Name: μTongue: Dil In Vivo için Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Öğrenin, µTongue mikroakışkan sistemi ile canlı farede tat hücrelerinin fonksiyonel görüntülemesini. Bu yöntem, tat hücreleri arası iletişimi doğal fizyolojik koşullarda incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi olan Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R015-D1) tarafından desteklenmiştir (Hayır. 2019M3A9E2061789) ve Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi (No. 2019M3E5D2A01058329). Eunsoo Kim ve Eugene Lee'ye teknik yardımları için minnettarız.

Tüm cerrahi prosedürler Sungkyunkwan Üniversitesi ve Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Çözümlerin hazırlanması: yapay tükürük ve şok tabancaları
<ol><li>2 mM NaCl, 5 mM KCl çözünerek yapay tükürük hazırlayın, 3 mM NaHCO3,3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2,0,12 mM K2HPO4, damıtılmış suda 0,12 mM KH2PO4ve 1,8 mM HCl (>1 L) ve çözeltinin pH'ını 7 olarak ayarlayın(bkz. Malzeme Tablosu )12.</li>
	<li>Ekşi: 10 mM sitrik asit gibi uyarıcılar hazırlayın; tuzlu: 400 mM NaCl, isteğe bağlı olarak 50 μM amilorid ile; tatlı: 40 mM asasulfame K; acı: 1.1 adımında hazırlanan yapay tükürükteki tatma kimyasalını eriterek 5 mM kinin, 5 mM denatonyum ve 20 μM sikloeximid karışımı.</li>
</ol>2. Mikroakışkan sistemin hazırlanması
NOT: Şok tabancaları basınçlı çok kanallı akışkan bir dağıtım sistemi kullanılarak fare diline teslim edilmiştir (şekil 1 ve malzeme tablosunabakın).
<ol><li>Basınçlı akış perfüzyon sisteminin rezervuarlarını yapay tükürük ve şok tabancaları ile doldurun.</li>
	<li>Basınçlı hava hattını regülatör girişine bağlayın ve akışkan teslimat sisteminde hava basıncını 30 ila 50 psi arasında ayarlayın.</li>
	<li>Regülatörün çıkış basıncını 0,4 psi olarak ayarlayın ve bu basınç altında tüpten sıvı çıkıp çıkmamasını kontrol edin.</li>
	<li>Manifoldu rezervuarlardan μTongue giriş limanına bağlayın.</li>
	<li>μTongue çıkış portu bir şırıng pompasına bağlayın ve sabit durum durumunu belirlemek için sıvıyı ~300 μL⭐min-1 ile çekin. μTongue altında asılı bir damlacık sabit hacmini gözlemleyin. Örnek yüksekliğe bağlı olarak ayar parametresinin değerini ayarlayın.</li>
	<li>Basınçlı hava hattını çıkarın ve protokol 3 tamamlanana kadar şırınna pompasını durdurun.</li>
</ol>3. In vivo görüntüleme için fare hazırlığı(Şekil 2).
NOT: Tüm hayvan preparatları gündüzleri bir laboratuvar tezgahında aseptik koşullar altında gerçekleştirildi.
<ol><li>Fare anestezisi<ol>
<li>Her iki cinsiyette de 7 haftalık veya daha yaşlı bir fare hazırlayın. Tat hücrelerinde kalsiyum algılayan floresan proteinleri ifade eden genetiği değiştirilmiş bir fare hattı kullanın.</li>
		<li>Fare anestezi için kısıtlanmıştır. Fareye intraperitoneally olarak 100 mg/ kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin karışımı enjekte edilir13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>%2,5 W/V fosfat tampon salinindeki TRITC-dektran (500 kDa), görüntüleme seansı sırasında kan dolaşımını gözlemlemek için retro yörüngeli bir rota üzerinden fareye intravenöz olarak iletilir.</li>
	<li>Hareket yapıtlarını en aza indirmek için fare kafatasına bir kafa düzeltici takın.<ol>
<li>Fare başı% 70 ETOH ile püskürtülürken, fare bir destek konumuna yerleştirilir. Kafa derisini sertps ile hafifçe kaldırın ve makasla yaklaşık 7 mm2 kesin.</li>
		<li>Saç derisinin etrafındaki saçları temizleyin, cildin altındaki periosteumu çıkarın, kafatasına anında bir yapıştırıcı uygulayın ve özelleştirilmiş bir kafa düzeltici takın.</li>
		<li>Anında yapıştırıcı sertleştikten sonra, baş düzelticinin etrafına diş yapıştırıcısı uygulayın ve diş tutkalını katılaştırmak için mavi bir ışıkla aydınlatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare dilini μTongue'un alt birimine yerleştirin.<ol>
<li>Farenin alt dudağını anında yapıştırıcı ile μTongue'un alt ünitesine takın.</li>
		<li>Fareyi tahtaya yerleştirin (Şekil 1B'dekifare hazırlama tahtası) ve μTongue'un alt birimini direklere yerleştirin (Şekil 1B'deμTongue tutma direği). Alt ünitenin kenarındaki deliklerin direğe hizalı olduğundan emin olun.</li>
