199537).</li>
	<li>6.7 mM fosfat tamponunda, pH 7.1'de% 10 Giemsa boyası ile boyamadan önce şizontların morfolojik homojenliğini kontrol etmek için hava ile kurutulmuş ince kan filmlerini %100 metanol içeren bir cam slayt üzerine sabitleyin. NOT: Belirli çıkış noktalarında duran şizontların preparatını zenginleştirmek için, şizontlar bileşik 2 ve E64 inhibitörleri ile daha da senkronize edilebilir (bu inhibitörlerin etkisinin bir açıklaması için Temsili Sonuçlar ve Şekil 1'e bakınız). DİKKAT: Plasmodium falciparum bir insan patojenidir ve sadece yerel sağlık ve güvenlik kurallarına uygun olarak uygun bir muhafaza tesisinde ele alınmalıdır.</li>
	<li>Şizontları (240 x g) pelet haline getirmek için nazikçe santrifüj edin ve RPMI ortamının hücre peletinin 2x hacminde yeniden askıya alın, bu da %50'lik bir hematokrit süspansiyonu ile sonuçlanır.</li>
	<li>Manuel bir daldırma dondurma makinesinde, kızdırma deşarjlı bir yüzeyin karbon tarafına 2,5 μL schizonts uygulayın (60 s, havada 30 mA'lık kızdırma-deşarj ünitesi ayarlarını kullanın, yalnızca ızgaranın karbon tarafını işleyin) 2/4 delikli karbon filmli 200 örgü bakır ızgara ve yırtık kenarlı grade 1 filtre kağıdı kullanarak ızgaranın arkasından ~ 20 s boyunca lekeleyin. Sıvı azot soğutmalı sıvı etan'a daldırın ve ızgaraları depolamaya aktarın (bu çalışmada kullanılan ekipman için Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Deney burada duraklatılabilir ve ızgaralar süresiz olarak sıvı azot altında saklanabilir. DİKKAT: Sıvı azot boğucudur ve donmaya neden olur; Oksijen izleme ile uygun bir ortamda dikkatli kullanın. DİKKAT: Sıvı etan ciddi yanıklara neden olur ve yanıcıdır; ateşleme kaynaklarından uzakta bir duman davlumbazında kullanın. NOT: Dalma dondurulmuş schizonts artık geçerli değildir. Bu, insan kanının birkaç altın ızgara ile hava çözülmüş dalma donmuş şizontlarla inkübe edilmesi ve donmamış kontrollere kıyasla birkaç gün sonra parazit büyümesinin gözlenmemesiyle belirlendi. Bu nedenle, dondurulmuş şizontların ızgaraları, normal güvenlik ve dekontaminasyon prosedürleri (eldivenler, %>70 etanol ile yüzey/alet sterilizasyonu ve ızgaraların %>70 etanol) kullanılarak muhafaza tesislerinin dışında elleçlenmesi güvenlidir.</li>
	<li>Bir ışık mikroskobu için bir kriyo-aşama kullanarak ızgaraları eleyin, ızgara boyunca buz gradyanına özellikle dikkat edin. Buzun daha ince bölgelerinde, hücre kapsamı için ayrı ayrı ızgara karelerini kontrol edin. NOT: En iyi kareler, ızgara karesinin merkezinde bir hücre kalınlığında olmalıdır (Şekil 2). Bu, bir lamelin karenin merkezi boyunca, kenarlardaki daha kalın buza ızgara çubuklarına çarpmadan öğütülebilmesini sağlar. Deney burada duraklatılabilir ve ızgaralar süresiz olarak sıvı azot altında saklanabilir. Hücreler bir floresan işaretleyici taşıyorsa, ızgaralar, doğrudan frezeleme için kriyoFIB-SEM'deki ızgara konumlarıyla ilişkilendirilebilen X / Y konumlarını bulmak için kriyoCLEM tarafından da taranabilir.</li>
</ol>2. Daldırma dondurulmuş hücrelerin ızgara üzerinde FIB frezelenmesi
<ol><li>Kesme bölümünün merkezini ve jantın karşı tarafını belirtmek için cryoFIB'ye özgü otomatik ızgara jantlarının önünü siyah silinmez bir işaretleyici kalemle işaretleyin (Şekil 3). Kırpma istasyonunu kurun ve ızgaraları karbon tarafı aşağı doğru işaretlenmiş halkalara klipsleyin.</li>
	<li>Izgaraları kriyoFIB-SEM mekiğine (mekiğe bağlı olarak tipik olarak 2 ızgara) karbon tarafına yükleyin ve argon atmosferinde (5 x 10-2 mbar) (60 s için 5 mA - kalınlık değişkendir) veya hücrelerin yüzeyine bir karbon / platin e-ışın döner kaplama (~ 4 nm kalınlığında) bir platin püskürtme kaplaması uygulayın. NOT: Her iki kaplama türü de SEM görüntüleme sırasında yük dağılımına yardımcı olur. E-beam döner kaplayıcının yararı, kaplamanın tam kalınlığının belirlenebilmesidir.</li>
	<li>Mekiği kriyoFIB-SEM'e yükleyin ve her ızgaradaki hücre dağılımını SEM ile 5 kV'da (13 pA veya 25 pA) değerlendirin. Izgaradaki buz gradyanlarına bakmak için düşük büyütmeli bir genel bakış (~ 100x) alın. Ardından, tek tek ızgara karelerine bakmak ve ızgaranın görünür hücresel özelliklere ve öğütülecek düşük yüzey kirliliğine sahip alanlarını tanımlamak için daha yüksek büyütmeli (~ 5.000x) görüntüler alın.</li>
	<li>Gaz enjeksiyon sistemini (GIS) kullanarak her ızgaranın yüzeyine >2 μm organoplatin kaplama uygulayın. Bunu yapmak için, CBS iğnesini ızgaranın üzerindeki odaya yerleştirin ve bir buhar akışı üretmek için organoplatin kaynağını belirli bir süre için (örneğin, 3-10 s için ~ 27 ° C) ayarlanmış bir sıcaklığa ısıtın. NOT: CBS iğnesi aracılığıyla organoplatin kaplamanın uygulama açısı, sıcaklığı ve zamanlaması, eşit bir kaplamayı en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmelidir. Bu, kullanılan spesifik kriyoFIB-SEM'e bağlı olacaktır (daha fazla açıklama için Temsili Sonuçlara bakınız).</li>
