Name: Diamond Light Sourcedaki Beamline I23te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Öğrenin, Diamond Light Source I23 hattında uzun dalga boylu makromoleküler kristalografi için kriyojenik örnek hazırlama ve vakum içi transfer protokolünü. Bu yöntem, proteinlerdeki hafif atomların anomal saçılmasını kullanarak deneysel fazlama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kriyojenik Örnek Transfer Sistemi'nin (CTS) geliştirilmesine verdikleri destekten dolayı Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha ve Kevin Wilkinson'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Avrupa Komisyonu'nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen iNEXT-Discovery (Grant 871037) tarafından finanse edildi.

1. Kristal hasadı
NOT: Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın: mümkün olduğunca gözlük ve eldivenler.
<ol><li>SH'ler combipucks 'daki kullanıcı laboratuvarına geldikten sonra (Şekil 3C), kapağı combipuck'un tabanından ayırın, böylece SH'ler tabana bağlı kalır ve şişeler kapakta tutulur.</li>
	<li>Kapağı sıvı nitrojene şişelerle batırın. Manyetik bir değnek için bir SH + adaptör (Şekil 3B, sağ) takın ve kristalleri her zamanki gibi hasat edin.</li>
	<li>Her numuneyi doğrudan combipuck'a flaşla soğutarak numune konumunu not edin. Pakı kapatmak için, tabanı kapağına tutturmak için bir pak değneği kullanın.</li>
	<li>Tarak uçlarını sıvı nitrojenden kuru göndericiye veya sıvı azot depolama dewar'ına aktarın. Kuru göndericiyi Diamond'a (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html) sevk etti.</li>
</ol>2. Vakuma numune transferi
<ol><li>SH'nin combipuck'tan transfer bloğuna yüklenmesi<ol>
<li>Blok pakının tabanını (Şekil 3H) zaten boş transfer bloklarıyla doldurulmuş (Şekil 3D) sıvı nitrojenin içindeki destek tabanına bir köpük kap içine yerleştirin (Şekil 3J-b). NOT: Transfer bloklarının yönü, vakum kabı içindeki numune transferinin doğruluğu için önemlidir. Bu nedenle, bloklar, Şekil 3D'de okla işaretlenmiş pimin bloğun solunda olduğundan emin olarak blok pak tabanına yerleştirilmelidir.</li>
		<li>Şişe pakını sıvı nitrojenle dolu köpük kabın içine yerleştirin, pakın tabanının köpük kabın içindeki manyetik tutucuya sabit olduğundan emin olun (Şekil 3J-a).</li>
		<li>Sıvı nitrojende gerekli tüm aletleri önceden soğutur. Kapağı tabandan ayırmak için yüksek ayar H'de Şekil 3G'de gösterilen pak ayırıcı aracını kullanın, böylece taban manyetik tutucuya bağlı kalır ve SH'ler sıvı nitrojenin içine maruz kalır.</li>
		<li>Her SH'yi adaptöründen çıkarmak için, ayırıcı asayı (Şekil 3F) kullanarak SH'yi combipuck tabanından alın ve Şekil 3J-b'deki atlıkarıncanın yatay konumuna transfer bloğunun uygun konumuna yerleştirin.<ol>
<li>Numuneye dokunmamak için ayırıcı değneği SH + adaptörün üzerine olabildiğince aşağı yerleştirin, değneğin dikey olduğundan emin olun.</li>
			<li>SH'yi içeride sabitlemek ve SH'yi adaptörden çekmek için ayırıcı değnekteki küçük kolu tıklayana kadar başparmakla aşağı hareket ettirin.</li>
			<li>Ayırıcıyı istenen blok konumuna düşürün, üç uçlardan birinin bloğun merkezi deliğine sığmasını sağlar.</li>
			<li>Kolu tekrar yukarı hareket ettirerek SH'yi serbest bırakın. Her SH için bu adımları yineleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Örnekleri bir sonraki örnek bloğuna yüklemek için, boş bir bloğu yatay konuma döndürmek için dönen atlıkarınca anahtar aracını (Şekil 3E) kullanın.</li>
		<li>Şekil 3G'de gösterilen pak ayırıcı aracını, saat yönünde vidalayarak blok pakının kapağına düşük ayar L kullanarak takın.</li>
		<li>Tüm SH'lar aktarıldıktan sonra, blok pakını kapatmak için kapağı sıvı nitrojene yerleştirin ve sıcaklığın dengesini bekleyin, ardından kapağı Şekil 3I'de olduğu gibi tabanın üzerine yerleştirin. Ayırıcı alet takılıyken, atlıkarıncadan serbest bırakmak için hafifçe kaldırın.</li>
		<li>Bu aşamada, blok pakı CTS'ye (Şekil 4B) veya sıvı azot depolama dewar'ına aktarılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfer bloklarının vakum kabına yüklenmesi<ol><li>Mekiğin istasyona güvenli bir şekilde bağlandığından emin olun. Azot gazını ve hava vanalarını açın ve gazların aktığından emin olun. CTS'i aç.</li>