		<li>Fare kafası düzelticisini tahtadaki kafa düzeltici tutucusuna sıkın. Ardından, fare kafası ile cihaz arasındaki mesafeyi ayarlayın. Kafa sabitleyici tutucuyu kullanarak fare kafasını yaklaşık 45° düzgün bir şekilde döndürün. Bu işlem mikroskop hedefi ile fare burnunun fiziksel temasını önler.</li>
		<li>Fare dilini plastik cımbız kullanarak hafifçe çizin ve dilin ventral tarafını μTongue'un alt ünitesinin üst tarafına takın. Ardından, fare dilinin yüzeyini ıslak bir pamuklu çubukla silin.</li>
		<li>Bir kağıt parçasını yapay tükürükte bekletin ve ıslak bir durumu korumak için fare dilinin açık yüzeyine yerleştirin.</li>
		<li>Kavisli pulları μTongue'un alt kısmının her iki ucunun her iki ucunun da yer tutan direklere yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare hazırlığını mikroskop aşamasına yerleştirin. Açıkta kalan fare dilini mikroskop nesnel alanının yaklaşık merkezinin altına yerleştirin. Sahnenin dinamik aralığından sapmamaya dikkat edin. Ardından, sahnedeki fare tahtasını vidalarla sıkın.</li>
	<li>Isıtma yastığını fare gövdesinin altına yerleştirin ve sıcaklığı 36,5 °C-37,5 °C'de koruyun. Fare gövdesi sıcaklığını bir sıcaklık sensörü ile izleyin ve sıcaklık sensöründen gelen geri bildirim sinyalini kullanarak ısıtma yastığının sıcaklığını kontrol edin.</li>
	<li>İnce bir kağıt parçasını çevirin ve sıvının fare nefes borusuna girmesini önlemek için farenin ağzına yerleştirin.</li>
	<li>Islak dokuyu fare dilinden çıkarın ve hazırlanan μTongue'u fare diline yerleştirin. Dilin üzerine mikroakışkan bir kanal yerleştirin ve görüntüleme penceresinden dilin yüzeyini gözlemleyecek şekilde konumunu ayarlayın.</li>
	<li>μTongue'yi her iki ucu da minimum basınç basıncıyla hafifçe vidalayarak sabitleyin.</li>
</ol>4. Görüntüleme kazanımı
<ol><li>920 nm iki foton lazeri ve mikroskobu kullanımdan önce açın.</li>
	<li>Suya daldırma hedefini (16x, NA 0.80 veya 25x, NA 1.1) mikroskop üzerine monte edin. Damıtılmış suyu μTongue'un görüntüleme penceresine bırakın ve hedefi daldırın.</li>
	<li>Kamera modunda, cıva lambasını kullanarak ışığı açın ve dilin yüzeyini aydınlatın.</li>
	<li>Z eksenini ayarlayarak, yaklaşık odak düzlemini bulmak için filiform papilladan gelen otofluoresan sinyali arayın. Ardından, X ve Y ayar düğmesini kullanarak bir tat alma tomurcuk bulun.</li>
	<li>Çokoton moduna geçin. Görüntü alma koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: heyecan dalga boyu: 920 nm; emisyon filtre seti: 447/60 nm, 525/50 nm ve 607/70 nm; çift yönlü raster tarama modu, çerçeve boyutu: 512 x 512.</li>
	<li>Tat alma tomurcuklarını görüntü penceresinin ortasına yerleştirmek için X ve Y konumlarını ayarlayın.</li>
	<li>Tat alma tomurcukunun yaklaşık üçte iki yüksekliğinde tat tomurcukunu çevreleyen kan damarlarını arayın. Protokol adım 3.2'den TRITC-dektran (500 kDa) enjeksiyonu ile kan dolaşımını görselleştirin. Kan akışı tıkanırsa, kan akışını sağlamak için sabitleme vidalarını hafifçe gevşetin.</li>
	<li>Z eksenini ayarlayın ve yeterli sayıda tat hücresi içeren tat tomurcuklarının Z düzlemini bulun.</li>
	<li>80 s için 2-6 Hz ile kalsiyum görüntülemeye devam edin. Görüntüleme başladıktan sonra akışkan sistemin rezervuarını açarak 20 s'lik bir tat çözeltisi sağlayın. 20 s tat stimülasyonundan sonra rezervuarı tekrar yapay tükürük sınayın.</li>
	<li>Sıralı görüntüleme bittikten sonra, bir sonraki görüntüleme seansına kadar yaklaşık 3-4 dakika bekleyin. Yapay tükürüğün fare diline akmasını ve önceki görüntüleme seansındaki gergin remanent'i temizlemesini tutun. Denemenin tasarımına bağlı olarak, oturumu gerektiği gibi tekrarlayın.</li>
	<li>In vivo kalsiyum görüntüleme tamamlandığında, fareyi IACUC prosedürüne göre ötenazi edin. Anestezi altındaki fare CO2 odasında feda edilir. NOT: Bir parmak sıkışma refleksi kullanarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Bir görüntüleme seansı sırasında, rezervuarlardan yapay tükürük sürekli olarak sağlanmalıdır. Kabarcıklar μTongue görüntüleme penceresinde görünürse, kabarcıkları güçlü sıvı basıncı kullanarak μTongue'un girişine veya çıkışına iterek çıkarın.</li>
