Name: Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiaenin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae örneklerini kriyo-elektron tomografi için kriyo-FIB mikromakine ile hazırlama yöntemini. Bu protokol, hücre iç yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu'nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) ve bir Instruct-ERIC Centre (LM2018127) olan CIISB araştırma altyapısı tarafından desteklendi. Thermo Fisher Scientific Brno'dan alınan desteği kabul ediyoruz.

1. Vitrifikasyon için Saccharomyces cerevisiae hücrelerinin yetiştirilmesi ve hazırlanması
<ol><li>Saccharomyces cerevisiaeiçin sıvı büyüme ortamı hazırlayın.<ol>
<li>Büyüme ortamının hazırlanması için 500 mL'lik bir cam şişeyi otoklavlayın.</li>
		<li>2,2 g maya özü (%1,1) ve 4,4 g Pepton (%2,2) ağırlığındadır ve 200 mL suda karıştırın.</li>
		<li>121 °C'de 15 dakika otomatik kapatarak sterilize edin.</li>
		<li>10 g glikoz tozu tartın ve% 20 glikoz çözeltisi elde etmek için 50 mL suda karıştırın. Çözeltiyi 0,2 μm filtreden geçirin ve 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Saccharomyces cerevisiaeiçin katı ortam hazırlayın.<ol>
<li>4 g agar tozu tartın ve 200 mL büyüme ortamı ile karıştırın.</li>
		<li>121 °C'de 15 dakika boyunca bir otoklavda sterilize edin.</li>
		<li>Ortayı 40-50 °C'ye kadar soğutun ve % 20 steril glikozun 20 mL'sini ekleyin (önceki adımda hazırlanır). Petri kabına tam ortamın ~20 mL'lik kısmını dökün ve ortam sıcaklığında katılaşmasına izin verin.</li>
		<li>Kurutmadan korunmak için agar plakalarını parafilme sarın ve 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kültür Saccharomyces cerevisiae süspansiyonda NOT: Protokol, Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 [ATCC 4040002] veya benzeri suşların askıya alınmasından kriyo-FIBM için bir numune hazırlanması için optimize edilmiştir.<ol>
<li>50 mL Erlenmeyer (veya benzeri) bir şişeyi otoklavlayın.</li>
		<li>Bir başlıkta veya laminar akış kutusunda çalışın. Pipet 10 mL büyüme ortamı steril bir 50 mL Erlenmeyer şişesi.</li>
		<li>Ortamı 1 mL filtrelenmiş% 20 glikoz ile destekleyin. Steril, tek kullanımlık aşılama halkası (1-10 μL) olan bir agar plakasından bir maya kolonisi seçin.</li>
		<li>Erlenmeyer şişesini ajitasyon (150-200 rpm) ile 30 °C'de inkübatöre ve kültüre üstel faza (yaklaşık 7 saat) ulaşana kadar yerleştirin. NOT: Koloniler 4 hafta boyunca ortam sıcaklığında kültürlenen agar plakalarından alındığında üstel faza ~15 saat sonra ulaşıldığını gözlemledik. Ayrıca aşağıya bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kültür Saccharomyces cerevisiae gliserol stoğundan bir agar plakası üzerinde.<ol>
<li>4 °C depolama alanından yeni bir agar plakası kullanın.</li>
		<li>S. cerevisiae stoğunu -80 °C derin dondurucudan alın ve stokun tamamen çözülmesini önlemek için dondurucu bir standa yerleştirin.</li>
		<li>Steril bir aşılama döngüsü (1-10 μL) ile küçük bir kültürü kazıyın ve 50 μL büyüme ortamına aktarın. Düzgünce karıştırın.</li>
		<li>Karışık S. cerevisiae kültürünün tüm hacmini aktarın ve agar plakasının yüzeyine steril bir serpme çubukla dağılın.</li>
		<li>1,5-2 mm çapında koloniler oluşana kadar yaklaşık 48 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Deneyden önce kolonileri yeni kültüre etmeniz önerilir. 1 haftadan büyük koloniler, üstel büyüme aşamasına ulaşmak için sıvı ortamda ekim için uzun bir süre gerektirecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kültür Saccharomyces bir agar tabak üzerinde cerevisiae.<ol>
<li>Yetişkin S. cerevisiae kolonileri ile hazırlanmış agar plakaları kullanın.</li>
		<li>Pipet 10 mL steril büyüme ortamı ve 1 mL filtrelenmiş% 20 glikoz 50 mL Erlenmeyer şişesine.</li>
		<li>Steril bir aşılama döngüsü ile S. cerevisiae kültürünün bir kolonisini seçin ve bir şişede büyüme ortamı ile karıştırın.</li>
		<li>Ajitasyon (150-200 rpm) ile 30 °C'de 50 dakika kuluçkaya yaslayın.</li>
		<li>Süspansiyon kültürünü büyüme ortamıyla on kez seyreltin ve steril bir serpme çubuğu ile bir agar plakasına 50 μL süspansiyon dağıtın.</li>
		<li>1,5-2 mm koloniler gözlenene kadar yaklaşık 48 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Kurumasını önlemek için Petri kabının kenarlarını parafilm ile sarın. Oda sıcaklığında saklayın ve en fazla 4 hafta kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre kümelerinde dalma donması için Saccharomyces cerevisiae hazırlayın.<ol>
<li>S. cerevisiae hücre kültürünü, Saccharomyces cerevisiae ekimi bölümündeki protokole göre süspansiyonda hazırlayın (Bölüm 1.3) ve 30 °C'de ~7 h'yi ajitasyonla (150-200 rpm) kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>UV/Vis spektrofotometre kullanarak S. cerevisiae hücre süspansiyon kültürünün OD'sini 600 nm olarak ölçün.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu OD600 = 1'e konsantre edin.</li>
	</ol></li>
	<li>S. cerevisiae'yi hücre monolayerinde dalma donması için hazırlayın.<ol>
<li>Saccharomyces cerevisiae süspansiyon hücre kültürünün yetiştirilmesi bölümündeki protokole göre S. cerevisiae hücre kültürünü hazırlayın ve ajitasyon (150-200 rpm) ile 30 °C'de ~7 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>UV/Vis spektrofotometre kullanarak S. cerevisiae hücre süspansiyon kültürünün OD'sini 600 nm olarak ölçün.</li>
		<li>Hücreleri orta derecede santrifüj tüpüne aktarın ve göreceli bir santrifüj kuvvetinde (900 x g) 2 dakika hafifçe döndürün.</li>
		<li>Pipetleme ile hücre peletinden ortamı atın.</li>
		<li>Hücre peletine taze ortam ekleyin. OD600'ün 30 ila 60'a eşit bir hücre süspansiyonu elde etmek için ortamın hacmini hesaplayın.</li>
		<li>Vitrifikasyondan kısa bir süre önce% 5'lik son konsantrasyona hücre süspansiyonuna gliserol (% 50 stok çözeltisi) ekleyin. NOT: Gliserol, hücreler arasındaki bölgelerdeki buzun kalitesini artıran koruyucu bir ajan olarak çalışır. Gliserol, vitrifikasyondan kısa bir süre önce hücrelere eklenir ve hücreye alımını en aza indirir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Saccharomyces cerevisiae örneğinin vitrifikasyonu
<ol><li>Karbon film tarafı 30-45 sn'ye bakacak şekilde ışıma deşarjı TEM ızgaraları (basınç: 6-9 Pa, akım: 7 mA).</li>