	<li>Numuneyi, ızgaranın düzlemi iyon ışınının insidans açısından ~ 10 ° olacak şekilde eğin ve hem SEM hem de FIB görüntülerinde görülecek uygun bir ızgara karesinin merkezini hareket ettirin.</li>
	<li>İyon ışınını düşük akımda (nominal olarak 1,5 pA, 30 kV) kullanarak ızgarayı inceleyin ve bir ızgara karesinin merkezindeki hücreleri görselleştirmek için yeterince yüksek büyütmeye (~ 7.000x) gidin. Numuneyi ilk frezeleme akımında (300 pA) odak noktasına getirin ve astigmatizma için düzeltin. Parlaklığı ve kontrastı ayarlayın, ardından biri 3 μm kalınlığında korunan bir bölgenin üstünde ve diğeri altında olmak üzere frezelemek için iki dikdörtgen deseni işaretleyin, bunun merkezi son lamelin istenen yeridir. NOT: Desenlerin seçilen genişliği, çevreleyen hücre katmanının topografyasına ve hücre boyutuna bağlı olacaktır. 7-20 μm, şizontlar için uygun bir genişliktir, ancak daha geniş lamellerin öğütülmesi daha uzun sürer. İlk frezeleme adımı için desenlerin seçilen yüksekliği, yaklaşık 6 μm'den başlayarak numune kalınlığına bağlıdır; Bunun frezeleme sırasında ayarlanması gerekebilir. Frezeleme, desenlerin dış, üst ve alt kenarlarından lamel yüzüne doğru yönlü olarak gerçekleştirilir. Bu, her iki desenin aynı anda veya sırayla öğütüldüğü paralel olarak yapılabilir, önce lamellerin üstünden ve daha sonra altından malzeme çıkarılır.</li>
	<li>Frezelemeye ilk akımda başlayın; canlı ilerlemeyi iyon ışını görünümünde ve aralıklı olarak SEM (5 kV, 13 veya 25 pA) ile izleyin. İyon ışınının, korunan bölgenin üstündeki ve altındaki numuneyi kırıp kırmadığını kontrol edin. Değilse, daha fazla malzeme çıkarmak için dikdörtgen desenlerin yüksekliğini artırın. Lamelin üstündeki ve altındaki yüzey iyon ışını görünümünde tamamen pürüzsüz olduğunda durun. NOT: İyon ışını, dikdörtgen desenlerin içi odak düzleminde hiçbir özellik içermediğinde, korunan bölgenin üstündeki ve altındaki numuneyi kırmıştır. Izgara çubukları gibi bazı özellikler arka planda odak dışında görünebilir.</li>
	<li>Bir sonraki frezeleme akımına geçin (100 pA); Odaklanın ve parlaklığı / kontrastı ayarlayın. İki dikdörtgen desen arasındaki boşluğu 1,5 μm'ye düşürün ve desen yüksekliğini yalnızca öğütülmemiş malzemeyi kaplayacak şekilde azaltın. Lamelin üstündeki ve altındaki yüzey tamamen pürüzsüz olana kadar yeni akımda frezelemeye başlayın.</li>
	<li>0,3 μm kalınlığa ulaşana kadar bu işlemi adım adım tekrarlayın ve iyon ışını akımını Tablo 1'deki frezeleme şemasına göre her seferinde azaltın.</li>
	<li>Bir veya her iki ızgarada birkaç lamel (miktar, numunenin kalınlığına ve mevcut zamana bağlıdır) 0,3 μm kalınlığa kadar öğütün, her bir lamellerin X / Y / Z konumunu kaydedin ve lamelleri son kalınlıklarına (60-200 nm) parlatmak için oturumun sonunda ~ 1-2 saat ayırın.</li>
	<li>Tüm ızgaranın düşük büyütmeli bir SEM genel bakışını alın ve ızgaranın önündeki lamellerden, ızgaranın arkasındaki lamellere, ızgaranın arkasındaki lamellere, (iyon ışını kaynağından en uzakta) başlayan bir parlatma rotası planlayın (Şekil 5). NOT: Bu, ablatlanmış malzemenin cilalı lamellerin yüzeyine geri depolanmasını azaltır.</li>
	<li>İki dikdörtgen desen arasındaki boşluğu 100-200 nm'ye düşürün ve son parlatma adımına 30 pA'lık bir iyon ışını akımında başlayın. SEM ile ilerlemeyi 2-3 kV'da izleyin (13 pA, bekleme = 300 n, 3072 x 2048, tam kare için ~ 2 s) ve kontrast SEM tarafından lamelde kaybolduğunda veya lamelin organoplatin kaplaması bütünlüğünü kaybetmeye başladığında parlatmayı bırakın.</li>
	<li>Izgaraları çıkarmadan önce, tüm ızgaranın düşük büyütmeli bir SEM görüntüsünü elde edin ve her lamelin görüntülerini kaydedin. Bunları daha sonra TEM'de ızgarayı çapraz kontrol etmek için kullanın. Deneyi burada duraklatın ve ızgaraları sıvı azot altında lamelli saklayın - dikkatli kullanın. NOT: Izgaralar, kriyoFIB-SEM'den çıkarıldıktan sonra hafifçe püskürtülebilir, bu da TEM'deki sürüklenmeyi ve şarjı yüksek büyütmede sınırlamaya yardımcı olabilir, ancak çok fazla püskürtme kaplaması lamellerin içindeki biyolojik içeriği gizleyebileceğinden bu dikkatli yapılmalıdır. Bu aşamada lamelleri floresan açısından taramak mümkündür; Bununla birlikte, yeterli sinyal elde etmek, etiketli proteinin lamel kalınlığı içindeki bolluğuna bağlı olacaktır. Lamellere verilen hasarı sınırlamak ve yüzey kontaminasyonunu önlemek için ızgaraların işlenmesine büyük özen gösterilmelidir.</li>
</ol>3. Tilt serisi edinimi ve veri işlemeye genel bakış
<ol><li>Frezeleme yönünü sahnenin eğim eksenine dik olarak hizalayarak ızgaraları TEM'e yükleyin. NOT: Izgaraların hizalanması, otomatik ızgara jantındaki işaretler kullanılarak gözle yapılır. ~ 10 ° 'lik bir hata payı kabul edilebilir, aksi takdirde lamellerin her iki tarafındaki açmanın duvarları, ızgara eğilirken lamelleri gizleyebilir.</li>