</ol>5. Görüntü analizi (Şekil 3)
<ol><li>Resim dönüştürme<ol>
<li>Fiji14 veya benzer bir görüntü analiz yazılımı kullanarak ham görüntü dosyalarını açın.</li>
		<li>NPL Bud Analyzer kodunu kullanmak için görüntü dosyasını RGB yığın dosyasına dönüştürün.<ol>
<li>Görüntü > Renk > Bölünmüş Kanallar</li>
			<li>
Görüntü > Renk > Kanalları Birleştirin ve 5.2.1 adımından görüntüyü seçin.</li>
			<li>Görüntü > Renk > Yığını RGB'ye</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resim kaydı NOT: Veri analizi için özel yazılmış kodu kullanın. Lütfen https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer bakın.<ol>
<li>Taste_GUI.madlı kodu çalıştırın; NPL Bud Analyzer adlı bir GUI penceresi açılır. Sağ üst köşedeki Yeni Analiz düğmesine tıklayın, ardından dönüştürülen görüntüyü adım 5.1'den yükleyin. Kare hızını yüklenen görüntünün üzerine ayarlayın.</li>
		<li>Kayıt için yüklenen görüntünün üzerine ilgi çekici bölgeyi (YG) çizin. Seçilen yatırım getirisini çift tıklayıp otomatik olarak hesaplanan bir kayıt başlayacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Göreli floresan yoğunluğu değişikliklerini elde edin (ΔF/F)<ol>
<li>5.2 adımındaki kayıtlı görüntüyü otomatik olarak göstermek için NPL Tomurcuk Çözümleyicisi penceresine geri dönün. Kullanıcının zaten bir reg dosyası varsa, Veri Yükle düğmesini tıklatın ve _reg.tif dosyasını seçin.</li>
		<li>CIRCLE veya POLYGON düğmesine tıklayın ve tat hücresinin yatırım getirisini tat alma tomurcuk görüntüsünün üzerine getirin.</li>
		<li>Bu, seçilen tat hücresinin ham floresan yoğunluğunu ve kalsiyum izini (ΔF/F)tat alma tomurcuk görüntüsünün altında otomatik olarak sunar.</li>
		<li>GUI'nin sağ tarafındaki kalsiyum izini (ΔF/F)sunmak için İzlemeyi Kaydet'e tıklayın, ancak yatırım getirisi tat alma tomurcuk görüntüsü üzerinde gösterilir. Yatırım getirisi seçimi tamamlanana kadar 5.3.2-5.3.4 adımlarını yineleyin. NOT: Son seçilen yatırım getirisi ve kalsiyum izlemesini ortadan kaldırmak için yatırım getirisi yanlış seçilmişse İzlemeyi Sil düğmesine tıklayın.</li>
		<li>Yatırım getirisi seçimi tamamlandıktan sonra, sağ alt köşeye dosya adını yazın ve ΔF/F kalsiyum izini .xls bir biçim olarak dışa ve PPI'lı şok tomurcuk görüntüsünü .bmp bir biçimde dışa aktarmak için Son düğmesine tıklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalsiyum izinin analizi<ol>
<li>Adım 5.3'ten elde edilen kalsiyum izini analiz edin. Tat hücrelerinin, floresan 4 teslim edildikten sonra floresan yoğunluğu taban çizgisinin ikiden fazla standart sapması arttığında p -değerlerinineşleştirilmişveya eşleşmemiş t-testleri10 kullanılarak 0,01'den az olduğunda şok tabancasına tepki verdiğini düşünün.</li>
		<li>Tat hücresini bir yanıtlayıcı hücre olarak düşünün, eğer üç denemeden iki kereden fazla bir tastant yanıt veriyorsa (~%60)15.</li>
		<li>Adım 5.4.1'den elde edilen bireysel kalsiyum izlerini ortalama alarak temsili kalsiyum izlerini elde edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+microscopy%3A+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li>
<li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Ca2%2B+imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li>
<li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li>
<li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li>
<li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li>
<li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+salt+recruits+aversive+taste+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li>
<li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li>
<li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+anion+in+salt+%28NaCl%29+detection+by+mouse+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li>
<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları beyan ediyor: J. Han ve M. Choi, bu makalede açıklanan patentli μTongue teknolojisinin mucitleridir ve μTongue sistemi SciTech Kore aracılığıyla ticari olarak mevcuttur.