		<li>Ekranda herhangi bir uyarı mesajı yoksa, hem banyoyu hem de mekiği sıvı nitrojenle soğutmaya devam edin. Birlikte verilen huniyi mekikteki dolum portuna yerleştirin ve ekrandaki seviyeyi izlerken huninin içine yavaşça sıvı nitrojen dökün. Gösterge kırmızıdan maviye döndüğünde durun. NOT: Dokunmatik ekranda görüntülenen soğuk koltuğun sıcaklığı 100 K'nin altında olduğunda mekik kullanıma hazırdır. Örnek İstasyon banyosu, banyo duvarında işaretlenmiş seviyeye doğru huni kullanılarak veya sıvı azot seviyesi ekranında% 100 kullanılarak aynı anda doldurulabilir. Sıvı nitrojen seviyeleri ve sıcaklık sensörleri çalışma boyunca sürekli izlenmelidir; birkaç yükleme gerekecektir.</li>
		<li>Mekik soğuk koltuk sıcaklığı 100 K'nin altına indikten ve mekik ve banyodaki sıvı azot seviyeleri stabilize olduktan sonra, ekli pak ayırıcı aracını kullanarak bir blok pakı sıvı azottan CTS banyosuna aktarın. Blok pakın kapağını çıkarın ve CTS banyosunun kapağını kapatın.</li>
		<li>Mekiğe bir blok sokmak için, ekrandaki Açık Mekik Vanası düğmesine basarak CTS vanasını açın. 90° saat yönünde döndürerek mekik kolunun kilidini açın ve tutamak üzerindeki kılavuzlu parçanın banyoya doğru doğru seyahat yolunu zorlaması için banyoya doğru ilerletin. Blok kapağı banyonun içinde göründüğünde, kapağın soğumasını bekleyin. Kapağın etrafındaki sıvı azot köpürme durduktan sonra transfer bloğuna ilerleyin.</li>
		<li>Aktarım bloğunu mekik üzerine kilitlemek için kolu saat yönünde 180° döndürün.</li>
		<li>Tutamanı orijinal arka konuma geri çek ve ardından saat yönünün tersine 90° döndürerek yerine 'Kilitleyin'.</li>
		<li>Mekik tahliyesine başlamak için ekran ekranında Mekik Vanasını ve Pompasını Kapat'a basın.</li>
		<li>Ayrılmaya hazır mekik mesajı dokunmatik ekranda görüntülendiğinde, mekiğin altındaki kola basın ve üstteki tutamağı kullanarak dikkatlice kaldırın.</li>
		<li>Mekiği vakum son istasyonundaki hava kilidine dik bir konumda taşıyın.</li>
		<li>Mekiği vakum son istasyonundaki hava kilidine takın. NOT: Güvenli bir şekilde takıldıktan sonra, uç istasyondaki dokunmatik ekran mekiğin durumunu onaylar ve kilitler.</li>
		<li>Dokunmatik ekrandaki ilgili düğmeye basarak ve örnek oteli doğru yükleme konumuna taşıyarak kap içinde boş bir blok konumu seçin.</li>
		<li>Örnek otel yerine yerleştiğinde Aç düğmesi aktif hale gelecektir. Vakum kilitleme sırasını başlatmak için bu düğmeye basın. NOT: Pompa başlayacak ve ilerleme monitöründe görüntülenecektir. Bunun tamamlanması iki dakika kadar sürebilir.</li>
		<li>Sıra tamamlandıktan sonra, durum Airlock açık olarak değişecek, aktarım devam ediyor. Çubuğun kilidini açmak için kolu saat yönünde 90 ° çevirin ve çubuğu hafifçe gemiye itin, böylece kılavuzlu parça tekrar örnek otel konumuna doğru doğru seyahat yolunu zorlar. Rehberlik için ekranda görüntülenen video akışını kullanarak, dokunmatik ekrandaki blok konum ışığının etkinleştirildiğinden emin olarak bloğu yavaşça otele yerleştirin. Etkinleştirildikten sonra, bloğu serbest bırakmak için kolu saat yönünün tersine 180° döndürün ve çubuğu gemiden çekin. Tamamen geri çekildikten sonra, çubuğu kilitlemek için kolu saat yönünün tersine 90° döndürün.</li>
		<li>Çubuk kilitlendikten sonra Kapat düğmesi etkin hale gelir. Son istasyon vakum vanasını kapatmak için buna basın ve mekik ile gemi arasındaki boşluğu atmosferik basınca boşaltın ve tamamlanması için 20 s'ye kadar bekleyin.</li>
		<li>Dizi tamamlandıktan sonra mekiği kaldırmak için ekranın durumu tamam olarak göstermesini bekleyin. Bu noktada, mekiği çıkarın ve bir sonraki blok için işlemi tekrarlamak için CTS'ye dönün.</li>
		<li>Bir sonraki bloğu transfere hazırlamak için blok pakını banyonun içinde döndürün. Akrilik kapağın üstündeki yerleşik döndürme tuşunu blok pakın ortasındaki kilidin içine itin. Basılı tutarken, istenen bloğu toplama konumuna getirmek için anahtarı çevirin.</li>