	<li>Vitrifikasyon robotunu aşağıdaki parametrelere ayarlayın: sıcaklık: 18 °C, nem: %100, leke süresi: 6 s, bekleme süresi: 5 s, şişkinlik döngüsü: 1x ve leke kuvveti: 5. NOT: Blot kuvveti enstrümana özgü bir değerdir ve optimum blot kuvvet değerleri farklı makineler arasında farklılık gösterebilir. Belirli bir piston için en uygun değer deneysel olarak onaylanmalıdır.</li>
	<li>Vitrifikasyon için sıvı etan hazırlayın.</li>
	<li>Emici olmayan yüzey pedini numuneye bakan şişkinlik pedi içine monte edin. Diğer şişkinlik pedi için filtre kağıdını kullanın.</li>
	<li>Işıltı boşaltılmış ızgarayı cımbızla seçin ve cımbızları dalma dondurma cihazına monte edin.</li>
	<li>Piston iklim odası içindeki ızgaranın karbon tarafına 3,5 μL S. cerevisiae süspansiyon uygulayın. Izgaradaki her uygulamadan önce düzgün bir şekilde karıştırın.</li>
	<li>Dalma ızgarayı sıvı etan içine dondurun.</li>
	<li>Izgarayı sıvı etandan LN2'yeaktarın. Vitrifiye hücreli ızgaraları LN2 koşullarında saklayın veya FIB-SEM mikroskobuna yüklemek için TEM ızgara kartuşuna monte edin.</li>
</ol>3. TEM ızgaralarının ızgara kartuşuna montesi
NOT: Burada açıklanan iş akışı, SEM ve TEM mikroskopları arasında numune işleme ve aktarımını kolaylaştırmak için ızgara kartuşuna monte edilmiş TEM ızgaralarını kullanır. Kartuş tertibatı bir C halkası, bir TEM ızgarası ve bir C-klips halkası oluşur. Diğer mikroskop üreticilerinin enstrümantasyonu ile çalışırken başka seçenekler de mevcuttur. Izgara kartuş montaj iş istasyonu LN2ile doldurulur. LN2 seviyesi ızgara kutusunu TEM ızgaralarıyla kaplar, ancak TEM ızgaralarının kartuşa montajı LN2 buharlarında gerçekleştirilir. Numuneye bulaşmayı önlemek için vitrifikasyon prosedürü sırasında koruyucu bir yüz maskesi veya kalkan takılması şiddetle tavsiye edilir. Buz kirlenmesi biriken aletlerle çalışmayın.
<ol><li>Izgara kartuşu montaj iş istasyonunu bir araya koyun ve kırpma için kuru takımlar hazırlayın.</li>
	<li>Montaj iş istasyonunu LN2ile soğutun. Kırpma aletlerini LN2 sıcaklığına soğutun.</li>
	<li>Montaj iş istasyonuna vitrifiye örnek içeren bir ızgara kutusu yerleştirin.</li>
	<li>Numunenin C halkasına bakacak şekilde bir TEM ızgarası yerleştirin ve bir C-klipsi ile sabitleyin.</li>
	<li>Kırpılmış kartuşları ızgara kutusuna yerleştirin ve düzgün bir şekilde kapatın.</li>
	<li>Kartuşları LN2 Dewar'da saklayın veya FIB-SEM mikroskobuna yükleyin.</li>
</ol>4. Numunenin FIB-SEM mikroskobuna yüklenmesi ve manipülasyonu
NOT: Talimatlar PP3010 kriyo-FIB/SEM hazırlama sistemi ile donatılmış çift ışınlı mikroskop Versa 3D'nin kullanımı için yazılmıştır. Alternatif çözümler farklı özel parametreler gerektirebilir; ancak, iş akışının genel kavramı hala geçerli olmalıdır.
<ol><li>Mikroskobu sıvı nitrojen sıcaklığına kadar soğutun.<ol>
<li>Kirlenme büyümesini önlemek için mikroskop haznesini ve hazırlama haznesini (varsa) soğutma başlamadan önce yüksek bir vakuma (< 4 x 10-4 Pa) pompalayın.</li>
		<li>Hazırlama odası, mikroskop aşaması ve mikroskop antikontaminatörü için azot gazı akışını 5 L/dk olarak ayarlayın. Tüm bileşenler < -180 ° C sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin. NOT: Bu çalışmada kullanılan FIB-SEM mikroskop kurulumu, aşamasını ve antikontaminatörünü soğutmak için soğutulmuş azot gazı kullanır. Diğer sistemler sahne soğutması için farklı bir yöntem kullanabilir. Burada kullanılan alet üzerinde sahne ve antikontaminatör-190 °C'de olduğunda hazne basıncı ~3 x 10 -5 Pa'ya ulaşır. Bu çalışmada kullanılan deneysel kurulum ile lamel yüzeyindeki hidrokarbon kirletici tabakanın büyüme hızı ~15 nm/saat'tir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Izgara kartuşunu numune ile mikroskoplara yükleyin.<ol>
<li>Yükleme istasyonunu LN2 sıcaklığına monte edin ve soğutun.</li>
		<li>Mekiği (numune tutucu), numunenin olduğu ızgara kutusunu, ızgara kutusu açıcısını ve cımbızı soğutulmuş yükleme istasyonuna yerleştirin.</li>
		<li>Izgara kartuşunu, numune mekiğe bakacak şekilde dikkatlice aktarın.</li>
		<li>Yükleme istasyonunun içindeki mekiği yükleme konumuna çevirin.</li>
		<li>Mikroskopa yükle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, numuneyi metal koruyucu katmanlarla kaplayın. NOT: Donmuş hidratlı biyolojik malzeme SEM'i görüntülerken güçlü bir şarj etkisi gözlenebilir. Ek olarak, FIB ile görüntüleme biyolojik örnekleri (düşük akımlarda bile) hızlı numune hasarına neden olur. Bu nedenle, numune yüzeyini korumak için FIB-SEM mikroskobu içinde numunenin ek bir kaplaması gerçekleştirilebilir.<ol>
<li>Koruyucu tabakayı gaz enjeksiyon sistemi (CBS) tarafından organometalik platin ile biriktirin.<ol>
<li>Örneği ösantrik yüksekliğe ayarlayın (elektron ve iyonlarla görüntüleme için tesadüf noktası).</li>
			<li>Sahneyi tekrar 45° 'ye eğin (numune elektron ışınlarına göre 90° eğilir).</li>
			<li>Sahneyi zekseninde ösantrik yüksekliğin 4 mm altına taşıyın.</li>
			<li>CBS iğnesini 26-30 °C'ye ayarlayın.</li>
			<li>Organometalik platin tabakasının ~300-1000 nm'lik kısmını biyolojik örnekle birlikte ızgaraya biriktirin (CBS birikiminin 30-120 sn'sine karşılık gelir). NOT: Genellikle küçük hücresel kümelere sahip numuneler için 30 sn ve hücrelerin monolayer'ına sahip numuneler için 45 s için CBS uygularız.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sputter, numune yüzeyini iletken bir metal tabaka ile kaplar.<ol>
<li>Metal tabakanın ~10 nm'sini (Ir, Au, Pt) biyolojik bir örnekle ızgaraya biriktirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lamel hazırlığı için mikroskop parametrelerini ayarlama<ol>
<li>FIB için aşağıdaki parametreleri kullanın: yüksek voltaj = 30 kV, akım = 10 pA (görüntüleme), 10 pA–3 nA (FIB frezeleme)</li>
		<li>SEM için aşağıdaki parametreleri kullanın: yüksek voltaj = 2–5 kV, spot boyutu = 4,5, akım = 8–27 pA.</li>
		<li>Her iki ışın için tarama dönüşünü 180° olarak ayarlayın.</li>
		<li>Kademe eğimini ayarlayın: frezeleme açısı 6-11° (45° ön eğimli numune mekiği için 13°-18° kademe eğimine ve SEM ile FIB sütunu arasında 52° açıya sahip FIB/SEM mikroskobuna karşılık gelir).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Saccharomyces cerevisiae lamella hazırlanması
<ol><li>Izgara kalitesini kontrol edin ve uygun bir Saccharomyces cerevisiaekümesi seçin.<ol>