	<li>Tüm ızgaranın düşük büyütmeli bir haritasını (~ 150x) edinin ve lamelleri bulun; Ardından, her lamelin orta büyütme haritasını (lamel boyutuna bağlı olarak ~ 1.500x) edinin ve ilgi alanlarını bulun.</li>
	<li>Lamel düzlemini (ızgarayı değil) optik eksene dik hale getirmek için ızgarayı ±10 ° önceden eğin NOT: Ön eğimin yönü, düşük ve orta büyütme haritalarında lamellerin ön kenarının konumuna göre belirlenebilir (organoplatin kaplamanın üzerinde sol kısım aranır). Burada kullanılan TEM için, ızgaralar lamellerin ön kenarları haritalarda yukarı bakıyorsa +10° ön eğim gerektirir ve aşağı bakarlarsa -10° ön eğim gerektirir. Her ızgara, nasıl alındıkları ve otomatik yükleyiciye nasıl takıldıkları nedeniyle farklı olabilir.</li>
	<li>İlgilenilen bölge için gereken görüş alanına ve çözünürlüğe izin veren bir piksel boyutunda doz-simetrik eğim serisi38'i (örneğin, 3-5°'lik bir artışla -54° ila +54°) edinin. -2 ile -5 μm arasında bir dizi bulanıklaştırma değeri kullanın. Her artışta 3-10 karelik filmler toplayın ve bunun için piksel boyutuna bağlı olarak bu parametreleri ~ 150 e-/Å2 (300 kV TEM için) toplam doz biriktirecek şekilde ayarlayın. NOT: Bu bölgeler sürüklenebileceğinden lameldeki çatlaklardan kaçınılmalıdır. Yüzey kontaminasyonundan da kaçınılmalıdır, çünkü yüksek eğimde ilgi alanını veya odak alanını gizleyebilir.</li>
	<li>Motion, MotionCor239 gibi bir program kullanarak filmleri düzeltir. Düzeltilmiş görüntülere (birikmiş e-/image)40 bir doz ağırlıklandırma filtresi uygulayın ve CTFFIND441 gibi bir program kullanarak her görüntünün bulanıklaşmasını tahmin edin.</li>
	<li>Eğim serilerindeki görüntülerin hizalamasını ve açısal ilişkisini hesaplamak için etomo (IMOD)42 gibi bir programda güvensiz hizalama (yama izleme) kullanın.</li>
	<li>Hizalama ve döndürme bilgilerini, defokus değerleriyle birlikte üç boyutlu CTF düzeltmesi uygulayabilen bir programa, örneğin NovaCTF43'e girin. Aşağı akış analiziyle ilgili binning faktörlerine sahip çıktı tomogramları elde etmek için düzeltilmiş bir tomogram hesaplayın.</li>
	<li>Rekonstrüksiyonları analiz edin ve filtreleme, segmentasyon veya alt tomogram ortalaması gibi herhangi bir aşağı akış işlemine hazırlanın.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

KriyoFIB frezeleme daha rutin hale gelirken, frezeleme için en uygun numunelerin hazırlanması; bu nedenle, bu protokoldeki kritik adımların çoğu, numune cryoFIB-SEM'e ulaşmadan önce gerçekleşir. Frezeleme denenmeden önce mümkün olan en iyi numuneyi üretmek için çoklu hücre hazırlama, daldırma dondurma ve ışık ve elektron mikroskobu ile tarama ile numune optimizasyonu gereklidir. Mümkün olan en iyi numuneye sahip olmak sadece başarı şansını arttırmakla kalmaz, aynı zamanda ekipmanın kullanımını da optimize eder. Bu nedenle, çoğu ulusal tesis, makinelerinde zaman vermeden önce yeterli optimizasyonun yapıldığına dair kanıt gerektirir. KriyoFIB-SEM'in içine girdikten sonra, organoplatin katın etkinliğini en üst düzeye çıkarmak, düzgün ince lameller üretmek için kritik öneme sahiptir. Son olarak, sabır ve iyi numune kullanımı, hassas lameller içeren ızgaraları üretmek ve daha sonra aktarmak için birkaç gün boyunca oturması gereken kullanıcının ön koşul becerisidir. Bu, otomatik frezeleme stratejilerinin47,48 tanıtılmasıyla değişebilir, ancak henüz, tüm frezeleme işlemi çoğu tesiste hala büyük ölçüde manueldir.
Çalışma sadece P. falciparum schizonts'a odaklanırken, burada sunulan yöntem, diğer hücre tipleri için ızgara hazırlığını ve frezelemeyi optimize etmek için kolayca değiştirilebilir. Dikkate alınması gereken önemli faktörler, ızgaraya uygulanan hücrelerin yoğunluğu, ızgara tipi (bakır bazı hücreler için toksiktir), karbon filmdeki deliklerin boyutu ve aralığı, lekelenme süresi ve lekelenme yöntemidir (tek / çift taraflı, manuel veya otomatik). Ek olarak, hücreler ızgaralarda yetiştiriliyorsa (genellikle delikli karbon filmli altın ızgaralar), lekelenmeden ve donmadan önce akıcılık ışık mikroskobu ile kontrol edilebilir. Frezeleme stratejisi, hücrelerin ızgarada nasıl biriktirildiğine bağlıdır. Sıtma bulaşmış kırmızı kan hücreleri için, ızgara esas olarak kırılmamış bir hücre tabakası ile kaplanır, bazı bölgelerde daha kalın ve diğer bölgelerde daha incedir. Frezeleme, buz kalınlığının tomografi için uygun boyutta lameller ürettiği bu gradyan boyunca bir bölgede birden fazla noktada gerçekleştirilir. Bu yaklaşım, birden fazla hücreden bir dilim içeren lameller üretebildiğiniz için daha küçük hücreler için iyi çalışır. Daha büyük hücreler veya hücre kümeleri için, bir hücrenin veya hücre kümesinin bir lamel üretebilmesi söz konusu olabilir.