		<li>Tüm bloklar aktarıldıktan sonra, CTS'ye monte edilirken mekik vanasının açık olduğundan emin olun. NOT: Bu, sıvı nitrojeni kaynatmak için hem mekiği hem de banyoyu ısıtır ve daha sonra birikmiş buz / yoğuşmayı bir sonraki kullanımdan önce buharlaştırır. Fırın başladıktan sonra gaz ve hava kapatılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+haemoglobin+-+IV.+Sign+determination+by+the+isomorphous+replacement+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+A.+Mathematical+and+Physical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287(1954).</li>
<li>Hendrickson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+diffraction+in+crystallographic+phase+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).</li>
<li>Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+heavy-atom+derivatization+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).</li>
<li>Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenomethionyl+proteins+produced+for+analysis+by+multiwavelength+anomalous+diffraction+%28MAD%29%3A+A+vehicle+for+direct+determination+of+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure.</a> The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).</li>
<li>Liu, Q., Hendrickson, W. A. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+Q+%22Protein+Crystallography.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology</a>. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. 1607, Humana Press. New York, NY. 377-399 (2017).</li>
<li>Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+SAD+is+maturing%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Native SAD is maturing.</a> IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).</li>
<li>Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+potassium+ions+for+ribosome+structure+and+function+revealed+by+long-wavelength+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction.</a> Nature Communications. 10 (1), 2519(2019).</li>
<li>Rocchio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+dynamic%2C+partially+occupied+residues+using+anomalous+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).</li>
<li>Langan, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+X-ray+diffraction+studies+of+ion+transport+in+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels.</a> Nature Communications. 9 (1), 4540(2018).</li>
<li>Lolicato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K2p+channel+C-type+gating+involves+asymmetric+selectivity+filter+order-disorder+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions.</a> Science Advances. 6 (44), (2020).</li>
<li>Thorn, A., Sheldrick, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANODE%3A+anomalous+and+heavy-atom+density+calculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation.</a> Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).</li>
<li>Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+metal-binding+sites+in+proteins+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).</li>
<li>Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+amino+acid+transport+by+the+CAT+family+of+SLC7+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters.</a> Nature Communications. 9 (1), 550(2018).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vacuum+long-wavelength+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).</li>
<li>Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+in-vacuum+PILATUS+1M+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+tomographic+reconstruction+of+macromolecular+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples.</a> Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).</li>
<li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+membrane+protein+crystal+using+ultraviolet+laser+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).</li>
<li>Mykhaylyk, V., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+long-wavelength+protein+crystallography%3A+Keeping+a+protein+crystal+frozen+in+vacuum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum.</a> Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010(2013).</li>
<li>Snell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+sample+mounting+and+alignment+system+for+biological+crystallography+at+a+synchrotron+source%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source.</a> Structure. 12 (4), 537-545 (2004).</li>