<li>TEM ızgarasının hücre kümesinin etrafında veya ızgaranın arka tarafında ek su olmadan her iki taraftan düzgün bir şekilde şiştiğinden emin olun. NOT: Izgaranın arka tarafını kontrol etmek için sahneyi -10° dereceye döndürün ve ızgarayı FIB ile görüntüleyin.</li>
		<li>Aşağıdaki önerilere göre lamel hazırlama için en uygun hücre kümelerini seçin.<ol>
<li>Hücre kümelerini kılavuz ortasına yerleştirin. Frezeleme alanı, ızgaranın ortasına yerleştirilmiş 1100 x 1100 μm boyutlarında (ızgara merkezinden her yönde 550 μm) karenin dışına uzanmamalıdır.</li>
			<li>Hücre kümelerini kılavuz çubuğunun üst üste bindirmeden kılavuz karesinin orta kısmına yerleştirin.</li>
			<li>Hücre kümelerini ızgara karesine çatlaksız kompakt delikli karbon folyo ile yerleştirin.</li>
			<li>Kümenin buz kirlenmesi ile çevrili olmadığından emin olun.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Saccharomyces cerevisiae monolayer'da en uygun frezeleme pozisyonunu seçin.<ol>
<li>Seçili kılavuz karesindeki hücre monolayerini çevreleyen ızgara çubuklarının görünür olduğundan emin olun.</li>
		<li>Aşağıdaki önerilere göre hücresel monolayerde en uygun konumu seçin. Frezeleme için seçilen alanlar aşağıdaki ölçütleri karşılamalıdır:<ol>
<li>Izgara merkezinde ilgi alanına sahip olmak. Frezeleme alanı, ızgara merkezine yerleştirilmiş 1100 x 1100 μm boyut karesinin dışına uzanmamalıdır (ızgaranın merkezinden her yönde 550 μm).</li>
			<li>Izgara çubuğunun üst üste binmemiş ızgara karesinin orta kısmında ilgi alanına sahip olun.</li>
			<li>Hücre monolayerini buz kirlenmesi ile çevreleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>S. cerevisiae lamella'ya cryo-FIB hazırlayın. NOT: Frezeleme deseni, ilgi alanına göre oluşturulur ve ortalanır. Cryo-FIBM, farklı FIB ayarlarında gerçekleştirilen birden fazla frezeleme adımı ile sırayla gerçekleştirilir. Kabaca 2 μm kalınlığındaki lamel başlangıçta yüksek akım (0,3-3 nA) kullanılarak öğütülmüş. Lamel daha sonra kademeli olarak 500 nm'ye inceltir. Düşük akımlarda (10-30 pA) ince frezeleme adımı, lamelleri ~100-200 nm kalınlıkta sonuçlandırmak için kullanılır.<ol>
<li>İlgi alanı (YATıRıMG) bölgesini ösantrik yüksekliğe ayarlayın ve bu konumu kaydedin. NOT: Tesadüf noktasının her pozisyon için ayrı ayrı belirlenmesi ve kaydedilmesi gerekir. Ötemerkez yüksekliği, sahneyi 0° 'ye eğerek ve sahneyi x ve y yönünde hareket ettirerek yatırım getirisi üzerinde ortalanarak ayarlanır. Aşama daha sonra 25° 'ye yatırılır ve yatırım getirisi, aşama zekseni konumu değiştirilerek taranan alanın ortasına geri getirilir. Son olarak, frezeleme için kademeli olarak 13°–18° geriye doğru eğilir.</li>
		<li>Yatırım getirisinin üzerinde, Yukarıdan Aşağıya tarama yönüne sahip dikdörtgen bir frezeleme deseni tanımlayın.</li>
		<li>Yatırım getirisinin altında, Aşağıdan Yukarıya tarama yönüne sahip dikdörtgen bir frezeleme deseni tanımlayın.</li>
		<li>Lamel kalınlığının kabaca tahmini için ilgi çekici bölgeyi kapsayan etkin olmayan dikdörtgen freze desenini tanımlayın. Bu desen lamel hazırlığı sırasında öğütülmüş değildir.</li>
		<li>Tüm desenleri işaretleyin ve lamel genişliğini(x boyut) ayarlayın. Frezeleme deseninin genişliği küme genişliğinin 2/3'ü geçmemelidir. Bu, çoğu durumda 8-15 μm'ye karşılık gelir.</li>
		<li>Kaba frezeleme adımları için parametreleri ayarlama<ol>
<li>FIB akımı: 0.3–3.0 nA ; nihai lamel kalınlığı: 1.5–2 μm; FIBM alanının genişliği: 8-12 um; kademe eğimi: 13-17°; süre: 8 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst ve alt.</li>
			<li>FIB akımı: 0.3–1.0 nA; nihai lamel kalınlığı: 1 μm; FIBM alanının genişliği: 7.5-11.5 μm; kademe eğimi: 13-17°; süre: 8 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst ve alt.</li>
			<li>FIB akımı: 100–300 pA; nihai lamel kalınlığı: 0.5 μm; FIBM alanının genişliği: 7.5-11.5 μm; kademe eğimi: 13-17°; süre: 8 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst ve alt.</li>
			<li>FIB akımı: 30–100 pA; nihai lamel kalınlığı: 0.3 μm; FIBM alanının genişliği: 7.5-11.5 μm; kademe eğimi: 13-17°; süre: 8 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst ve alt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İnce frezeleme adımı için parametreleri ayarlayın:<ol>
<li>FIB akımı: 10–30 pA; nihai lamel kalınlığı: <0.2 um; FIBM alanının genişliği: 7-11 μm; kademe eğimi: 13-17° (+1°); süre: 12 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst. NOT: Kaba frezeleme adımları (5.3.6) her lamel için sırayla gerçekleştirilir. Buna karşılık, ince frezeleme adımı (5.3.7) pürüzlü frezeleme işlemine doğrudan uymaz, ancak lamel yüzeyindeki hidrokarbon kirlenmesini en aza indirmek için seansın sonundaki tüm lameller için ince frezeleme adımları sırayla gerçekleştirilir. Lamel kalınlığının uzunluğu boyunca homojenliğini artırmak için ince frezeleme adımı sırasında ekstra +1° kademe eğimi kullanılır.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>6. Saccharomyces cerevisiae lamella'nın kriyo-TEM'e transferi
<ol><li>Düzgün kurutulmuş bir Dewar hazırlayın ve LN2ile doldurun.</li>
	<li>Örnekleri kriyo koşulları altında FIB/SEM mikroskobundan lamel ile boşaltın, bir ızgara kutusuna aktarın ve uzun süreli depolama için bir LN2 depolama Dewar'da saklayın. Alternatif olarak, ızgaraları doğrudan kriyo-TEM'e yükleyin.</li>
	<li>Lamellerin kriyo-TEM kademe eğim eksenine göre doğru yönlendirilmiş olması önemlidir (daha fazla ayrıntı için saat 8:10'da eşlik eden videoya bakın). Hazırlanan lamellerin frezeleme yönünün kriyo-TEM kademe eğim eksenine dik olduğundan emin olun.</li>
	<li>Izgara düzlemine göre lamel eğimini telafi etmek ve doz simetrik şeması19kullanarak eğme serisini toplamak için kriyo-TEM aşamasını önceden eğin. NOT: Ön eğimin büyüklüğü (tipik olarak 6–8°), mikromakineleme sırasında TEM ızgara düzlemi ile FIB yönü arasındaki açıya göre belirlenir. Kriyo-TEM'deki görüntüdeki lamel ön kenarının konumu, ön eğim açısının işaretini belirlemek için kullanılabilir. Bunun için mikroskop aşaması dönüşü duygusu bilinmelidir. Deneysel kurulumumuzda, nanoprobe SA modunda çekilen görüntünün sağ tarafındaki lamel ön kenarının konumu negatif ön eğime karşılık gelir.</li>
</ol>