Şebeke işleme ve numune aktarımı, bu iş akışının ana zorluklarından biri olmaya devam etmektedir. Lameller, kırılmalar veya çatlaklar, biyolojiyi gizleyen perdeleme artefaktları, aşırı yüzey kirliliği ve TEM içindeki ızgara oryantasyon problemleri nedeniyle kaybolabilir ve ızgarayı yeniden konumlandırmak için ekstra bir taşıma adımı gerektirir. Kayıpların derecesi günden güne ve şebekeden şebekeye değişir, ancak zaman içinde uygulama ve kullanım deneyimi ile geliştirilir. Bu çalışmada, ızgaraların lamelleri tahrip etmeden otomatik yükleyicide birçok kez dikkatli bir şekilde yeniden yönlendirilebileceği ve bunun bazen yüzey buzunu yıkama yararına sahip olduğu bulunmuştur. Bu iş akışının bir diğer ana sınırlaması, lamel üretmek için gereken süredir. Üretim yavaş olduğundan, frezelemeyi mümkün olduğunca verimli hale getiren uygun şekilde optimize edilmiş bir numuneye sahip olmak çok önemlidir.
Vitröz biyolojik numunelerin FIB frezelenmesine bir dizi adaptasyon yakın zamanda tanıtılmıştır. Bir oyun değiştirici, kriyoFIB-SEM haznesi içinde, yüksek basınçlı dondurulmuş numunelerden daha büyük malzeme bloklarının öğütülmesini sağlayan kriyojenik olarak soğutulmuş kaldırma takımlarının uygulanmasıdır. Bloklar metal bir çubuğa tutturulabilir veya bir tutucuda toplanabilir ve özel olarak modifiye edilmiş bir EM ızgarası içeren ikinci bir numune konumuna taşınabilir. Bloklar daha sonra organoplatin ile kaplanabilir ve lamel üretmek için öğütülebilir. Lamelleri yüksek basınçlı dondurulmuş malzemeden öğütme yeteneği, özellikle bağıntılı floresan mikroskobu12 ile alanları hedefleyen çok daha büyük hücrelerin ve dokuların işlenebileceği anlamına gelir. FIB-frezeleme yöntemine yapılan diğer yeni uyarlamalar arasında, numune16'nın önceden frezelenmesiyle perdeleme artefaktlarının azaltılması, mikroakışkan kriyo-fiksasyon49 ve hücre dağılımını iyileştirmek için elektron mikroskopi ızgaralarının foto-mikrodesenlenmesi50 bulunmaktadır. Ayrıca, bir lamelin her iki tarafındaki mikro genleşme boşluklarının frezelenmesinin, son inceliğine51 ulaştığında çevredeki numune tarafından sıkıştırmayı hafifletebileceği gösterilmiştir. Bu, özellikle son parlatma adımında lamellerin bükülmesinin bazen görüldüğü bu çalışmadaki örnek gibi sürekli hücre katmanlarını frezelerken yararlı olabilir.
Elektron mikroskobunun geleceği muhtemelen sub-tomogram ortalaması ile in situ moleküler yapıların belirlenmesi olacaktır ve FIB frezeleme, bu tür iş akışları için vitreus biyolojik numunelerinin üretimini kolaylaştıracak önemli bir araçtır. FIB-frezeleme biyolojik uygulamalar için henüz emekleme aşamasındayken, hem akademik hem de ulusal tesislerdeki araştırmacıların sıkı çalışmaları ve araştırmayı desteklemek için kriyoFIB-SEM teknolojisinin geliştirilmesine yönelik ticari yatırımlar sayesinde yöntem geliştirme hızlı bir şekilde gerçekleşmektedir.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Sadece biyolojik örneklerin hücresel içeriği <500 nm kalınlığında, kriyojenik sıcaklıklarda iletim elektron mikroskobu (TEM) ile etkili bir şekilde görüntülenebilir, bu da örneklerin aralığını virüslere, prokaryotlara, basit tek hücreli organizmalara ve daha büyük ökaryotik hücrelerin daha ince bölgelerine sınırlar1. Şebeke odaklı iyon demeti (FIB) frezeleme, kriyojenik sıcaklıklarda (< -150 ° C) elektron şeffaf lamellerde daha kalın daldırma dondurulmuş biyolojik numunelerin inceltilmesini sağlar. Elde edilen lameller daha sonra görselleştirme ve tomografik veri toplama için bir TEM'e aktarılır ve hücrelerin içindeki hücresel ve moleküler özelliklerin yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlarını mümkün kılar (incelemeler için bakınız Rigort ve ark., 20122, Oikonomou ve ark., 20163 ve Wagner ve ark., 20204).