Burada açıklanan, vivo tat hücrelerinin fonksiyonel faaliyetlerinin araştırılmasına μTongue uygulamak için ayrıntılı bir protokoldür. Bu protokolde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanılarak tat hücreleri üzerinde fonksiyonel görüntüleme yapılmaktadır. Transgenik farelerin kullanımına ek olarak, kalsiyum boyalarının (veya voltaj algılama boyalarının) tat hücrelerine elektroforetik olarak yüklenmesi alternatif bir seçenek olabilir.
Bu deneyde kırılma indisinin 1.336'sı...

Intravital floresan mikroskop, canlı dokular üzerindeki mekansal dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Araştırmacılar, biyolojik süreçlerin floresan sinyallerine belirli ve hassas dönüşümlerini sağlayan genetik olarak kodlanmış sensörler geliştiriyorlar - bu sensörler yaygın olarak bulunan floresan mikroskoplar kullanılarak kolayca kaydedilebilir1,2. Kemirgenlerdeki çoğu iç organ mikroskop kullanılarak araştırılmış olsa da, dile başarılı uygulaması henüz başarılı olmamıştır3.
Tat hücrelerinin kalsiyum görüntülemesi üzerine daha önceki çalışmalar, sirkülasyon tat tomurcukları 4,5,6elde etmek için bir dil dokusunu ince bölümlere ayırarak veya mantar formu tat tomurcukları elde etmek için tat epitelini soyarak ex vivo yapıldı7,8. Bu örneklerin hazırlanması kaçınılmaz olarak invazivdi, bu nedenle sinirlerin innervasyonu, geçirgenlik bariyerleri ve kan dolaşımı gibi doğal mikroçevreler büyük ölçüde pertüre edildi. İlk intravital dil görüntüleme penceresi 2015 yılında Choi ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir, ancak akışkan tastant uyaranların neden olduğu hareket ve optik eserler nedeniyle güvenilir fonksiyonel kayıt elde edilemedi9.
Son zamanlarda, mikroakışkanlar-on-a-language (μTongue)tanıtıldı 10. Bu cihaz, fare dilinde bir görüntüleme penceresi ile mikroakışkan bir sistemi entegre eder. Görüntüleme süresi boyunca sabit bir uyarıcı uyaran akışı elde edilerek, akışkan hareketten elde edilen eserler en aza indirilebilir (Şekil 1). Giriş porti bir dizi çok kanallı basınç kontrolörü tarafından beslenirken, çıkış bağlantı noktası 0,3 mL/ dk tutan bir şırınna pompasına bağlanır. Ek olarak, şok çözeltilerinin kırılma indekslerindeki farklılık nedeniyle oluşan optik eserler, kalsiyuma duyarsız bir gösterge (tdTomato) ve kalsiyum göstergesi (GCaMP6)11.'yitanıtan oranmetrik analiz ile en aza indirilmiştir. Bu tasarım, akışkan kanallar arasında ani geçişle bile tat hücrelerinin vivo mikroskobik stabilitesini sağladı. Sonuç olarak, μTongue, vivo fare tat tomurcuklarına birden fazla şok tabancasının güvenilir bir fonksiyonel taramasını uygular.
Bu protokolde, μTongue kullanılarak in vivo fare mantar formu tat tomurcuklarının kalsiyum görüntülemesi için deneysel prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İlk olarak, yapay tükürük ve lezzetli çözeltilerin hazırlanması açıklanmaktadır. İkinci olarak, yarı sabit durum akışını sağlamak için mikroakışkan sistemin kurulmasına geçilir. Üçüncü olarak, görüntü alımına izin vermek için fare dilini μTongue'a monte etmek için kullanılan prosedürler tanımlanmıştır. Son olarak, yanal hareket yapıtlarının ve oranmetrisinin düzeltilmesi de dahil olmak üzere görüntü analizi için her adım belirtilir. Bu protokol, bir fare tesisi ve iki foton mikroskobu veya eşdeğer bir ekipman ile herhangi bir araştırma laboratuvarına kolayca uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>asesülfam K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04054-25G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>kalsiyum klorür çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>sitrik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-100G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>sikloheksimid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01810-5G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>denatonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5765-5G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>Diş yapıştırıcısı</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>Hayvan hazırlama</td></tr><tr><td>Resim J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>Veri analizi</td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>Anında yapıştırıcı</td><td>Loctite Loctite</td><td>4161, Henkel</td><td>Hayvan hazırlama</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Yuhan</td><td>Ketamin 50</td><td>Hayvan hazırlama</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>Veri analizi</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>MPG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>Mutiphoton mikroskobu</td><td>Thorlab</td><td>&nbsp; Bergamo II</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>Objektif</td><td>Nikon</td><td>N16XLWD-PF</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Octaflow</td><td>ALA Bilimsel Aletler</td><td>OCTAFLOW II</td><td>Akışkan kontrol</td></tr><tr><td>PC</td><td>LG</td><td>Lg15N54</td><td>Akışkan kontrolü</td></tr><tr><td>PH metre</td><td>Termobilimsel</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806562</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>kinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Q1125-5G</td><td>Yapay tükürük / tastant</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Havard Aparatı</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>Akışkan kontrolü</td></tr><tr><td>TRITC-dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>Hayvan hazırlama</td></tr><tr><td>Ultra hızlı fiber lazer</td><td>Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Bayer Kore</td><td>Rompun</td><td>Hayvan hazırlama</td></tr></tbody></table>