<ol><li>McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+optimal+performance+at+300keV+of+three+direct+electron+detectors+for+use+in+low+dose+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Dubochet, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+pure+water+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Vitrification of pure water for electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).</li>
<li>Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+windows+into+the+cell%3A+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li>
<li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li>
<li>Schur, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high-resolution+in+situ+structural+biology+with+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).</li>
<li>O'Reilly, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+architecture+of+an+actively+transcribing-translating+expressome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome.</a> Science. 369, 554-557 (2020).</li>
<li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).</li>
<li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).</li>
<li>Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+artefacts+and+cutting+process+in+vitreous+sections+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).</li>
<li>Pierson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+%26%2334%3Bread%26%2334%3B+a+vitreous+section%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How to &#34;read&#34; a vitreous section.</a> Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).</li>
<li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-focused+Ion+Beam+Sample+Preparation+for+Imaging+Vitreous+Cells+by+Cryo-electron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography.</a> Bio-protocol. 5, (2015).</li>
<li>Wagner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+samples+from+whole+cells+using+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).</li>
<li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488(2020).</li>
<li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-eletron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography.</a> eLife. e52286, (2020).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li>
<li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).</li>
<li>Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amira%3A+A+highly+interactive+system+for+visual+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Visualization+Handbook%22%5BJournal%5D)">Amira: A highly interactive system for visual data analysis.</a> The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).</li>
<li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3A+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208, 107389(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Cryo-ET için hücresel örneklerin hazırlanması, birkaç üst düzey cihazın kullanılmasını gerektiren karmaşık bir iş akışıdır. Örnek kalitesi, tüm protokolün verimini etkileyen her hazırlık adımı sırasında tehlikeye atılabilir. Ek olarak, numune transferinin bireysel aletler arasında gerekliliği, numune kontaminasyonu veya sapma riski oluşturur. Bu nedenle, örnek hazırlama iş akışındaki bireysel adımların optimizasyonu, lamel hazırlama iş akışının verimini ve tekrarlanabilirliğini artırmak için yüksek öneme sahiptir. Burada sunulan protokol, saccharomyces cerevisiae'nin kriyo-ET tarafından yerinde makromoleküler komplekslerin yapısal karakterizasyonu için optimize edilmiş hazırlanmasını açıklar.
Protokol, esas olarak hücrelerin TEM ızgarasındaki konsantrasyonunda farklılık gösteren iki tür maya örneğinin hazırlanmasını açıklar. Her iki maya örneği de kriyo-ET için yüksek kaliteli lamel verdi ve numune tipinin seçimi belirli bir çalışmanın hedeflerine uygun olarak yapılabilir. Maya, ilk durumda ızgara yüzeyine rastgele dağılmış birkaç hücreden oluşan yalıtılmış kümeler oluştururken, ikinci örnek tipi için TEM ızgara yüzeyinde sürekli bir hücre monolayer bulunur. Birincisi, öğütilmesi gereken malzemenin küçük hacmi sayesinde hızlı lamel preparatı için uygundur. Son lamel oldukça kısadır ve bu nedenle sadece 2-4 hücresel kesit içerir. Numune hazırlama için uygun alanlar, lamel hazırlama iş akışının otomasyonu kısmen kısıtlayabilecek ızgara kareleri de dahil olmak üzere ızgara yüzeyine rastgele dağıtılır. Numunenin ikinci tipi, genel frezeleme süresini korumak için ilk frezeleme aşamasında daha büyük akımların kullanılmasını gerektirir. Ek olarak, bu tür bir örnek, düzensiz frezelemeden (perdeleme) kaynaklanan eserlere daha yatkındır. Bu nedenle, CBS, daha kalın bir koruyucu tabaka oluşturmak için küçük hücresel kümelere sahip numunenin durumundan% 50 daha uzun bir süre boyunca numune yüzeyine serpiştirilir. Daha sonra, örnek CBS tabakasını iyileştirmek, daha sert hale getirmek ve numune yüzey iletkenliğini artırmak için ek bir Iridium tabakası (alternatif olarak platin veya altın) ile serpiştirilir. Kaba lamel frezelemenin ilk adımı sırasında lamellerin her iki tarafındaki ek alanların FIBM'si (~2-5 μm lamel kenarından) büyük olasılıkla son kesit23'tekigerginliğin azalması nedeniyle kırık lamel sayısını azaltmak için faydalı bulunmuştur. Son lamel uzundur ve kriyo-ET için uygun bölgelerin sayısını artıran ~ 10 hücresel kesit içerir. Hücreler arasındaki ortamın veya tamponun yanlış vitrifikasyonu, kriyo koruyucunun tampon çözeltisine eklenmesiyle kolayca zayıflatılabilir (bu çalışmada kullanılan% 5 gliserol). Karelerin çoğu lamel preparatı için uygun olduğundan, sürekli bir monolayer halinde düzenlenmiş hücrelere sahip örnek, denetimsiz lamel preparatı için çok uygundur.
Lamel hazırlama iş akışındaki bir diğer önemli husus, iletim elektron mikroskobuna aktarılması ve lamellerin mikroskop kademe eğim eksenine uygun şekilde konumlandırılmasıdır. En uygun şekilde, lamel ana ekseni, görüntülenen bölgenin yüksekliğinde izleme ve odaklanma sağlayan ve lamel kenarlarının görüş alanını yüksek eğim açılarında korumasını önleyen mikroskobun eğim eksenine diktir. Doz simetrik şemasını kullanarak kriyo-ET verilerini toplarken,18 numune başlangıçta ızgara düzlemine göre lamel eğimini telafi etmek için mikroskopta döndürülmelidir.