FIB-frezeleme, numunelerin aşağı akış analizine hazırlanmak için rutin olarak inceltildiği malzeme bilimleri alanından ortaya çıkmıştır5. İki optik sütuna sahip bir taramalı elektron mikroskobunda (SEM) gerçekleştirilir: geleneksel taramalı elektron mikroskobu optikleri ve FIB-SEM adı verilen odaklanmış bir iyon ışını (FIB) üretebilen ve hassas bir şekilde kontrol edebilen optikler içeren ikinci bir sütun. Bu, numunenin belirli bir bölgesinin bir galyum kaynağı tarafından üretilen iyonlar tarafından ablatlanmasına, fazla malzemenin uzaklaştırılmasına ve bir lamel6'nın arkasında bırakılmasına izin verir. Frezeleme işlemi, ilgilenilen bölgeleri bulmak ve frezeleme ilerlemesini izlemek için kullanılan numunenin topografyasının SEM görüntülemesi ile yönlendirilir. Biyolojik uygulamalar için, temel kurulum büyük ölçüde aynıdır, ancak frezeleme kriyojenik sıcaklıklarda gerçekleştirilir. Bu, standart FIB-SEM'lerin sabit sıcaklıkları ve düşük yüzey kontaminasyon oranlarını koruyan kriyo-soğutmalı aşamalara ve ayrıca sapma veya kontaminasyon olmadan numune transferini kolaylaştırmak için hava kilitlerine sahip olacak şekilde uyarlanmasını gerektirmiştir. Numune mekikleri ayrıca, TEM ızgaraları, planşetler ve kılcal damarlar dahil olmak üzere kriyoFIB-SEM'in içine bir dizi farklı taşıyıcının monte edilmesine izin verecek şekilde modifiye edilmiştir. Birkaç kilit araştırmacı grubu, bu yöntemlerin geliştirilmesinde ve bu alanda devam eden teknolojik gelişmelerde merkezi olmuştur 7,8,9,10,11,12. Kriyojenik sıcaklıkta biyolojik FIB frezeleme için ticari çözümler artık daha yaygın olarak mevcuttur ve optimize edilmiş bir numune göz önüne alındığında, lamellerin ızgara üzerinde frezelenmesi daha rutin hale gelmektedir.
Bir dizi oda sıcaklığı ve kriyoEM tekniği, mütevazı çözünürlükte tüm çok hücreli organizmalardan hücresel düzeyde karmaşık süreçlerin bağlamını anlamaya ve daha da ayrıntılı olarak yaşamın tüm ölçeklerinde hücresel bilgiyi görselleştirmek için kullanılabilir. in situ moleküler yapılar13,14,15,16,17,18,19. Klasik oda sıcaklığı teknikleri, TEM tarafından hücresel morfolojinin analizi için ultramikrotomi ile sabit ve lekeli, reçine gömülü hücrelerin ve dokuların kesitlendirilmesini içerir (gözden geçirme için bakınız Studer ve ark., 200820). Korunmuş hücrelerin bloklarının yüzeyini görüntülemek için SEM tarafından ikincil elektron saçılmasından yararlanılan alternatif teknikler, malzemeyi bir bıçakla (seri blok yüz görüntüleme) veya odaklanmış bir iyon ışınıyla aşamalı olarak çıkarmadan önce geliştirilmiştir21,22,23. Bu teknik aynı zamanda kriyojenik sıcaklıklarda (kriyo-hacim görüntüleme olarak adlandırılır) vitreus, lekesiz hücre veya doku blokları üzerinde bir kriyoFIB-SEM ile başarıyla uygulanmıştır24. Alternatif olarak, daha kalın lameller (~ 15 μm kalınlığında) öğütülebilir ve STEM görüntüleme ile incelenebilir25. Bu teknikler kullanılarak, popülasyon bilgisi toplamak için birçok hücre içeren bütün bloklar görüntülenebilir veya bütün bir organ / organizma 3D olarak görüntülenebilir ve yeniden yapılandırılabilir. Bununla birlikte, hücrelerden yüksek çözünürlüklü moleküler bilgiye erişmek için, numunelerin neredeyse yerli, dondurulmuş hidratlanmış bir durumda korunması ve bu nedenle kriyojenik koşullar altında hazırlanması gerekir. Vitröz kesitlerin kriyo-elektron mikroskopisi (CEMOVIS), yüksek basınçlı dondurulmuş biyolojik materyal bloklarının kriyojenik koşullar altında bir ultramikrotom ile kesitlendiği bir tekniktir. Bu, kriyo-kesitli şeritler üretir (40-100 nm kalınlığında)26, bir EM ızgarasına bağlanır ve TEM'de görüntülenir. Bununla birlikte, bıçağın vitreus numunesi ile fiziksel etkileşimi, hücresel yapıyı ciddi şekilde bozabilen çatlama ve sıkıştırma artefaktlarına neden olur27,28,29,30. Daha kalın bölümler bu eserlere daha yatkındır, bu da ~ 70 nm'den daha kalın bölümlerin kullanılmasını pratik hale getirmez26. Bu sınırlama, tomogramdaki biyolojik yapının 3B görünümünü büyük ölçüde kısıtlar. Kriyojenik sıcaklıklarda FIB-frezeleme bu sorunları yaşamaz, ancak numunenin parçaları arasında diferansiyel frezeleme oranlarının neden olduğu kendi eserlerine sahiptir ve bu da bir lamel içinde perdeleme adı verilen değişken kalınlıklara yol açar. Bu sorun, frezeleme sırasında lamelin ön kenarını koruyan bir gaz enjeksiyon sistemi (GIS) ile uygulanan bir organoplatin kaplamanın uygulanmasıyla hafifletilir31. Izgara üstü FIB frezeleme için numune kalınlığının üst sınırı, numuneyi vitröz tutarken dondurma kabiliyeti ile tanımlanır32Bununla birlikte, kriyo kaldırma tekniklerinin ve biyolojik numuneler için uyarlanmış numune taşıyıcılarının tanıtılmasıyla birlikte, FIB-frezeleme yüksek basınçlı dondurulmuş numuneleri işlemek için de kullanılabilir31,33,34,35. Ek olarak, daldırma dondurulmuş numuneler çok ince olamaz, çünkü gerekli büyütmede eğim serilerini toplamak için yeterli yüzey alanı sağlayacak makul büyüklükte bir lamel üretmek için yeterli biyolojik malzeme olması gerekir. Bu sorun, bakteri veya maya gibi daha küçük hücrelerin kümelerinin öğütülmesiyle hafifletilebilir. Son lamel kalınlığı (~ 100-300 nm) genellikle numune bütünlüğü ve frezeleme stratejisi tarafından belirlenir. Daha ince lameller, sub-tomogram ortalaması gibi yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar için daha iyidir, ancak daha kalın lameller, CEMOVIS tarafından elde edilebilenden çok daha büyük hücresel hacimler içerir ve doğal olarak korunmuş bir numunede daha fazla hücresel bağlam sağlar. FIB-frezeleme, elektron kırınım çalışmaları için daldırma-dondurulmuş protein kristallerini inceltmek için de kullanılabilir36.