<li>The universal container project. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/">https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/</a> (2020).</li>
<li>Teng, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+freestanding+thin-film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).</li>
<li>Esposito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+glycosyltransferase+activity+of+the+salmonella+effector+SseK3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).</li>
<li>O'Donnell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+EMC+reveals+a+path+for+membrane+protein+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion.</a> eLife. 9, 57887(2020).</li>
<li>Mishra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+characterization+of+crimean-congo+hemorrhagic+fever+virus+GP38%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38.</a> Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).</li>
<li>Rudolf, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+inhibits+its+receptor+patched+by+a+pincer+grasp+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism.</a> Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).</li>
<li>El Omari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+sulfur+sad+phasing%3A+De+novo+structure+solution+of+the+n-terminal+domain+of+the+ectodomain+of+hcv+e1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).</li>
<li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIA2%3A+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li>
<li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Buccaneer+software+for+automated+model+building.+1.+Tracing+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).</li>
<li>Skubak, P., Pannu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+protein+structure+solution+from+weak+X-ray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automatic protein structure solution from weak X-ray data.</a> Nature Communications. 4 (1), 2777(2013).</li>
</ol>

Mevcut protokol, I23 kiriş hattında vakum içi uzun dalga boyu MX deneyleri için numune hazırlama gereksinimlerine uymak üzere geliştirilmiştir. Son bir yıldır kiriş hattında kullanılmakta ve birden fazla projenin başarıyla tamamlanmasına katkıda bulunmuştur. Burada sunulan sonuçlarda belirtildiği gibi, protokol, numunelerin kırınım kalitelerini korurken vakum uç istasyonuna güvenli ve güvenilir bir şekilde aktarılmasını sağlar. Işın hattı çalışması için önemli bir husustur ve kiriş hattı personeli tarafından bizzat kullanıcı eğitimi ile birlikte verilecektir. Bazı adımlar, prosedürün başarılı ve güvenli bir şekilde tamamlanması için kritik olarak vurgulanmaya değer: örneklerin combipuck tabanlarından numune bloklarına aktarılması, numunelerin zarar görmesini önlemek için doğruluk ve dikkat gerektirir (bkz. adım 2.1.4); sıvı azot seviyesinin tüm aşamalarda izlenmesi, numunelerin havaya maruz kalmalarını veya uygun şekilde soğutulmamış parçalara yakın temasta bulunmalarını önlemek için önemlidir (2.1.3 ve 2.2.2); endstation vakumunun bozulmasını önlemek için mekiği son istasyondan çıkarmadan önce (2.2.14) Close sırası (2.2.14) tamamen bitene kadar bekleme.
Protokolün anlayışı, protein kristallerinin vakum ortamına aktarılması için amaca yönelik ekipman geliştirmeyi amaçlayan bir mühendislik çalışması ile birlikte başlatıldı. Bu projenin son ürünleri CTS ve yukarıda açıklanan ilişkili numune işleme araçlarıydı. CTS, selefi Leica EM VCT10014 üzerinde önemli bir gelişmedir ve aktarım sırasında numune koruma ve vakum ortamının olmaması, sıvı azot banyosunun içinde buz birikmesi ve sezgisel bir kullanıcı arayüzünün ve güvenlik özelliklerinin bulunmaması gibi birçok sınırlamayı ortadan kaldırır. CTS'nin kullanıcı deneyimini iyileştiren ek özellikleri, mekik ve numune istasyonunun içindeki sıcaklık ve sıvı azot seviyesi izleme, bir yerine aynı anda dört blok kapasiteli daha büyük kapasiteli bir banyo ve mekik çalışması için kendi kendine yönlendirilen bir mekanizmadır. CTS, kullanıcı dostu dokunmatik ekran arayüzü ve endstation ile arayüz yaparken gelişmiş vakum ve mekanik güvenlik ile beamline kontrol sistemine tamamen entegre edilmiştir.
