Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü
April 23rd, 2021
Burada, uzun dalga boyu makromoleküler X-ışını kristalografi deneyleri için Diamond Light Source'daki I23 kiriş hattında kriyojenik numune hazırlama ve kristallerin vakum endstationına aktarılması için bir protokol sunuyoruz.
Uzun dalga boyu makromoleküler kristalografi, proteinlerde ve nükleik asitlerde doğal olarak bulunan ışık atomlarından gelen anormal sinyali sömürür. Bu teknik, kristalografik yüz problemini deneysel olarak çözmek ve bu elementlerin kimliğini ve yerini belirlemek için kullanılır. Diamond Light Source'daki Beamline I23, beş angstroma kadar uzun dalga boylarındaki deneyler için optimize edilmiş benzersiz bir senkrotron cihazıdır.
Kalsiyum, potasyum, klor, kükürt ve fosfor gibi yüksek biyolojik alaka düzeyine sahip elementlerin emilim kenarlarına erişim sağlar. Uzun dalga boyu rejiminde x ışınlarının hava yoluyla önemli ölçüde emilimi nedeniyle bu deneyler vakum ortamında yapılmaktadır. Numuneleri vakum ortamında kriyojenik sıcaklıklarda tutmak için kristaller özel, termal iletken numune tutuculara monte edilir.
Sıvı azottan vakum uç istasyonuna kriyojenik numune transferi kriyo-elektron mikroskopisinde kullanılan tekniklere çok benzer. Bu protokol, Diamond Light Source'da geliştirilen araç ve gereçleri kullanarak kristallerin vakum ortamına aktarılması prosedürünü sunar. Kapağı CombiPuck'ın tabanından ayırarak başlayın, böylece numune tutucular tabana bağlı kalır ve şişeler kapakta tutulur.
Kapağı sıvı nitrojene şişelerle batırın, ardından bir numune tutucu ve adaptörü manyetik bir değnek takın ve kristalleri hasat edin. Her numuneyi doğrudan CombiPuck'a soğuyun ve numune konumunu not edin. Pakı kapatmak için, tabanı kapağına tutturmak için bir pak değneği kullanın.
CombiPuck'ı sıvı nitrojenden kuru göndericiye veya depolamaya aktarın. Boş transfer bloklarıyla doldurulmuş blok pakının tabanını bir köpük kaptaki destek tabanına yerleştirin, ardından sıvı nitrojenle doldurun. Daha sonra, CombiPuck'ı sıvı nitrojenle dolu köpük kaba yerleştirin, pakın tabanının köpük kabın içindeki manyetik tutucuya sabit olduğundan emin olun.
Sıvı nitrojende gerekli tüm aletleri önceden soğutur. Daha sonra, kapağı yüksek ayardaki pak ayırıcı aracını kullanarak tabandan ayırın, böylece taban manyetik tutucuya bağlı kalır ve numune tutucuları sıvı nitrojenin içine maruz kalır. Ayırıcı değneği numune tutucusuna ve adaptörün üzerine olabildiğince aşağı yerleştirin ve asanın dikey olduğundan emin olun.
Ayırıcı değnekteki küçük kolu, numune tutucuyu içeride sabitlemek için tıklayana kadar başparmağınızla aşağı hareket ettirin ve numune tutucuyu adaptörden çekin. Ayırıcıyı istediğiniz transfer bloğu konumuna düşürün, üç uçlardan birinin transfer bloğunun merkezi deliğine sığmasını sağlar. Kolu tekrar yukarı hareket ettirerek numune tutucuyu serbest bırakın.
Örnekleri bir sonraki aktarım bloğuna yüklemek için, boş bir aktarım bloğunu yatay konuma döndürmek için dönen atlıkarınca anahtar aracını kullanın. Tüm numune tutucular transfer edildikten sonra, kapağı sıvı nitrojene yerleştirerek blok pakını kapatın. Sıcaklığın dengelemesini bekleyin ve ardından kapağı tabanın üzerine takın ve atlıkarıncadan serbest bırakmak için hafifçe kaldırın.
Mekiği istasyona bağlayın. Azot gazı ve hava vanalarını açın ve gazların aktığından emin olun. Ardından CTS'yi kapatın.
Hem banyoyu hem de mekiği sıvı nitrojenle soğutun. Birlikte verilen huniyi mekik üzerindeki dolum portuna yerleştirin ve ekrandaki seviyeyi izlerken huninin içine yavaşça sıvı azot dökün. Gösterge kırmızıdan maviye döndüğünde durun.
Huniyi kullanarak banyoyu sıvı nitrojenle doldurun. Bir blok pakı sıvı azottan CTS banyosuna ekli pak ayırıcı aracını kullanarak aktarın. Blok pakın kapağını çıkarın ve CTS banyosunun kapağını kapatın.