μtongue: dil in vivo için mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

İntravital floresan mikroskopi, canlı bir hayvanda çok hücreli dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Ancak tat duyusal organda başarıyla kullanılmamıştır. μTongue, mikroakışkanları intravital dil görüntüleme penceresine entegre ederek, birden fazla şok tabancasına kontrollü maruz kalma altında vivo tat hücrelerinin güvenilir fonksiyonel görüntülerini sağlar. Bu yazıda, μTongue sistemini kullanmak için ayrıntılı bir adım adım prosedür sunulmuştur. Beş alt kategori vardır: lezzetli çözümlerin hazırlanması, mikroakışkan bir modülün kurulması, numune montajı, işlevsel görüntü verilerinin alınması ve veri analizi. μTongue kullanırken ortaya çıkabilecek pratik sorunları çözmek için bazı ipuçları ve teknikler de sunulmaktadır.

Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresi tat alma tokası görüntüsü elde etmek için kullanıldı. Fare dilinin yüzeyi otofluoresan filiform papilla ile kaplıydı. Tat tomurcukları dilin yüzeyine seyrek olarak yayılır (Şekil 4A). Tat alma tomurcukunun ve yapısının görüntüleri üç farklı filtre dedektörü kullanılarak elde edildi. 607/70 nm filtre seti kullanılarak, oranmetrik analiz için tat hücrelerinden tdTomato sinyali elde edildi (Şekil 4B). 525/50 nm filtre seti kullanılarak,...

Makale, mikroakışkanları dildeki bir intravital görüntüleme penceresine entegre ederek fonksiyonel tat hücresi görüntüleme in vivo için μTongue (dil üzerinde mikroakışkanlar) cihazını tanıtmaktadır.