Beamline I23, türünün ilk uzun dalga boyu MX senkrotron cihazıdır ve bu nedenle protein kristallerini yüksek vakumlu bir ortama tanıtmak ve kriyojenik sıcaklıklarda saklamak önemli çabalar gerektirmektedir. Numune hazırlama araçlarında ve protokolünde iyileştirmelerin yanı sıra süreçleri kolaylaştırma çabaları devam ediyor. Kullanıcı desteğinin bir parçası olarak, beamline personeli sorun gidermeye yardımcı olmak için her zaman kullanılabilir. Bu senaryolardan bir örnek, vakum sisteminin bütünlüğünü tehlikeye atan, mekiği CTS veya son istasyon hava kilidine takma veya çıkarmada zorluklara yol açan sorunlar olacaktır. Haftalık ve günlük olarak farklı test seviyeleri gerçekleştirilir ve kullanıcı eğitimi, mekiğin bağlı olduğu arayüzlerdeki O halkalarının görsel incelemesi gibi olası arızaları önlemek için ek kontrolleri kapsayacaktır. Vakum ortamı, diğer kiriş hatlarında erişilemeyen bir dalga boyu aralığında kırınım deneyleri yapma fırsatı açarken, ek aktarım adımı genel örnek verimini azaltır.
Transfer bloğu başına sadece dört numune ve vakum kabının içinde beş bloğa kadar manuel transfer, toplam kapasiteyi 20 numune ile sınırlar. Bu nedenle, büyük bir numuneye sahip projelerin değişkenlik örneği için, numuneler Diamond yüksek verimli kiriş hatlarında ön tarama yapılmalı ve daha sonra optimize edilmiş uzun dalga boyu deneyi için yalnızca en umut verici örnekler aktarılmalıdır. Örnek tutucular ve transfer blokları birkaç yıl önceki ilk girişlerinden farklı olmasa da, burada sunulan işleme araçları tamamen yeni gelişmelerdir. I23 özel numune tutucuları, kiriş çizgisi için soğutma konseptindeki rolleri nedeniyle değişmezdir. Bu nedenle, numune taşıma araçlarının tasarımı, MX kullanıcı topluluğunun uzun süredir benimsediği bu yeni tip tutucu ile standart ticari olarak kullanılabilen araçlar arasında bir bağlantı oluşturmayı amaçladı, örneğin taraklar, kristal hasat asaları ve kuru gönderici taşıma sistemi. Tasarımları kullanıcı topluluğuyla önemli bir istişare içeriyordu ve tamamlanması için birkaç yineleme gerekiyordu. Burada sunulan ekipman, araçlar ve protokol, Diamond Light Source'daki I23 beamline'daki deneyler için kullanıcı örneklerinin transferi için basit ve sağlam bir sistemi temsil eder. Vakum içi uzun dalga boyu makromoleküler kristalografi için bu araç yapısal biyoloji için yeni fırsatlar açar.

Uzun dalga boyundaki X-ışını kırınımı, makromoleküllerde doğal olarak bulunan belirli ışık atomlarının anormal saçılma özelliklerinden yararlanmak için kullanılır. Bu, kristalografik faz sorununu çözmeye ve makromoleküller içindeki bu tür öğelerin kimliğini ve konumunu net bir şekilde doğrulamaya yardımcı olur. Makromoleküler kristalografinin ilk günlerinde de novo yapılar çoklu izomorf replasman ile çözülmüştür1, senkrotronlarda ayarlanabilir X-ışını kiriş çizgilerinin ortaya çıkmasıyla, çok dalga boyu ve tek dalga boyu (SAD) anomalili kırınım tekniklerine dayalı deneysel fazlama baskın yöntemler haline gelmiştir2 . Her iki yöntem de tarihsel olarak, kristalleşme veya kristal ıslatma ile kristallere yapay olarak sokulması gereken ağır metallerden gelen izomorf veya anormal sinyale dayanmıştır3. Deneme yanılma yaklaşımı ve öngörülemeyen sonuç, bu deneyleri sinir bozucu bir şekilde zaman alıcı hale getirebilir. Seleno-metiyonin protein ekspresyonu sırasında birleştirilmesi4, ökaryotik protein ekspresyon sistemlerinde çok zor olsa da, bu sınırlamaların üstesinden gelmenin ve kısa dalga boylarında anormal kırınımdan yararlanmanın çok zarif bir yoludur.