Vitröz hücrelerin FIB frezelenmesi, bilimsel sorunun in situ olarak yakın doğal örneklerin yüksek çözünürlüklü moleküler detayını gerektirmesi durumunda gerçekleştirilmesi gereken zamana ve çabaya değer. Lamellerin rutin üretimi için daha fazla tesise erişim ile, hız sınırlama adımı genellikle numunenin camsı olduğundan ve sağlam ve homojen ince lameller üretmek için uygun bir kalınlıkta olduğundan emin olmak için zaman alınması gereken frezelemeden önce numunenin optimizasyonudur. Burada tarif edilen, sıtmanın etken maddesi olan Plasmodium falciparum parazitleri ile enfekte olmuş FIB-öğütme dalma-dondurulmuş insan kırmızı kan hücreleri için numune optimizasyonudur, ancak bu yaklaşım herhangi bir örnek için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>c-klipsler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Kırpma istasyonu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Thermo Kırpma istasyonundan doğrudan alıntı</td></tr><tr><td></td><td>Sub-angstrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Bileşik 2</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Dr Simon A. Osborne tarafından sentezlenmiştir, LifeArc</td></tr><tr><td>Cryo-FIB'ye özel otomatik ızgara jantları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>1205101</tr><tr><td>E64</td><td>Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Emitech K100X kızdırma deşarj ünitesi</td><td>Çekirdek</td><td>yok</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 ortam</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>12633012</td><td>Kültür için kullanılan formülasyon özel olarak üretilmiştir (REF 041-91762 A) ve Albümaks, glutamin, HEPES ve hipoksantin takviyeleri içerir</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>VWR International</td><td>350864X</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11562203</td><td></td></tr><tr><td>Izgara kutuları</td><td>Sub-angstrom</td><td>PB</td><td>Kırpılmış ızgaralar için</td></tr><tr><td>Izgara kutuları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Kırpılmış ızgaralar için - Thermo Fisher Scientific Grid kutularından doğrudan alıntı</td></tr><tr><td></td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3727</td><td></td></tr><tr><td>Ev yapımı manuel daldırmalı dondurma teçhizatı</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Bir muhafaza tesisinde bir tezgah üzerinde yalıtılmış bir etan kabı (yüksek yoğunluklu köpük) ve sıvı nitrojen banyosu (polistiren) ile.</td></tr><tr><td>İnsan kanı</td><td>n/a</td><td>n/a</td> Birleşik <td>Krallık Ulusal Kan ve Nakil servisi</td></tr><tr><td>JEOL 4700F Z JSM, Leica VCT500 aşamalı soğutma sistemi</td><td>ile JEOL</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Leica EM ACE600, VCT500 kriyokademeli</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>püskürtmeli kaplayıcı</td></tr><tr><td>Leica EM ACE900</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>e-ışınlı döner kaplayıcı. Nem kontrollü bir odada.</td></tr><tr><td>Işık mikroskobu için Linkam kriyo aşaması</td><td>Linkam</td><td>Model No. CMS196</td><td>Kırpılmış ve kırpılmamış ızgaralar için kasetler. Nem kontrollü bir odada.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E200 ışık mikroskobu</td><td></td>, <td>nem kontrollü bir odada Linkam kriyo aşamalı Nikon</td> <td>n/a</td>.</tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR International</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll yastık için çözelti 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 ortam ve 315 ml Percoll</td></tr><tr><td>Quantifoil bakır 200 gözenekli 2/4 delikli karbon EM Bulucu ızgaraları</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCuH2-01</td><td>100 paket</td></tr><tr><td>Quantifoil bakır 200 gözlü 2/4 delikli karbon EM ızgaralar</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCu20-01</td><td>100 paket</td></tr><tr><td>Çekirdek PP3010 hazırlık odası</td><td>Çekirdek</td><td>n/a</td><td>püskürtme kaplayıcı</td></tr><tr><td>Scios çift kiriş, Quorum PP3010 transfer aşaması ile donatılmıştır.</td><td>FEI</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Staedtler Lumocolor ince siyah kalıcı keçeli kalem</td><td>Viking Direct</td><td>ND538522</td><td></td></tr><tr><td>TFS Titan Krios 300 kV</td><td>TEM Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>TEM K2 veya K3 kamera ile donatılmıştır.</td></tr><tr><td>Whatmann grade 1 filtre kağıdı</td><td>Sigma</td><td>WHA1001150</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Scope A1 ışık mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td>, <td>nem kontrollü bir odada Linkam kriyo aşaması ile.</td></tr></tbody></table>

kriyo-elektron tomografisi için Çift işınlı taramalı elektron mikroskobu kullanarak vitreus biyolojik numunelerinden lamel hazırlanması

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Burada, diğer biyolojik örnekler için kolayca uyarlanabilen Plasmodium falciparum ile enfekte olmuş insan eritrositlerinin dalma dondurulmuş ızgaralarından kriyo-lamel hazırlamak için bir protokol sunulmaktadır. Numune hazırlamak, frezelemek ve lamelleri görüntülemek için temel prensipler tüm cihazlarda ortaktır ve protokol, kriyo-elektron mikroskobu (cryoEM) ve kriyo-elektron tomografisi (cryoET) için ızgara üzerinde kriyo-lamel hazırlığı için genel bir kılavuz olarak takip edilebilir. Hücreleri destekleyen elektron mikroskobu ızgaraları, manuel veya otomatik bir dalma dondurucu kullanılarak sıvı azot soğutmalı sıvı etana daldırılır, daha sonra bir kriyo-aşama ile donatılmış bir ışık mikroskobunda taranır. Dondurulmuş ızgaralar, odaklanmış bir iyon demeti (cryoFIB-SEM) ile donatılmış bir kriyo-taramalı elektron mikroskobuna aktarılır. Izgaralar, frezelemeden önce rutin olarak püskürtme kaplamalıdır, bu da frezeleme sırasında yük birikiminin dağılmasına yardımcı olur. Alternatif olarak, ızgaralara tam kalınlığı daha hassas bir şekilde kontrol edilebilen bir karbon-platin tabakası uygulamak için bir e-beam döner kaplayıcı kullanılabilir. KriyoFIB-SEM'in içine girdikten sonra, bir gaz enjeksiyon sistemi (CBS) aracılığıyla ızgaranın yüzeyine bir organoplatin bileşiğinin ek bir kaplaması uygulanır. Bu tabaka, lamellerin ön kenarını öğütülürken korur, bütünlüğü düzgün ince lameller elde etmek için kritik öneme sahiptir. İlgilenilen bölgeler SEM aracılığıyla tanımlanır ve frezeleme, aşırı ısı oluşumunu önlemek için lamel elektron saydamlığına ulaştığında iyon ışınının akımını azaltarak kademeli bir şekilde gerçekleştirilir. Çoklu lamelleri olan bir ızgara daha sonra eğim serisi edinimi için kriyojenik koşullar altında bir transmisyon elektron mikroskobuna (TEM) aktarılır. Lamel hazırlığı için sağlam ve kontaminasyonsuz bir iş akışı, hücresel kriyoEM, kriyoET ve alt tomogram ortalaması dahil olmak üzere aşağı akış teknikleri için önemli bir adımdır. Özellikle yüksek basınçlı dondurulmuş numunelerin kaldırılması ve frezelenmesi için bu tekniklerin geliştirilmesi, sahada yüksek önceliğe sahiptir.