Son teknolojik ve yazılımsal gelişmeler, vitrifiye biyolojik örneklerin elektron kriyo-mikroskopisini (kriyo-EM) son on yılda yapısal biyoloji araştırmalarında anahtar tekniklerden biri haline getirmiştir1,2. Kriyo-EM için bir numunenin hazırlanması genellikle saflaştırılmış bir proteinin veya nükleik asit içeren bir protein kompleksinin numune taşıyıcısına (TEM ızgarası) uygulanmasından, ardından sıvının çoğunun bir filtre kağıdı ile çıkarılmasından ve bir numunenin artık ince tabakası ile ızgaranın dondurulmasından oluşur sıvı etan veya propan3 . Böylece numune, tamamen hidratlı bir durumda, neredeyse yerel koşullarda ve herhangi bir kimyasal fiksasyona veya ağır metal kontrastına gerek kalmadan ince bir tabaka (tipik olarak <80 nm) amorf tamponda sabitlenir. İletim elektron mikroskobundaki yapısal homojen numunenin görüntülenmesi, daha sonra tek bir parçacık analizi protokolü kullanılarak makromolekülün atoma yakın çözünürlükte üç boyutlu yapısının belirlenmesi için kullanılabilecek verilerle sonuçlanır2. Böyle bir in vitro yapı, numune hazırlama sırasında kullanılan koşullar ve tedavi altında makromolekülün temsiline karşılık gelir. Tüp bebek koşullarında belirlenen yapılar genellikle makromolekülün tamamen işlevsel durumuna karşılık gelse de, hücre içindeki çeşitli makromoleküller arasında mekansal ilişkileri görüntüleyeme kapasitesi yapısal verilere ek bir fonksiyonel bağlam sağlayacaktır.
Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), 3D pleomorfik nesnelerin veya makromoleküler komplekslerin in situ4,5'iyeniden oluşturmak için kullanılır. Cryo-ET'nin avantajı, üç boyutlu bilgilerin tek bir varlığın görüntülenmesi ile elde edilmiş olmasıdır. Bununla birlikte, bireysel makromoleküler komplekslerin veya organellerin gözlendiği çözünürlük çok sınırlıdır. Bu nedenle, kriyo-ET veri6,7'den4-8 şçözünürlük modellerine ulaşmak için makromoleküllerin (alt tomogram ortalaması, STA) daha fazla sayıda tomogramdan aynı yapıya sahip ortalaması gereklidir. Son zamanlarda kriyo-ET ve STA'nın hücresel ortam bağlamında ribozomlar gibi makromoleküler makinelerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirlemek için de uygulanabileceği gösterilmiştir7. Bununla birlikte, iletim elektron mikroskopisinin kullanımı numune kalınlığı ile sınırlıdır. Genel olarak, bu, vitrifikasyon koşullarının optimizasyonunun sonunda numunenin ince bir buz tabakasına gömülmesi ile sonuçlanabileceği tek parçacıklı kriyo-EM için bir sorun değildir. Öte yandan, hücrelerin çoğu aslında 300 keV elektron ışını için elektron şeffaf değildir. 300 keV elektron için vitrifiye biyolojik örneklerde inelastik ortalama serbest yol yaklaşık 395 nm8, bu da kriyo-ET çalışmalarının hücrelerin çoğu için hücresel çevre ile sınırlı olduğu anlamına gelir.
Numuneyi kriyo-ET için yeterli kalınlıkte inceltmek için farklı teknikler geliştirilmiştir. Kriyo-ultramikrotomi, kriyo-ET9,10, 11 için uygun 60-80 nm kalınlığında bölümler sağlamak için sıvı azot sıcaklığında(-196°C) bir elmas bıçakla numunenin mekanik dilimletilmesini kullanır. Tek bir hücreden birden fazla bölüm hazırlanabilir ve veri analizi sonunda hücrenin daha büyük kısmı için 3D yapısal bilgiler üretebilir. Bununla birlikte, mekanik dilimleme kavisli bölümler, yarıklar veya numune sıkıştırma gibi çeşitli eserlere neden olabilir, bu da ortaya çıkan yapıyı etkileyebilir ve kriyo-ET verilerini10 , 11,12. Kriyo odaklı iyon ışını mikromakinemi (kriyo-FIBM), 80-300 nm kalınlığında hücresel kesit (lamel) 13,14,15 ile sonuçlanabilen çok adımlı bir işlemde ga+iyonlarının (FIB) odaklanmış bir ışını kullanılarak numunenin kademeli olarak ablasyon edilmesiyle ince bir hücresel kesit hazırlandığı alternatif bir yaklaşımı temsil eder. . Kriyo-ultramikrotomi'nin aksine, hacminin ~ 0.3-3% 'sini temsil eden tek bir hücreden sadece bir lamel hazırlanır ve frezelenmiş kesite ilgi çekici bir bölge bulmak için genellikle birden fazla hücrenin mikromakinesi gereklidir. Buna ek olarak, tüm iş akışının verimi günümüzde hala oldukça düşüktür ve genellikle 8 saatlik bir cryo-FIBM oturumundan 6-8 yüksek kaliteli lamel ile sınırlıdır. Öte yandan, kriyo-FIBM kesitleri herhangi bir sıkıştırma yapıtından yoksundur ve yüksek çözünürlüklü cryo-ET için uygun giriş sağlar. Ayrıca, tüm lamel hazırlama işlemi sırasında numune TEM ızgarası üzerinde tutulduğu ve aynı ızgara daha sonra TEM'e aktarılabildiği için lamellerin kriyo-ET için numune taşıyıcısına aktarılması gerekli değildir. Kriyo-FIBM'nin veriminin, öncelikle denetimsiz lamel frezeleme16 , 17 için yazılımın kullanılabilirliği ve daha hızlı malzeme ablasyonunu sağlayacak şarj çifti plazma prensibiyle çalışan FIB'lerin kullanımından yakında önemli ölçüde iyileştirilmesini bekliyoruz.
Saccharomyces cerevisiae (maya), küresel şekil ve çapı ~2-5 μm olan ökaryotik hücrelerdir. Büyüklüğü, erişilebilirliği, genetiği, üretim süresi ve basit manipülasyonu sayesinde, maya yaygın olarak Escherichia coli'ye benzer hücresel ve moleküler biyoloji araştırmalarında ökaryotik bir model organizma olarak incelenmiştir. Maya süspansiyonda kolayca kültürlenebilir ve kısa sürede yüksek miktarda hücre üretilir (1 - 2 saat iki katına çıkar). Daha da önemlisi, maya, kodlamayan DNA'nın düşük içeriğinden oluşan küçük bir genom tutarken hayvan ve bitki hücreleriyle karmaşık bir iç hücresel yapıyı paylaşır. Maya proteomunun yüksek çözünürlüklü yerinde verilerden yapısal olarak tanımlanması, literatürde bulunan geniş miktarda işlevsel veri için mekanistik bir açıklama sağlamaya yardımcı olabilir.