Uzun dalga boyu MX, kristalleri daha fazla tedavi etmeden başarılı bir kristalizasyon denemesinden doğrudan kullanmanın rahatlığı nedeniyle yerel SAD deneyleri5,6 tarafından yapı tespiti için son derece çekicidir. Ek olarak, kalsiyum, potasyum, klor, kükürt ve fosfor gibi biyolojik önemi yüksek elementlerin emilim kenarlarına erişim, bu elementlerin makromoleküllerdeki konumlarını doğrudan tanımlama fırsatı açar7,8,9,10. Orta ve düşük çözünürlükte, 2Fo-Fc elektron yoğunluğuna ve kimyasal ortama dayanan eleman ataması, özellikle benzer sayıda elektron veya kısmi doluluklara sahip zayıf bağlı iyonlara sahip elemanlar için zor olabilir. Bu belirsizlikler, ortaya çıkan model aşamalı anormal fark Fourier haritalarının ilgi ve yorumlanmasının çekimser kenarının altında ve üstünde veri toplanarak çözülebilir11,12. Bu haritalarda kükürt atomu konumlarının bulunması, model oluşturmanın düşük çözünürlüklü elektron yoğunluk haritalarına dönüşmesine de yardımcı olabilir13. Bu ışık elemanlarının emilim kenarları φ = 3 ve 6 şarasındaki dalga boylarında gözlenir (bkz. Şekil 1, üst). Bu dalga boyu aralığı, herhangi bir senkrotron MX kiriş hattının yeteneklerinin çok ötesinde olmuştur ve bu aralıkta verimli çalışma, aşağıda belirtildiği gibi çeşitli teknik zorlukların üstesinden gelmeyi gerektirir.
Diamond Light Source, UK'deki Beamline I23, uzun dalga boyu MX deneylerini kolaylaştırmak için özel olarak tasarlanmış, φ = 1,13 ile 5,9 ş(E = 2,1 ve 11 keV arasındaki enerji aralığı) arasında bir dalga boyu aralığında ayarlanabilir benzersiz bir cihazdır. Yüksek vakumlu bir ortamda çalıştırarak14, hava emilimi ve saçılma ortadan kaldırılır, böylece kırınım deneylerinin verimliliğini ve sinyal-gürültü oranını artırır. Büyük bir vakum endstation, yarı silindirik Pilatus 12M dedektörü, çok eksenli bir goniometre, çevrimiçi görüntüleme ve kolimasyon sistemlerinin yanı sıra numune transferi ve depolanması için ısmarlama ekipman da dahil olmak üzere numune ortamının tüm bileşenlerini çevreler (Şekil 2). Her ekipman parçası, en kaliteli uzun dalga boyu verilerinin toplanabilmesini sağlamak için optimize edilmiştir. Kavisli Pilatus 12M dedektörü, 2φ = ±100° kırınım açılarına kadar toplanabilir ve en uzun dalga boylarında bile yeterince yüksek çözünürlüklü kırınım verileri elde eder (Şekil 1, alt). 120 dedektör modülü özellikle düşük enerji uyumluluğu için seçilmiştir ve ek bir ultra yüksek kazanç modu için kalibrasyonlar sağlanmıştır.
Mümkün olan en düşük dedektör eşiği 1,8 keV'dir ve 3,6 keV'den daha düşük enerjiler için daha fazla köşe ve kenar etkisine yol açabilir ve özellikle düşük mozaik kristalleri için en uzun dalga boylarında veri kalitesini tehlikeye atabilir. Dedektör kuantum verimliliğindeki azalma ile birlikte bu etkinin bir deney planlarken dikkate alınması gerekir15. Çok eksenli goniometre, anormal sinyalin kalitesini ve gücünü ve toplanan anormal verilerin eksiksizliğini en üst düzeye çıkaran veri toplama stratejilerine izin vermek için kristallerin yeniden yönlendir edilmesini sağlar. Örnek emilimi, özellikle en uzun dalga boylarında deneyler için sınırlayıcı bir faktördür. Yaygın olarak kullanılan MX işleme yazılım paketlerinde uygulandığı gibi emilim düzeltmeleri16,17, 3 şcivarında dalga boyları için iyi çalışıyor. Daha uzun dalga boyları, parçalanmayan malzemeyi çıkarmak ve kristalleri iyi tanımlanmış şekillerde kesmek için tomografik rekonstrüksiyonlara18 veya lazer ablasyona dayalı analitik emilim düzeltmeleri gerektirecektir19. İkincisi ayrıca daha uzun dalga boylarındaki X-ışını kırınım deneyleri daha küçük kristaller için daha verimli olduğu için daha büyük kristallerin boyutunu azaltmaya yardımcı olacaktır14. Açık akışlı soğuk gaz akışı cihazlarının kullanılması vakum ortamıyla uyumlu olmadığı için, veri toplama sırasında numuneleri kriyojenik sıcaklıklarda tutmanın zorluğu iletken soğutma ile ele alınmaktadır. Bu nedenle, numuneyi bir darbe tüpü kriyosooler'e bağlamak için bakır gibi termal iletken malzemelere ihtiyaç vardır. MX boyunca kullanılan paslanmaz çelik SPINE standart pimleri ve piyasada bulunan diğer numune montajları, zayıf termal iletkenlikleri nedeniyle vakum içi uzun dalga boyu MX için uygun değildir.
