Hücre İzleme Kullanılarak Oral Aparat Rejenerasyonu Sırasında ve Sonrasında Stentor Motilite Paternlerinin Analizi

Stentor coeruleus uzun zamandır tek hücreli rejenerasyonu anlamak için model bir organizma olarak kullanılmaktadır. Görsel morfolojik rejenerasyon için zaman çizelgesi bilinmekle birlikte, fonksiyonel rejenerasyon için zaman çizelgesi bilinmemektedir. Bu tahlil, senkronize rejenerasyona uğrayan merkez popülasyonun hareketliliğini izler, böylece kayıp fonksiyonunun geri kazanımı ölçülebilir.

Diğer hücre tipleriyle kullanım için uyarlanabilir. Görüntüleme odasının güvenli bir sızdırmazlığının olmaması, kuyuların birbirine sızmasına veya kuyuların içinde hava kabarcıklarının oluşmasına neden olacaktır. Silikon ara parçaların kullanımına aşina olmayan araştırmacılar için, kullanımdan önce sızıntıyı test etmek için PSW veya diğer temiz ortamların kuyucukların her birine pipetlenmesini şiddetle tavsiye ederiz.

Örnek odaların yapısı sözlü olarak tarif edilenden daha kolay gösterilir. Elde edilen video verilerinden hareketlilik kalıplarını çıkarma işlemi gibi. Başlamak için, 250 mikrometre kalınlığında silikon ara parça levhadan bir mikroskop slaytından hem yükseklik hem de genişlikte biraz daha küçük bir parça kesin.

İyi bir sızdırmazlık sağlamak için komşu kuyular arasında yeterli boşluk bırakan dairesel kuyular oluşturmak için bütün bir zımba kullanın. İki dakika boyunca% 10 sakkaroz veya% 2 üride stent coeruleus hücrelerini inkübe ederek oral aparatın rejenerasyonunu başlatın. Daha sonra taze ortamla üç kez yıkayın.

Her bir oyuğa yaklaşık 10 stentor hafifçe pipet yerleştirin. Numune hacmini kuyu hacmine mümkün olduğunca yakın eşleştirmeye özen göstermek. Bir kenardan başlayarak bir kapak camı parçasını kuyucukların üzerine yavaşça indirerek kuyuları kapatın.

İyi bir sızdırmazlık sağlamak için silikon tabakaya temas ettiği kapak camına bastırmak için 10 mikrolitrelik pipet ucu gibi dar ve hafif esnek bir nesne kullanın. Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin ve mikroskopu çerçeveye iyi oturacak şekilde mevcut en düşük büyütmeye ayarlayın. Zaman atlamaya başlayın ve her zaman noktasında her kuyucuğun saniyede 30 karesinde on saniyelik bir video elde edin.

Kalibre etmek için, videolarla aynı büyütme ayarlarında kalibrasyon slaytının veya net bir cetvelin net bir görüntüsünü elde edin. Herhangi bir görüntü görüntüleme programını kullanarak, bilinen bir fiziksel mesafenin işaretleri arasındaki piksel sayısını sayın. İki komut dosyasını indirin, hücreleri izleyin ve izleri bilgisayarda hatırlanması kolay bir konuma temizleyin ve veri videolarını da bu bilgisayara aktarın.

Veri videolarını klasörler halinde düzenleyin. Her zaman noktası için bir tane. İzleme hücrelerini açıp "Yola ekle seç" komut dosyasını çalıştırarak, genellikle yalnızca komut dosyası belirli bir klasörden ilk kez çalıştırıldığında gerçekleşecek bir açılır pencere tarafından istenirse, veri videolarında otomatik hücre izleme gerçekleştirmek için komut dosyası izleme hücrelerini kullanın.

İstendiğinde, izlemeyi başlatmak için bir veya daha fazla veri videosu seçin. Veri videolarına gidin ve dosya listesinden memnun kaldıktan sonra aç"Anormal veya yanlış izleri manuel olarak reddetmek için, dosyaya çift tıklayarak MATLAB düzenleyici penceresinde temiz izlemeleri açın. İstendiğinde, hücreleri izleyerek veri klasörü çıktısını seçin.

Oluşturulan klasörlerden birine gidin ve seçin. İstendiğinde, izlemeyi tutmak için bir tane ve izlemeyi reddetmek için sıfır girin. Ardından bir sonraki izlemeye geçmek için enter tuşuna basın.

Spagetti plots adlı senaryoyu indirerek başlayın. Komut dosyasını açın ve çalıştırın. Dosya tarayıcı penceresi istemle birlikte açıldığında, açılacak klasörü seçin.

Zaman noktalarından birinin klasörüne gidin. İstendiğinde, kalibrasyon, milimetre başına piksel sayısı nedir? Kalibrasyon değerini yazın ve enter tuşuna basın.

Varsayılan olarak RR dörde eşittir olarak ayarlanan komut dosyasının 55. satırını değiştirerek grafiğin eksenlerini gerektiği gibi ayarlayın. dört milimetreye kadar bir yarıçap eklemek için. Grafiği kaydedin.

Sonuçlar, stentor hücre popülasyonunun kolektif hareketliliğini oral aparat rejenerasyon sürecine iki, üç, yedi ve sekiz saatte göstermektedir. Bu grafikler hem hareketli bireylerin sayısında beklenen artışı hem de popülasyondaki en hareketli hücrelerin aralığındaki dört kat artışı göstermektedir. En hızlı yüzme hücreleri, kenara yakın bir yerde başlatılırsa, tamamen düz bir çizgide yüzmekten kısıtlanır ve hareket aralıkları daha küçük görünür.

Trakt hücreleri üç ayrı kategoriye ayrıldı: görünür tutma hızlı olmayan hareketli olmayan, görünür tutma hızlı olan hareketli olmayan ve hareketli. Sonuç, bu kategorilerdeki göreceli hücre sayılarını rejenerasyona bir fonksiyonumuz olarak özetleyen yığılmış bir histogram gösterdi. Daha sonraki zamanlarda, görünür tutma oruçlarına sahip kolonilerde, çevreyi araştırdıklarını ve tercihen kendi türlerinden başkalarının yanına bağlandıklarını güçlü bir şekilde düşündüren önemli sayıda hücre bulundu.

Yaklaşık bir milimetre büyüklüğünde olan stentor coeruleus için iyi çalışan numune kuyusu boyutlarının seçilmesi önemlidir. Bu, 5/16 inç çapında silikon ara parça kalınlığını ve kuyu başına 10 hücreyi içerir. Bu protokol diğer hücre tipleri için uyarlanırken bu sayılar ayarlanmalıdır.

Bu tahlil, farklı stent fenotiplerinin rejenerasyonunu araştırmak ve karşılaştırmak için RNA-I ile birlikte yapılabilir.