μTongue: Dil In Vivo için Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Bu protokol, sinirsel bağlantılar ve kan dolaşımı bozulmadan kalan doğal bir mikroçevrimde tat hücrelerinin işlevlerini gözlemlemeye izin verir. Bu teknik kullanılarak hücreden hücreye iletişim in vivo olarak araştırılabilir. Başlamak için, basınçlı akış perfüzyon sisteminin rezervuarlarını yapay tükürük ve şok tabancaları ile doldurun.Basınçlı hava hattını regülatör girişine bağlayın ve akışkan dağıtım sistemindeki hava basıncını inç kare başına 30 ila 50 pounda ayarlayın. Regülatörün çıkış basıncını inç kare başına 0,4 pound olarak ayarlayın ve sıvının tüpten akmaya başlayıp başlamay olduğunu kontrol edin. Manifoldu rezervuarlardan mikro dilin giriş portuna bağlayın, ardından mikro dilin çıkış portu bir şırınga pompasına bağlayın ve sabit bir durum durumu oluşturmak için sıvıyı dakikada yaklaşık 300 mikrolitrede çekin.Mikro dilin altında asılı damlacığın hacminin sabit kaldığını onaylayın ve istenen numune yüksekliğini elde etmek için hava basıncını ve akış hızını ayarlayın. Mikroakışkan sistem kurulduktan sonra basınçlı hava hattını çıkarın ve fare in vivo görüntüleme için hazırlanana kadar şırınga pompasını kapatın. Fareye anestezi uyguladıktan sonra, görüntüleme sırasında kan dolaşımını gözlemlemek için TRITC-dektranı retro yörüngesel bir yoldan intravenöz olarak enjekte edin.Fare geri zeka pozisyonuna yerleştirilmişken, kafasına% 70 etanol püskürtün. Baş derisini hafifçe kaldırmak için tokmaklar kullanın, ardından yaklaşık yedi milimetre kare deriyi kesmek için makas kullanın. Saç derisinin etrafındaki saçları temizledikten sonra, periosteumu cildin altından çıkarın ve kafatasına anında bir yapıştırıcı uygulayın.Ardından özelleştirilmiş kafa düzelticiyi takın. Anında yapıştırıcı sertleştikten sonra, baş düzelticinin etrafına diş yapıştırıcısı uygulayın ve mavi ışıkla aydınlatarak katılaştırın. Farenin alt dudağını mikro dilin alt birimine yapıştırmak için anında yapıştırıcı kullanarak fareyi fare hazırlama tahtasına yerleştirin ve mikro dilin kenarındaki delikleri direklerle hizalayarak mikro dildeki alt üniteyi tutma noktalarına sabitleyin.Fare kafası düzelticisini tahtadaki kafa düzeltici tutucusuna sıkın ve fare kafası ile cihaz arasındaki mesafeyi ayarlayın. Ardından, kafa düzeltici tutucuyu kullanarak fare kafasını yaklaşık 45 derece döndürün. Fareyi tahtaya sabitledikten sonra, dilini nazikçe çizmek için plastik cımbız kullanın.Daha sonra anında yapıştırıcı kullanarak, dilin ventral tarafını mikro dilin alt ünitesinin üst tarafına takın. Dili nemli tutmak için, yüzeyi ıslak bir pamuklu çubukla silin, ardından dilin açık yüzeyine suni tükürük içine batırılmış bir doku parçası yerleştirin. Kavisli pulları mikro dilin alt kısmını tutarak direklere yerleştirin, ardından fare hazırlığını mikroskop aşamasına getirin.Farenin açık dilini mikroskop nesnel alanının yaklaşık merkezinin altına yerleştirin, aşamanın dinamik aralığından sapmamaya dikkat edin, ardından fare tahtasını sahneye sıkıca takmak için vidaları sıkın. Vücut sıcaklığını 36,5 ila 37,5 santigrat derece arasında korumak için farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Sıvının fare nefes borusuna girmesini önlemek için, farenin ağzının içine ince bir bükülmüş kağıt parçası yerleştirin, ardından dilin yüzeyine yerleştirilen ıslak dokuyu çıkarın ve hazırlanan mikro dili, dilin yüzeyinin görüntüleme penceresinden görülebilecek şekilde fare diline yerleştirin.Her iki ucını da minimum basınç basıncıyla hafifçe vidalayarak mikro dili sabitleyin. Görüntü almaya başlamak için mikroskop yazılımını açın, ardından 920 nanometre iki foton lazeri açın. Su daldırma hedefini mikroskop üzerine monte edin, ardından hedefi mikro dilin görüntüleme penceresine diraye bırakın ve hedefi daldırın.Kamera modunda, bir cıva lambasından mavi ışığı açarak dilin yüzeyini aydınlatın. Yaklaşık odak düzlemini bulmak için Z eksenini ayarlayın ve filiform papilladan bir otofluoresans sinyali arayın. Ardından X ve Y ayar düğmesini kullanarak bir tat alma tomurcuk bulun.Çoklu foton moduna geçin, ardından görüntü alımı için heyecan dalga boyunu, emisyon filtresi kümesini, tarama modunu ve çerçeve boyutunu ayarlayın. Görüntüleme penceresinin ortasındaki tat alma tomurcukları ile, tat tomurcukunun yaklaşık üçte iki yüksekliğinde tat tomurcukunu çevreleyen kan damarlarını bulun ve kan dolaşımını görselleştirin. Kan akışı tıkanırsa, kan akışına devam etmek için sabitleme vidalarını hafifçe gevşetin.Yeterli sayıda tat hücresi içeren bir tat tomurcukunun Z düzlemini bulmak için Z eksenini ayarlayın, ardından 80 saniye boyunca iki ila altı Hertz'de kalsiyum görüntülemeye devam edin. Görüntüleme başladıktan sonra, 20 saniye boyunca bir tat çözeltisi sağlamak için akışkan sistemin rezervuarını kapatın. 20 saniyelik tat stimülasyonundan sonra rezervuarı tekrar yapay tükürük sınayın.Görüntüleme sırasında, dili nemli tutmak ve önceki seanstan kalan ıslıyı yıkamak için sürekli olarak yapay tükürük sağlayan seanslar arasında yaklaşık üç ila dört dakika bekleyin. Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresinin dil yüzeyi otofluoresan filiform papilla ve seyrek yayılmış tat tomurcukları ile kaplıdır. Sarı filiform papilla, 500 ila 550 nanometrede bir fotoğraf dedektörü kullanılarak yakalanır ve dilin yüzeyinden yaklaşık 25 mikrometre derinliğe kadar gözlemlenebilir.500 ila 550 nanometre filtre tarafından algılanan yeşildeki GCaMP sinyalleri ve 607 ila 670 nanometre filtresi tarafından algılanan kırmızı tdTomato sinyalleri tat hücrelerini temsil eder. TdTomato sinyali oran ölçüm analizi için elde edilir. Tat alma tomurcuklarını çevreleyen kan damarları, tat tomurcuklarını yapısal olarak destekleyen kollajen bağ dokusunda ayarlanan 500 ila 550 nanometre filtre seti kullanılarak elde edilir.Kalsiyum görüntüleme kullanılarak in-vivo tat taramasının bu temsili örneğinde, her tat hücresi kesik çizgilerle çizilir. Bu denemede, hücre 2 hem tatlı hem de umami tastantlarına yanıt verdi. Ve hücre 3 hem düşük hem de yüksek tuz lekelerine cevap verdi.Bu tat tomurcuklarındaki hücrelerin hiçbiri ekşi tatlara cevap vermedi. Bu deneyin amacı doğal ortamda tat hücre fonksiyonunu gözlemlemek olduğundan, floresanların hazırlık adımında kan damarlarına teslim etmek ve deney sırasında dolaşımını onaylamak önemlidir.