Vakum içi MX için numune tutucular (SH'lar) ısı giderme termal yolunun önemli bir parçası olmalıdır (Şekil 3A). Bu nedenle, termal iletken bakır gövde ve pimden oluşurlar ve iki önemli özellik içerirler: soğuk goniometre kafasına yeterli bir termal bağlantı sağlamak için güçlü bir mıknatıs tabanı ve X-ışını emilimini ve saçılmasını en aza indirmek için poliimidden yapılmış örnek bir montaj20. Kristal hasat ve flaş soğutma kullanıcı deneyiminin standart MX uygulamalarıyla ilişkili olanla neredeyse aynı olmasını sağlamak için çaba sarf edildi. Özel I23 SH'ler diğer senkrotron kiriş hatlarıyla doğrudan uyumlu olmadığından, kristal hasat eden manyetik değnekler ve diğer MX kiriş hatlarındaki mevcut goniometre arayüzleriyle uyumluluk için paslanmaz çelik bir adaptör kullanılır (Şekil 3B). Adaptör, en iyi dağınık kristallerin seçimi için hızlı ön eleme gerektiriyorsa, ALS tipi robot tutucu kafaları21 ve unipuck tarzı taban düzenleri22'ye dayanan diğer Diamond MX kiriş hatlarındaki otomasyon olanaklarından yararlanmak için de önemlidir. Örnek hazırlama ve yükleme protokolü iki aşamaya ayrılabilir:
Aşama 1: Kullanıcılar tarafından kendi laboratuvarlarında gerçekleştirilen kristallerin ve flaş dondurmanın toplanması
Projenin I23 veri toplama için uygunluğunun değerlendirilmesinin ardından, kristal boyutlarına uyan döngülere sahip numune sahipleri (adaptörlerle önceden monte edilmiştir) kristal hasadı için kullanıcı laboratuvarlarına gönderilir. Herhangi bir hasarı önlemek için, SH'lar ve adaptörler ayrılmamalıdır ve standart kristal hasat manyetik asaları kullanılarak uygun boyutta halkalara sahip kristallerin balıklandırılması amacıyla tek bir birim olarak kullanılmalıdır. MX'te yaygın olduğu gibi, bu görev mikroskop altında manuel olarak gerçekleştirilir ve kristaller sıvı nitrojenli bir köpük dewar içinde hemen yanıp söner23. Manyetik kuvvetlerin uyuşmaması nedeniyle, SH'lar şu anda unipucks ile uyumlu değildir. Depolama ve nakliye, uyumlu kuru gönderici kesici uçları (Şekil 3C) ile birlikte talep üzerine kullanıcılara sunulan combipucks (Bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir. Bu diskler, yaygın olarak kullanılan unipucks ile aynı taban plakasını paylaşır ve diğer Diamond MX kiriş hatlarındaki örneklerin hızlı bir şekilde ön elemesini sağlar. Bu ekipmanı kullanıcılara ödünç vermek, ısmarlama numune tutucular ticari olarak mevcut olana kadar şu anda en iyi düzenlemedir. Işın hattına nakliye, MX topluluğunda kullanılan standart kuru göndericiler gerektirir.
Aşama 2: Kriyo soğutmalı numunelerin vakumlu son istasyona aktarılması
Numuneler kiriş çizgisine ulaştığında, vakum son istasyonuna transfer için hazırlanır. Bu, SH'lerin taraklardan çıkarılmasını ve adaptörlerden ayrılmasını içerir. Kriyo-elektron mikroskopisi alanında biyolojik numunelerin vakumla tanıtılması rutin olarak yapılmaktadır. Bazı köklü kavramlar I23 örnek aktarımı için uyarlanmıştır. Kısacası, SH'lar sıvı nitrojen altında transfer bloklarına aktarılır (Şekil 3D). Bu bloklar mükemmel ısı iletkenliğine ve kristallerin vakumdayken cam geçiş sıcaklığına ulaşmasını önleyen önemli bir termal kütleye sahiptir. Her biri dört numune kapasiteli dört blok, sıvı nitrojen altında Kriyojenik Transfer Sistemi'ne (CTS) numune aktarmak veya deneyler arasında sıvı azot dewars'ta depolamak için kullanılan bir blok pakına (Şekil 3H) yüklenir.