Burada, numune ekiminden kriyo-FIBM lamel hazırlığına kadar tüm adımları kapsayan maya numunesi üzerinde yerinde cryo-ET verilerinin alınması ve kriyo-ET veri alımı için numunenin TEM'e aktarılması için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>MB053</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>PENTA</td><td>12020-31000</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Merck</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>etan</td><td>Messer</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>LN2</td><td>Lineq</td><td>LN2-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Merck</td><td>P5905-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>suşu BY4741</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Dumont</td><td>T539</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Tek kullanımlık</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kurutma kağıtları</td><td>Ted Pella</td><td>47000-10</td><td></td></tr><tr><td>C-klips</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97551</td><td></td></tr><tr><td>C-klips halkası</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97561</td><td></td></tr><tr><td>Yayma çubukları</td><td>Merck</td><td>Z376779-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Steril aşılama döngüleri</td><td>MARKA</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Steril plastik Petri kapları</td><td>Sigma</td><td>SIAL0166</td><td></td></tr><tr><td>TEM ızgaraları</td><td>Quantifoil</td><td>4420G-XA</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Systec</td><td>101291545</td><td></td></tr><tr><td>terazileri</td><td>BEL</td><td>M124A</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-FIB/SEM mikroskobu</td><td>ThermoScientific</td><td>1006123</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-TEM mikroskobu</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 057 03301</td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış kutusu</td><td>Telstar</td><td>AH5</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Gatan</td><td>955.82001</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama inkübatörü</td><td>New Brunswick</td><td>M1282-0002</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS spektrofotometre</td><td>WPA</td><td>S800</td><td></td></tr><tr><td>Vitrifikasyon robotu</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 053 50621</td><td></td></tr></tbody></table>

kriyo-elektron tomografisi için saccharomyces cerevisiae'nin hazırlanması ve kriyo-fib mikromakinesi

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Bugün, kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), in situ makromoleküler kompleksler üzerinde atom çözünürlüğe yakın yapısal veriler sağlayabilen tek tekniktir. Bir elektronun maddeyle güçlü etkileşimi nedeniyle, yüksek çözünürlüklü kriyo-ET çalışmaları, kriyo-ET'nin sadece bir hücrenin çevre bölgeleriyle uygulanabilirliğini kısıtlayan 200 nm'den daha az kalınlığa sahip örneklerle sınırlıdır. Kriyo odaklı iyon ışını mikromakine (kriyo-FIBM) ile ince hücresel kesitlerin hazırlanmasını içeren karmaşık bir iş akışı, kriyo-ET verilerinin daha büyük hücrelerin iç kısımlarından elde edilmesini sağlamak için son on yıl içinde tanıtıldı. Hücresel ve moleküler biyoloji araştırmalarında geniş kullanımlı ökaryotik bir hücrenin prototipik bir örneği olarak Saccharomyces cerevisiae kullanılarak dalma dondurma ile vitrifiye edilen bir örnekten hücresel lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. S. cerevisiae'nin birkaç hücrenin izole edilmiş yamalarına veya bir TEM ızgarasındaki hücrelerin sürekli monolayerine vitrifikasyonu için protokolleri açıklıyoruz ve bu iki örnek için kriyo-FIB tarafından lamel hazırlanması için bir protokol sağlıyoruz.

Saccharomyces cerevisiae kültürü üstel büyüme evresinin ortasında hasat edildi. Hücrelerin TEM ızgarasının yüzeyi üzerinde birkaç hücrenin küçük kümeleri olarak dağıtıldığı iki tip numune hazırladık (Şekil 1A,C) veya TEM ızgarasının tek tek ızgara kareleri üzerinde sürekli bir monolayer oluşturduk (Şekil 1B,D). Numunenin farklı hücre adacıkları veya hücresel monolayer ile hazırlanması için ayırt edici faktör, TEM ızgarasına uygulanan hücre kültürünün konsantrasyonudur. Hasat edilen hücre kültürü, eski durum için OD600 = 1.0 veya ikinci durum için sırasıyla OD600 = 30 ila 60 arasında yoğunlaşmıştır. Hücresel monolayerin hazırlanması için örnek, vitrifikasyondan önce% 5 v / v gliserol ile daha da desteklenmiştir. Gliserol, hücreler arasındaki boşluğu dolduran tampon çözeltisinin vitrifikasyonu için kritik öneme sahiptir (Şekil 2), kristal tampondan yansımalar kriyo-ET veri toplama sırasında uygun konumsal izleme ve odaklama için zararlı olabilir.
Ek olarak, maya süspansiyon kültürü PTFE şişkinlik pedi veya FlexFill 98A malzemeden yapılmış özel 3D baskılı ped gibi emici olmayan malzemeye karşı şişirildi. Şişirme kağıdı, örnek uygulamaya (geri şişkinlik) göre yalnızca ızgaranın arka tarafına yerleştirilmişti. Her iki taraftan filtre kağıdı ile şişirme hücrelerin şişkin kağıda yapıştırılmasına neden olduğu için süspansiyon kültürü dalma dondurması için arka şişirme stratejisi önerilir (Şekil 1E).
Burada açıklanan protokol, ızgara kartuşuna kırpılmış TEM ızgaralarını kullanır, bu da ızgara için kararlı destek oluşturur ve vitrifikasyondan sonra numunenin numune işlenmesini kolaylaştırır. Bu, FIB/SEM ve TEM mikroskoptaki diğer numune tutucuların ve mekiklerin böyle bir ızgara kartuşunu kabul etme zorunluluğunu zorunlu kılar.
Numunenin FIB/SEM mikroskobuna aktarılması üzerine, numune ilk olarak mikroskop gaz enjeksiyon sistemi (CBS) kullanılarak 0,3–1,0 μm metilsiklopentadienyl platin tabakası ile kaplandı. CBS tabakasını sertleştirmek ve yüzeyi iletken hale getirmek için numune yüzeyine ek bir inorganik iridyum tabakası serpiştirildi. Lamel birden fazla adımda frezelenmiştir (Şekil 3) burada (I) frezeleme akımı, (II) lamel genişliği ve (III) numunelerin üstündeki ve altındaki freze alanının mesafesi adım adım azaltılır. Son frezeleme adımı ("parlatma"), düşük akımda (10-30 pA) sadece lamellerin üst tarafından ve numune Ga+ kirişine doğru ek 1 ° eğimli olarak gerçekleştirildi. Açıklanan protokolün kullanımı ortalama olarak bir 6-8 saatlik seans içinde iki TEM ızgarasında hazırlanan 8-10 lamel ile sonuçlanmıştır.