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Bu protokol, kriyo-elektron tomografisi için Plasmodium-falciparum ile enfekte olmuş kırmızı kan hücrelerinin vitreus lamellerinin hazırlanmasını özetlemektedir. Bu, parazitin sıtmaya nasıl neden olduğu hakkında ayrıntılı yapısal bilgilerin doğrudan gözlemlenmesini sağlar. Kriyo-elektron tomografisi, hücrelerin iç kısımları hakkında yüksek çözünürlüklü bilgileri kaydeder.Proteinler hakkında üç boyutlu yapısal bilgileri ortaya çıkarmak için hesaplamalı olarak ekstrakte edilebilen ve ortalaması alınabilen tek protein komplekslerini in situ olarak gözlemlemek için yeterince güçlüdür. Bu protokol farklı hücre tipleri için kolayca uyarlanabilir ve kriyo-elektron tomografisi için vitreus lamel üretiminde yeni biri için bir başlangıç noktası olabilir. Bu, bugün protokolü uygulayacak olan Alejandra Carbajal.Başlamak için, ızgara boyunca buz gradyanına özellikle dikkat eden bir ışık mikroskobu için bir CryoStage kullanarak donmuş bakır ızgaraları tarayın. Buzun daha ince alanlarındaki hücre kapsamı için ayrı ayrı ızgara karelerini kontrol edin. Cryo-FIB-SEM'e özgü Autogrid jantların önünü ve karşı tarafını işaretlemek için siyah silinmez bir işaretleyici kullanın.Kırpılmış ızgarayı karbon tarafı yukarı bakacak şekilde Cryo-FIB-SEM mekiğine yükleyin ve hücrelerin yüzeyine dört nanometre kalınlığında karbon veya platin e-ışınlı döner kaplama uygulayın. Mekiği Cryo-FIB-SEM'e yükleyin ve her ızgaradaki hücre dağılımını SEM ile beş kilovoltta değerlendirin. Izgaradaki buz gradyanlarına bakmak için 100 güçte düşük büyütmeli bir genel bakış elde edin.Ardından, tek tek ızgara karelerine bakmak için 5.000 güçte daha yüksek büyütmeli görüntüler çekin. Gaz enjeksiyon sistemi iğnesini ızgaranın üstündeki odaya sokarak ve organoplatin kaynağını bir buhar akışı üretmek için belirli bir süre için belirli bir sıcaklığa ısıtarak her ızgaranın yüzeyine iki mikrometre organoplatin kaplama uygulayın. Numuneyi gözlemlemek için, numuneyi ızgaranın düzlemi iyon ışınının insidans açısından yaklaşık 10 derece olacak şekilde eğin ve hem SEM hem de FIB görüntülerinde görülecek uygun bir ızgara karesinin merkezini hareket ettirin.İyon ışınını düşük akımda kullanarak, bir ızgara karesinin merkezindeki hücreleri görselleştirmek için ızgarayı yüksek bir büyütmede inceleyin. Frezelemek için biri üç mikrometre kalınlığında korunan bir bölgenin üstünde ve altında olmak üzere iki dikdörtgen deseni işaretleyin. Ardından ışın ayarlarını seçin ve parlaklığı ve kontrastı ayarlayarak astigmatizmayı düzeltin.Kurulum tamamlandıktan sonra, iyon ışını görünümünde ve aralıklı olarak SEM tarafından canlı ilerlemeyi izlerken 300 pikoamper akımda frezelemeye başlayın. Numune SEM görünümünde kontrol edilir ve ilk frezelemeden sonra, iyon ışını korunan bölgenin üstündeki ve altındaki numuneyi kırmadıysa, dikdörtgen desenlerin yüksekliğini artırarak daha fazla malzeme çıkarın. Lamelin üstündeki ve altındaki yüzey iyon ışını görünümünde tamamen pürüzsüz olduğunda frezelemeyi durdurun.Frezeleme işlemini adım adım tekrarlayın, 300 nanometre kalınlığa ulaşana kadar her seferinde iyon ışını akımını azaltın. Her lamelin X Y Z konumunu kaydedin. Deneyin sonunda lamelleri parlatmak için, parlatılacak bir lamel grubu seçmek ve parlatma kökünü işaretlemek için düşük büyütmeli bir SEM genel bakışı kullanın.Parlatma kökü işaretlendikten sonra, iki dikdörtgen desen arasındaki boşluğu 100 ila 200 nanometreye düşürün ve parlatmaya 30 pikoamperlik bir iyon ışını akımında başlayın. SEM ile ilerlemeyi iki ila üç kilovoltta izleyin. Lameldeki kontrast SEM tarafından kaybedildiğinde veya organoplatin kat veya lamelin kendisi bütünlüğünü kaybetmeye başladığında parlatmayı bırakın.Her lamelin düşük büyütmeli SEM görüntülerini alın ve kaydedin. Deneyin tamamlanmasından sonra, mekiği mikroskoptan çıkarın. Izgaraları lameller ile çıkarın ve sıvı azot altında saklayın.Izgaraları dikkatli kullanın. Morfolojiyi incelemek için, şizontlar E-64 inhibitörlerinde bileşik iki kullanılarak çıkışın farklı aşamalarında durduruldu. İkinci bileşiğin varlığında, konakçı kırmızı kan hücresindeki parazitoforöz membranlar ve çevresindeki hemoglobin arasındaki sınır iyi tanımlanmıştır.Bozulmamış parazitoforöz vakuol veya PV'ler, tek bir hemozoin kristali kümesinde merozoitlerle doluydu. Bileşik iki senkronize şizont, E-64'e yıkandığında, PV membranı yırtıldı ve merozoitler RBC içinde yayıldı. Bir bakır ızgara üzerindeki iyi hücre dağılımının tipik bir örneği, iyi tanımlanmış bir çevre ve sağlam bir vakuol zarı olan büyük kırmızı kan hücrelerini gösterir.Kısmen çökmüş bir konakçı kırmızı kan hücresi içinde, bireysel merozoitler küçük hücre kümeleri olarak görselleştirildi. Her şizontun merkezinde hemozoin kristallerinin konumunu gösteren siyah bir nokta vardı. Frezelemeden sonra, lamellerin pozisyonlarını belirlemek ve tomografi ile hedeflenecek uygun alanları bulmak için ızgaralar TEM'e yüklendi.