Mekiğe bir transfer bloğu tanıtmak için, mekik kolunu saat yönünde 90 derece döndürerek kilidini açın ve tutamak üzerindeki kılavuzlu parçanın doğru seyahat yolunu zorlaması için banyoya doğru ilerletin. Blok kapağı soğuduktan sonra, bloğu mekiğe sokmak için tutamağı ilerletin. Aktarım bloğunu mekik üzerine kilitlemek için tutamacı saat yönünde 180 derece döndürün.
Tutamacı orijinal arka konuma geri çek ve saat yönünün tersine 90 derece döndürerek yerine kilitleyin. Mekik tahliyesine başlamak için ekran ekranında Mekik Vana Pompasını Kapat'a basın. Mesajlar Mekik hareket etmeye hazır olduğunda ve Çubuğu hareket ettirmeyin, valf kapalı dokunmatik ekranda görüntülenir, mekiğin altındaki kola basın ve üstteki kolu kullanarak dikkatlice kaldırın.
Mekiği vakum uç istasyonundaki hava kilidine dik bir konumda taşıyın ve takın. Dokunmatik ekrandaki ilgili düğmeye basarak ve örnek oteli doğru yükleme konumuna taşıyarak kap içinde boş bir blok konumu seçin. Örnek bir otel yer aldıktan sonra, vakum kilitleme sırasını başlatmak için Aç düğmesine basın.
Sıra tamamlandıktan ve durum Airlock açık olarak değiştikten sonra, mekikte blok, çubuğun kilidini açmak için kolu saat yönünde 90 derece bükün. Çubuğu yavaşça gemiye itin, böylece kılavuzlu parça örnek otele doğru seyahat yolunu zorlar. Kılavuz için ekranda görüntülenen video akışını kullanarak aktarım bloğunu yavaşça otele yerleştirin ve dokunmatik ekrandaki blok konumu simgesinin etkinleştirildiğinden emin olma.
Etkinleştirildikten sonra, aktarım bloğunu serbest bırakmak ve çubuğu gemiden çıkarmak için kolu saat yönünün tersine 180 derece döndürün. Tamamen geri çekildikten sonra, çubuğu kilitlemek için kolu saat yönünün tersine 90 derece döndürün. Son istasyon vakum vanasını kapatmak ve mekik ile gemi arasındaki boşluğu atmosferik basınca boşaltmak için Kapat düğmesine basın.
Hava kilidi ekranı ayırmak için Tamam durumunu gösterdiğinde mekiği çıkarın. Mekiği CTS banyosuna geri döndürün ve bir sonraki örnek bloğu yüklemeden önce mekiği tahliye etmek için Açık Mekik Vanası'na basın. Trafik ışığı yeşil olduğunda ve çubuğu taşımak için Tamam mesajı göründüğünde, bir sonraki aktarım bloğu mekiğe tanıtılabilir.
Bir sonraki transfer bloğunu hazırlamak için, blok pakını banyonun içinde döndürün. Akrilik kapağın üstündeki yerleşik döndürme tuşunu blok pakın ortasındaki kilidin içine itin. Basılı tutarken, istediğiniz transfer bloğunu teslim alma konumuna getirmek için anahtarı çevirin.
Tüm bloklar aktarıldıktan sonra, mekik vanasının açık olduğundan emin olun, dokunmatik ekrandaki Bake düğmesine basın, hem Banyo hem de Mekik'i seçin ve ardından Başlat Bake'ye basın. Diamond Light Source'daki uzun dalga boyu makromoleküler kristalografi kiriş çizgisi I23, kalsiyum, potasyum, klor, kükürt ve fosfor gibi biyolojik önemi yüksek elementlerin emilim kenarlarına erişebilir ve bu elementlerin makromoleküller içinde fazlanması veya bulunması için kullanılabilecek gelişmiş anormal sinyal verir. Kırınım verileri, dalga boyu 2.75 angstrom'daki tek bir thaumatin kristalinden toplanmış, daha uzun dalga boylarında artan anormal sinyal ve numune emilim etkileri arasında bir uzlaşma olarak seçilmiştir.
Vakum kurulumu, sadece numune tarafından saçılan x ışınlarının dedektöre ulaşmasını sağlayarak Bragg yansımalarının etrafında düşük arka plan sağlar. Veri kümesi çok güçlü anormal sinyal verdi ve otomatik fazlama ardışık düzeni CRANK2 ile yapı çözümünü kolaylaştırdı. Elde eden elektron yoğunluk haritasının yüksek kalitesi, thaumatin amino asit dizisinin% 100'ü için doğru yerleştirme ile başarılı otomatik model oluşturmayı sağladı.