Lamelli TEM ızgaraları daha sonra bir iletim elektron mikroskobuna aktarıldı. Lamel ilk kez tarandı ve kriyo-ET verilerinin alınması için sadece minimum perdeleme (lamel yüzeyinde düzensiz frezelemeden kaynaklanan eserler), düşük yüzey kirlenme seviyesi ve iyi hücresel kontrast (genellikle &lt;200 nm kalınlığında lamel için gözlenen) gösterenler seçildi. Buna ek olarak, tüm uzunluk boyunca çatlaklar içeren lamel veri toplamadan atıldı. Genel olarak TEM'e aktarılan lamellerin yaklaşık P'si veri toplama için uygundu. Tilt serisi, GIF sonrası K2 doğrudan elektron dedektöründe enerji seçen yarık 20 eV olarak ayarlanmış olarak toplanarak toplanılarak toplanılarak 20 eV olarak belirlenmiştir. Veri toplama SerialEM yazılımı18'de gerçekleştirildi ve eğim serisi, ±60 ° eğim aralığına ve 3 ° artışa sahip bir doz simetrik şeması19 kullanılarak toplandı. Veriler, 3,47 A/px piksel boyutuna karşılık gelen büyütmede elde edildi. 65 e/ş2'nin genel dozu tek tek alt çerçeveler üzerine eşit olarak dağıtıldı. Eğim görüntüleri, daha sonra MotionCor220 programı kullanılarak veri toplama sırasında hareket ve radyasyon hasarı için düzeltilen üç kareden oluşan bir set olarak toplandı. Kontrast aktarım işlevinin parametreleri Ctffind421kullanılarak tahmin edilmiştir. Eğim serisi eTomo18'de işlendi. Görüntüleri hizalamak için düzeltme eki izleme yordamı kullanıldı. Tomogram, görüntülerin 2x binning'inden sonra ağırlıklı bir geri projeksiyon algoritması kullanılarak yeniden inşa edildi ve daha sonra IMOD18'deSIRT benzeri filtre (8 yinelemeye ayarlanmış) kullanılarak filtrelendi. Tomogram segmentasyonu Manuel olarak Amira yazılımı22'de gerçekleştirildi. Yeniden yapılandırılmış tomogramlar maya hücresel iç yüksek çözünürlüklü bir temsil sağlar ve yüksek düzeyde ayrıntı vakuoller veya mitokondri gibi organelleri gözlemlememizi veya mikrotübüller gibi makromoleküler kompleksleri veya nükleer gözenek komplekslerini yerinde ve neredeyse yerel koşullar altında incelememizi sağlar (Şekil 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig1.jpg"> Şekil 1: Vitrifiye S. cerevisiae'nin FIB ve SEM görüntüleri TEM ızgarası üzerinde vitrifiye edilmiş küçük maya kümelerinin FIB (A) ve SEM (C) görüntüleri. FIB (B) ve SEM (D) ızgara yüzeyinde sürekli bir monolayer oluşturan maya görüntüleri. Örnek görüntülemeden önce CBS ve Irridium tabakası ile kaplandı. A-B panellerindeki ölçek çubukları 10 μm'ye karşılık gelir. Maya örneği PTFE veya FlexFill 98A (yeşil) gibi emici olmayan malzemelere karşı ve ızgaranın arka tarafından yerleştirilmiş şişirme kağıdıyla (beyaz, E)şişirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig2.jpg"> Şekil 2: S. cerevisiae lamellae Izgara yüzeyi üzerinde sürekli monolayer maya ile numuneden mikromachined bir lamella TEM görüntüsü. Hücreler arasında gözlenen yansımalar yanlış vitrifiye edilmiş orta/tampon(A, kırmızı dairelerle vurgulanmıştır) içeriyordu. Maya üzerinde üretilen lamel tem görüntüsü, orta/tampona % 5 gliserol ilavesi ile sürekli bir monolayer haline geldi (B). Ölçek çubuğu 2 μm'ye karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig3.jpg"> Şekil 3: Cryo-FIBM iş akışı Lamel frezeleme işleminin şematik tasviri. İlk kaba frezeleme adımları, belirsiz lamel pozisyonunun her iki tarafından yüksek FIB akımlarında (yeşil renkte vurgulanır) gerçekleştirilürken, son parlatma adımı yalnızca üst taraftan ve düşük FIB akımında gerçekleştirilir (turuncu ile vurgulanır, 6:33'te eşlik eden videoya bakın). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig4.jpg"> Şekil 4: Kriyo-ET tarafından tasvir edilen maya organelleri ve makromoleküler kompleksler Tanımlanamayan lifli yapının (siyah ok, siyah ok) yakınında bir vakuol(A, ölçek çubuğu: 200 nm), ribozomlar (B, ölçek çubuğu: 200 nm), peroksizomun parakristal çekirdeğini (C, ölçek çubuğu: 100 nm), mikrotübül (beyaz ok) gösteren yeniden yapılandırılmış tomogramların dilimleri D, ölçek çubuğu: 100 nm), birden fazla mikrotübülün ayrıntıları (E, ölçek çubuğu: 50 nm), oklarla gösterilen gözenekli bir nükleer membran (F, ölçek çubuğu 200nm), mitokondrion(G, H, ölçek çubuğu: 100 nm, oklar bireysel cristae'yi gösterir), tanımlanamayan filamentli yapıların bir demeti (I, ölçek çubuğu: 100 nm). B, C, D, E, G panelleri küçük hücre kümelerinden hazırlanan tomogramların bir bölümünü içerirken, hücrelerin bir monolayerinden lamel üzerinde toplanan tomogramların bölümleri A, F, H, Ipanellerinde gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Bu video kriyo-elektron tomografisi için maya salmonella hazırlanmasına odaklanacak Hücre ekiminden kriyo-elektron tomografisine kadar iş akışından geçeceğiz Saccharomyces cerevisiae süspansiyonda iyon numunesi hazırlanması için yetiştirilir Hücre ekimi için orta seviyeye çıkarılan on mililitre steril mayanın laminar akış kutusunun içindeki steril koşullarda çalışması önerilir Yetiştirme şişesini sterilize etmek için sterilize etmek için yüzde yirmi glikoz eklenir ekim ortamına sahip şişe bir maya kolonisi ekim plakamızdan özenle toplanır ve ekimde hazırlanan büyüme ortamına aktarılır şişe ekimi şişesi daha sonra folyo ile kaplanır ve hücreleri dağıtmak için iyice karıştırılır hücre kültürü inkübatöre yerleştirilir ve üstel faza ulaşana kadar sürekli ajitasyon ile otuz derecede yetiştirilir maya hücre kültürü üstel faza kadar büyür ve hücre fiziksel yoğunluğu ile ölçülür Referans örnek hücre kültürü blanche donmadan önce gliserolün yüzde beşine ek olarak OD1 veya OD30'a karşı metre tutma Elektro-mikroskobik ızgaralar yüzeyi temizlenir ve plazma ızgaraları tarafından hücre süspansiyonu uygulanması için etkinleştirilir karbon tarafına bakan kızdırma boşaltma odasına yerleştirilir ve plazma temizleme prosedürü otuz ila kırk beş saniyeye ayarlanır EM ızgaraları şimdi ve hücre için hazır örnek uygulama EM ızgaralarında maya hücre süspansiyonunun vitrifikasyonu, Vitrobot makinesi kullanılarak sıvı etan içine blanche dondurulması ile yapılır Sıvı etan hazırlanması, hücre süspansiyonlu sıvı nitrojen EM ızgarası ile soğutulmuş bir metal bardakta etan gazının sıvılaştırılması ile gerçekleşir, arka taraftan filtre kağıdı ile şişirilir ve ön karbon taraftan bükülmüş yapışkan olmayan plastik ile Vitrobot odasının içindeki sıcaklık Vitrobot ekranında on sekiz derece ve nem yüzde yüz bekleme süresi, leke süresi ve leke kuvveti de ayarlanır Işıma deşarj ızgarası Vitrobot cımbızları tarafından toplanır ve cihaza monte edilir Üç nokta