tongue-microfluidics-based-functional-imaging-platform-for-tongue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Etiketli hücreleri çok foton mikroskobu ile dil içinde ağız kanseri ve tümör invazyonu niceliksel olarak izlenmesi bir fare modeli üreten yer alan tekniklerin kapsamlı bir bakış sunulmaktadır. Bu sistem, anti-invaziv bileşiklerin moleküler değerlendirme ve ilaç etkinliği için faydalı bir platform olarak hizmet verebilir.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Lensfree optik tomografi &lt;1 um arasındaki konumsal bir çözünürlüğe sahip bir üç-boyutlu mikroskopi tekniktir x &lt;1 um x 15-100 mm arasında geniş bir görüntüleme-hacmi içinde, sırasıyla, x, y ve z, boyutları, içinde &lt;3...

Çok açılı Aydınlatma ve Pixel Super çözünürlüklü istihdam Lensfree On-chip Tomografik Mikroskopi

Burada, gerçek zamanlı olarak üç boyutlu fonksiyonel ve moleküler görüntüleme için yeni geliştirilmiş bir el tipi optoakustik (fotoakustik) sistemle görüntüleme için deneysel protokolün ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Gösterilen güçlü performans ve çok yönlülük, optoakustik teknolojinin klinik öncesi araştırma ve klinik uygulamada yeni uygulama alanlarını tanımlayabilir.