Örnek mikrografta, yakın zamanda bir merozoit tarafından istila edilmiş bir RBC görülebilir. Konakçı hücre kaynaklı membran ile çevrili merozoit, RBC sınırları içinde görülebilir. Merozitin apikal ucunda, hücreyi çevreleyen iki zar ve elektron yoğun mantar şeklindeki bir özellik ile ilişkili merozoitin tepesinde istiflenmiş dört zar açıkça görülebiliyordu.Merozitin sitoplazması içinde, merozoit plazma membranı ile çok katmanlı bir vezikül arasında bir füzyon olayı tespit edildi. 230 nanometre kalınlığında bir lamelin ek bir TEM analizinde, E-64 ile muamele edilen olgun bir merozoitin tipik morfolojisi gözlenmiştir. Kırmızı kan hücresi zarı içinde, merozoit plazma zarı, iç zar kompleksi, polar halkalar, mikronemeler, roptriler ve nükleer zarf gibi organeller ile görülebilir.Bu tekniğin en önemli kısmı, ince lamellerin tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde üretilmesini sağlamak için ızgaraları optimize etmektir. Bu tekniğin daha da geliştirilmesi, araştırmacıların sıtma parazitleri içindeki tek proteinli molekülleri görselleştirmelerini ve sıtma çıkışındaki rollerini belirlemelerini sağlayacaktır.

preparing-lamellae-from-vitreous-biological-samples-using-dual-beam

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bu rapor, kalın biyolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron tomografisini gerçekleştirmek için bir numune hazırlama protokolünü ve özel görüntüleme koşullarını açıklar.

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Kriyojenik elektron tomografisinde büyük ölçekli veri toplama için artan talep, yüksek verimli görüntü alma rutinleri gerektirir. Burada açıklanan, tomografik veri toplamanın zaman verimliliğini ve verimini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan gelişmiş satın alma stratejilerinin son gelişmelerini uygulayan bir protokoldür.

Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri

Burada, kriyo-elektron tomografisi için hücresel numunelerin hazırlanmasına rehberlik etmek için 3D bağıntılı odaklanmış iyon ışını frezeleme için bir boru hattı sunuyoruz. İlgilenilen floresan etiketli proteinlerin 3 boyutlu konumu önce kriyo-floresan mikroskobu ile belirlenir ve daha sonra öğütme için hedeflenir. Protokol memeli, maya ve bakteri hücreleri için uygundur.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Bu iş akışı, kriyojenik üç tesadüfi görüntüleme platformu kullanarak küçük (eksenel kapsamda &lt;1 μm) ve nadir (hücre başına 1 kopya) floresan etiketli biyolojik yapıları hedefleyen lamel üretimini mümkün kılar. Bu platform, floresan mikroskobu, odaklanmış iyon ışını frezeleme ve taramalı elektron mikroskobunu tek bir odak konumunda birleştirir ve frezeleme sırasında eş zamanlı floresan mikroskobuna olanak tanır.

Hücrelerin Hedeflenen Frezelenmesi için Kriyojenik Tesadüfi Floresan, Elektron ve İyon Işını Mikroskobu Kullanan İş Akışı

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Bu protokol, kalın dokular için kriyo-elektron tomografisini (kriyo-ET) standartlaştırır; yüksek basınçlı dondurma (HPF) ile waffle yöntemi, kriyojenik odaklı ion ışını (kriyo-FIB) kaldırma ve doz-simetrik, paralel alım ile entegre edilir; böylece fare hipokampusunda tekrarlanabilir in situ analizi için uniform ince lameller ve vitrifikasyon örnekler elde edilir.

Fare Hipokampusunda Kalın Dokular İçin Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışı Gösterildi

Öğrenin, Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositlerden kriyolamel hazırlama yöntemini. Kriyoelektron tomografisi ile parazit yapısını yüksek çözünürlükte inceleyin.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması (Video) | JoVE Journal

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Daha fazla video keşfet