beş mikrolitre Saccharomyces cerevisiae süspansiyonu Vitrobot iklim odasının içindeki ızgaranın karbon tarafına uygulanır Süspansiyonun ızgara ızgarasının her uygulaması blanche dondurulmadan önce düzgün bir şekilde karıştırılması gerekir. vitrifiye hücreli sıvı etan elektro-mikroskopi ızgaraları sıvı nitrojen koşullarında saklanır veya kriyo SEM mikroskobuna yüklenmek üzere ızgara kartuşuna monte edilir Vitrifiye hücreli ızgara daha sonra hem SEM hem de TEM mikroskoplarına yüklenmeye uygun ızgara kartuşuna sabitlenir C-clip halkası kırpma aletine monte edilir ve sıvı nitrojen ızgarasında soğutulur, ızgara kartuşu karbonuna aşağı bakacak şekilde yerleştirilir ve C-klips halkası numunesi daha sonra özel ızgara kutusuna yerleştirilir Lamila hazırlama için numune çift ışın FIB / SEM mikroskobuna yüklenir ve kriyo-aşama hazırlama odası yükleme kabına sığar düzgün bir şekilde soğutulur ve mekik adı verilen sıvı azot numune tutucusu ile doldurulur ve numuneli ızgara kutusu depolama dewarından tencereye aktarılır ve ızgaralar iki yuvaya yerleştirilir. FIB ızgara kartuşlarının kullanılması durumunda hücreler yukarı bakacak şekilde mekik karbon tarafı, ızgara kartuşunun kesilmesi, mekik ızgaralarında saat on ikiye kadar dikkatlice hizalanmalıdır vida ile sıkılır ve mekik yükleme pozisyonuna aşağı doğru aşağı doğru çevrilir yükleme potu transfer istasyonuna yerleştirilir ve kapakla kaplanır Yükleme kabı ile transfer odası kapağın üstüne yerleştirilir ve ızgaralı düşük vakumlu mekik çubuk üzerine tutturulmuş ve hazırlık odasına toplanan küçük transfer odası odalarının içine kapatılmış ve yüksek vakumlu SEM oda aşamasında kriyo aşamasına mekik yerleştirilir kırk beş dereceye eğilir ve gaz enjeksiyon sistemi iğnesini yerleştiren ızgaranın merkez konumuna dört milimetre hareket ettirilir, odaklanmış sırasında radyasyon hasarına karşı biyolojik numune üzerinde koruyucu organik tabaka oluşturur İyon ışını freze ızgaraları daha sonra hücre kümesinde lamellerin biyolojik malzeme odaklı iyon kiriş frezelemesinde iletken tabaka oluşturmak için inorganik metalin ince örtüsü ile kaplanır veya monolayer birkaç adımda yapılır aşama frezeleme açısına taşınır ilgi alanı bulunur ve üst ve alt frezeleme desenleri oluşturulur kaba lamel fib akımının kademeli olarak azalması ve lamel kalınlığı ile öğütülür lamellerin son parlatılması lamel yüzey elektron kirişi üzerinde ön uç hasarını ve perdeleme etkisini önlemek için sadece üst desen ve düşük FIB akımı ile gerçekleştirilir, buradaki frezeleme işlemi sırasındaki ilerlemeyi gösterir Son cilalı lamel son kalınlığının, elektron ışınının iletilmesi için şeffaf olması için iki yüz elli nanometreden az olması gerekir Hücre kümesinde öğütülmüş lamel ve monolayer çizimi artıları ve eksileri ile lamali ile her iki numune tipi ızgaralar çok nazikçe hazırlık odasından yükleme potasına geri aktarılır ve öğütülmüş lamali ızgaralarının buz kirlenmesini önlemek için taze ve temiz sıvı azotla doldurulur ve değirmenli lamali ile ızgara kutusu örneğine geri döndürülür, son olarak TEM otomatik doldurucu kasetine takılmadan önce doksan derece döndürülmesi gerekir. LAMELLA'nın TEM eğim erişimine uygun şekilde yönlendirilmesini sağlamak için Lamili taranır ve kriyo-elektron tomografik verilerin eldei için ilgi alanı lokalize edilir Lamella ana ekseni mikroskobun eğim eksenine diktir doğru görüş alanını yüksek eğim açılarında görmek için dozimetrik yöntem kullanılır toplanan tomogram verileri toplamak için kullanılır daha sonra Etomo yazılımında işlenir ve Amira'da monolayer segmenter yazılım Bu protokolde kriyo odaklı iyon ışını frezeleme kullanarak bir lamel mikro makine için bir maya hücresi örneğinin verimli bir şekilde nasıl hazırlanacağını ve elektron tomografi verilerinin ve hücre lamalinin nasıl hazırlanacağını ve işlendiğini gösterdik.

preparation-cryo-fib-micromachining-saccharomyces-cerevisiae-for-cryo

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Bu makale, makromoleküllerin doğala yakın durumlarında yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerini elde etmek için kullanılan kriyo-elektron mikroskobu metodolojisini açıklamaktadır. Yöntem, bir makromolekülün 3D rekonstrüksiyonunu oluşturmak için tasarlanan tek parçacık yaklaşımını kullanarak daha fazla bilgisayarlı işleme için uygun görüntüler verir.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Kriyojenik elektron tomografisinde büyük ölçekli veri toplama için artan talep, yüksek verimli görüntü alma rutinleri gerektirir. Burada açıklanan, tomografik veri toplamanın zaman verimliliğini ve verimini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan gelişmiş satın alma stratejilerinin son gelişmelerini uygulayan bir protokoldür.

Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Burada, kriyo-elektron tomografisi için hücresel numunelerin hazırlanmasına rehberlik etmek için 3D bağıntılı odaklanmış iyon ışını frezeleme için bir boru hattı sunuyoruz. İlgilenilen floresan etiketli proteinlerin 3 boyutlu konumu önce kriyo-floresan mikroskobu ile belirlenir ve daha sonra öğütme için hedeflenir. Protokol memeli, maya ve bakteri hücreleri için uygundur.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Bu protokolün amacı, hücre yapıştırma ve büyümesini kriyo-elektron mikroskopisi için hedeflenen ızgara alanlarına yönlendirmektir. Bu, kullanıcı tarafından belirtilen desenlerde ablated bir anti-kirlenme tabakasının uygulanması ve ardından hücre tohumlamadan önce desenli alanlarda hücre dışı matris proteinlerinin birikmesi ile elde edilir.

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Grafen oksit pencereli yeni geliştirilen mikro desenli çip, mikroelektromekanik sistem teknikleri uygulanarak üretilir ve çeşitli biyomoleküllerin ve nanomalzemelerin verimli ve yüksek verimli kriyojenik elektron mikroskopisi görüntülemesini sağlar.

Yüksek Verimli Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Kontrollü Kalınlığa Sahip Mikro Desenli Çip İmalatı

Bu yöntem, in situ hücresel kriyotomografi ve korelasyon ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için elektron mikroskobu (EM) ızgaralarının hazırlanması için erişilebilir ve esnek bir protokol sağlar.

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae örneklerini kriyo-elektron tomografi için kriyo-FIB mikromakine ile hazırlama yöntemini. Bu protokol, hücre iç yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Daha fazla video keşfet