Evrensel Real Time Derin Doku İnsan Anjiografi ve Fonksiyonel Preklinik Çalışmalar üç boyutlu Optoacoustic Görüntüleme Probe El

Bu çalışma, başarılı bir şekilde translasyon disfaji araştırma kolaylaştırmak amacıyla murin hastalık modellerinde kullanılmak üzere insan videofloroskopik yutma çalışma (VFSS) yöntemleri adapte edilmiştir.

İnsan Videofloroskopik Kırlangıç ​​Eğitim Yöntemleri uyarlanması Algılama ve Mürin Hastalık Modelleri disfajiyi Characterize

Ultrason görüntüleme, konuşma sırasında dilin şeklini ve hareketlerini gerçek zamanlı olarak görüntülemek için kullanılabilir. Görüntüler, konuşma sesi hatalarının doğasını belirlemek için kullanılabilir. Dilin görsel geri bildirimi, klinik popülasyonlarda konuşma sesi üretimindeki iyileştirmeleri kolaylaştırmak için kullanılabilir.

Konuşma Ses Hataları Değerlendirilmesine için Eğitimi ve İyileştirme: Ultrason Tongue görüntüleri

Hedef özgü probları protein ifade çeşitli hastalık (Örneğin, iltihap, enfeksiyon ve tumorigenesis) gibi moleküler mekanizmaları analiz etmek için yenilikçi bir araç temsil eder. Bu çalışmada, bağırsak makrofaj infiltrasyonu F4/80 özel tomografi Floresans aracılı kullanarak kolit, fare modeli üç boyutlu bir nicel tomografik değerlendirilmesi açıklar.

Floresan-aracılı tomografi algılama ve fare bağırsak iltihabı makrofaj ile ilgili miktar

Anestezik fare modelinde dildeki kas tonusu ve viskoelastik özelliklerini belirlemek için cerrahi bir prosedürü tarif ediyoruz. Prosedür, hipoglossal sinirlerin spesifik olarak uyarılmasını ve kaslara pasif Lissajous kuvvet / deformasyon eğrilerinin uygulanmasını içerir.

Sıçan Dilinin Mekanik ve Viskoelastik Özelliklerinin In Vivo Değerlendirilmesi

Embriyonik ve yetişkin fare dillerinin epitel ve mezenkim/bağ dokusundan çok miktarda yüksek kaliteli tek hücreyi ayrıştırmak için genelleştirilmiş bir protokol geliştirdik.

Embriyonik Gün 12.5 ve 8 Haftalık Farelerin Dil Epitel ve Mezenkim/Bağ Dokusundan Hücre Ayrışması

Protokol, yetişkin farelerin arka tat papillasından izole edilmiş tat kök hücrelerinden elde edilen dil organoidlerini kültleme ve işleme için bir yöntem sunar.

Yetişkin Fare Tadı Kök Hücrelerinden Elde Edilen Lingual Organoidlerin Üretimi ve Kültürü

OCTOPUS olarak adlandırılan çok fazlı bir değişim ile uygulanan bir kolye damlası yüzey film dengesi, orijinal toplu çözeltinin simüle edilmiş gastrointestinal sıvılarla sıralı alt faz değişimi ile sindirim koşullarının taklit edilmesine izin verir. Simüle edilen in vitro sindirim, sindirilen ara yüz tabakasının ara yüz gerginliği in situ olarak kaydedilerek izlenir.

İn vitro Simüle Edilmiş Gastrointestinal Sıvıların Çok Alt Fazlı Değişimi Yoluyla Emülsiyonların Tek Bir Damlacıkta Sindirimi

Bu protokolün amacı, fırın diş eti epitel bariyerinin bütünlüğünü nicel olarak değerlendirmek için standart bir yaklaşım sağlamaktır; diş eti yüzeyine farklı moleküler boyutlarda floresans etiketli dekstransları in vivo uygulanarak ve ardından tek foton mikroskopi sistemiyle ex vivo görüntüleme uygulanır.

Fusesans İzleyicilerle Fare Diş Etili Epitelyal Bariyerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

Öğrenin, µTongue mikroakışkan sistemi ile canlı farede tat hücrelerinin fonksiyonel görüntülemesini. Bu yöntem, tat hücreleri arası iletişimi doğal fizyolojik koşullarda incelemeyi sağlar.

μTongue: Dil In Vivo için Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu

Daha fazla video keşfet