Thaumatin içindeki 16 sistein kalıntısı, elektron yoğunluk haritasında açıkça görülebilen sekiz disülfid köprü oluşturur. Vakum içi uzun dalga boyu protein kristalografisi yeni bir alan olduğundan, yeni numune taşıma araçları ve ekipmanları geliştirdik. Bu protokol, Diamond Light Source'daki I23 beamline'daki vakum uç istasyonuna güvenli bir şekilde numune aktarma konusunda kullanıcılara rehberlik eder.
Vakum ortamı, diğer kiriş hatlarında erişilemeyen bir dalga boyu aralığında kırınım deneyleri yapmak için benzersiz fırsatlar sunar. Uzun dalga boyundaki x-ışını kristalografisi, makromoleküllerin doğrudan doğal kristallerden deneysel olarak aşamasını sağlar. Ayrıca moleküllere bağlı iyonların kesin olarak tanımlanmasına izin verir.
Genel Bakış
Bu makale, Diamond Light Source'taki I23 ışın hattında kriyojenik numune hazırlama ve kristallerin vakum son istasyonuna aktarılması için ayrıntılı bir protokol sunar. Odak noktası, biyolojik makromoleküllerdeki hafif atomlardan gelen anormal sinyalleri kullanan uzun dalga boylu makromoleküler X-ışını kristalografisi deneyleridir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Makromoleküler kristalografi
- Strüktürel biyoloji
- Senkrotron radyasyon teknikleri
Arka Plan
- Uzun dalga boylu makromoleküler kristalografi, hafif atomlardan gelen anormal sinyalleri kullanır.
- Işın hattı I23, uzun dalga boylu deneyler için optimize edilmiştir ve kritik biyolojik elementlere erişime olanak tanır.
- Deneyler, hava tarafından X-ışını emilimiyle azaltmak için vakum ortamında gerçekleştirilir.
- Kriyojenik sıcaklıklar, özel numune tutucular kullanılarak korunur.
Çalışmanın Amacı
- Kristallerin vakum ortamına aktarılması için kapsamlı bir protokol sağlamak.
- Aktarma sürecinde numunelerin bütünlüğünü sağlamak.
- Uzun dalga boylu X-ışını kristalografisi deneylerini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Numune erişimi için CombiPuck kapağının tabanından ayrılması.
- Kriyojenik korunma için numunelerin sıvı nitrojene daldırılması.
- Hassas numune aktarma için bir puck ayırıcı aracının kullanılması.
- Numune tanıtımı için kontrollü bir vakum ortamının uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Kriyojenikle korunmuş kristallerin vakum son istasyonuna başarılı bir şekilde aktarılması.
- Protokolün numune bütünlüğünü korumadaki etkinliğinin gösterilmesi.
- Uzun dalga boylu makromoleküler kristalografi prosedürünün doğrulanması.
- Diamond Light Source'taki gelecekteki deneyler için güvenilir bir yöntemin kurulması.
Sonuçlar
- Protokol, kriyojenik numune aktarma için sağlam bir çerçeve sağlar.
- Uzun dalga boylu X-ışını kristalografisi deneylerinin uygulanabilirliğini artırır.
- Gelecekteki uygulamalar, bu metodolojiyi çeşitli biyolojik çalışmalar için geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography on beamline I23 enables direct experimental phasing and native ion identification in proteins and nucleic acids, eliminating the need for external labeling. This capability enhances predictive confidence in structural biology, supporting early discovery and target validation inflection points across biopharma portfolios. The protocol's reproducibility and data quality facilitate risk-adjusted advancement of structural targets for downstream drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct structure solution of macromolecules using native anomalous scatterers for robust target validation.
- Supports mechanistic de-risking by unambiguously identifying biologically relevant ions and cofactors.
- Improves predictive confidence in target structure and binding site characterization.
Screening & Assay Development
- Provides high-quality, reproducible structural data for assay development and compound screening campaigns.
- Facilitates standardization of sample preparation and transfer workflows across research teams.
- Enables reliable evaluation of ligand binding and structural perturbations in validated systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural insights with disease-relevant systems by resolving native ion binding and post-translational modifications.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and data quality.
- Supports translational biomarker identification through precise structural mapping.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification and preclinical validation, leveraging in-vacuum crystallography for high-confidence structural outputs.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by enabling native anomalous phasing and ion identification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative diffraction data supporting assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides robust statistical outputs and electron density maps for comparative analysis of structural conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining sample fidelity and enabling biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for structural studies across multiple targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target structures.
- Operational Value: Standardizes sample handling and transfer, ensuring reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through high-quality structural data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic sample handling and macromolecular crystallography.
- Demands access to specialized instrumentation, including the Cryogenic Transfer System and vacuum-compatible sample holders.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and transfer protocols.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or crystal morphologies.
- Practical limitations include the need for vacuum-compatible infrastructure and specialized training.