Diamond Light Source'da geliştirilen Kriyojenik Transfer Sistemi, Örnek İstasyonu ve Mekik olmak üzere iki alt montajdan oluşmaktadır (Şekil 4A). Örnek İstasyonu, protein kristallerinin geçici olarak depolanmasını sağlayan sıvı azot banyosundan oluşur ve güvenliği sağlamak ve kullanıcı dostu bir deneyime izin vermek için özel özelliklere sahiptir (Şekil 5). CTS, kullanıcı dostu dokunmatik ekran arayüzü aracılığıyla programlanabilir bir mantık denetleyicisi tarafından kontrol edilir. Örnek İstasyonu, daha iyi görselleştirme için yerleşik ışık yayan diyotlara ve numuneler aktarıldıktan sonra sıvı azot banyosunun kurumasını otomatikleştirmek için yakın döngüde kontrol edilen bir dizi ısıtıcıya sahiptir. Ayrıca sistemin güvenliğini ve verimli çalışmasını sağlamak için çeşitli sensörlere sahiptir. Örnek İstasyonu, numune transferi için kaba vakuma pompalamanın yanı sıra sıvı azot seviyelerinin ve mekiğin içindeki sıcaklığın izlenmesi gibi işlemler için mekikle etkileşime girmek için güvenilir bir elektrik arayüzü sağlamak için ısmarlama donanıma sahiptir.
Shuttle (Şekil 6), Sample Station sıvı azot banyosundan bir transfer bloğu almak ve kriyojenik ve vakumlu bir ortamda uç istasyona aktarmak için kullanılan taşınabilir bir cihazdır. Transfer sırasında numuneleri soğuk tutmak için sıvı nitrojen dewar, dewar'da sıvı seviyesi izleme ve çalışma ve kullanıcı güvenliği için çeşitli sensörler içerir. Transfer kolu manyetik bir tahrik ile donatılmıştır ve transfer bloklarını son istasyona güvenli bir şekilde yükleme ve boşaltma konusunda kullanıcılara rehberlik etmek için işlenmiş oluklar içerir. Mekikten vakum kabına transfer bir hava kilidi ile gerçekleştirilir. Hava kilidi, mekik ve endstation vakum vanalarını açmadan önce mekik ve endstation arasındaki boşluğu boşaltmak için kullanılan uç istasyondaki mekik için bir arayüzdür. Pompalama ve havalandırma dizileri tamamen otomatiktir ve kullanıcı dostu bir arayüze sahip büyük bir dokunmatik ekran aracılığıyla çalıştırılabilir (Şekil 4C). Mevcut protokol, veri toplama için vakum son istasyonuna bir thaumatin kristali aktarmak için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>12M dedektör</td><td>Dectris, İsviçre</td><td></td><td>tek foton saymalı X-ışını dedektörü</td></tr><tr><td>CombiPuck</td><td>MiTeGen</td><td>SKU: M-CBP-P1</td><td>I23 numune tutucularının ve numunelerinin kriyojenik depolanması ve taşınması için kullanılan kriyopucks</td></tr><tr><td>Kristal hasat manyetik değnek</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td><güçlü >MD7-411< / güçlü ></td> <td>Kristal hasadı için kullanılır</td></tr><tr><td>Kuru Gönderici (CX100)</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td><güçlü>MD7-21</güçlü></td> <td>I23 numune tutucularının ve numunelerinin kriyojenik depolanması ve taşınması için kullanılır</td></tr><tr><td>Kuru gönderici ek parçası (CombiPuck Taşıma Bastonu)</td><td>MiTeGen</td><td>SKU: M-CBP-PTC1</td><td>I23 numune tutucularının ve numunelerinin kriyojenik depolanması ve taşınması için kullanılır</td></tr><tr><td>Kapton poliimid</td><td></td><td></td><td>Kapton poliimid</td></tr><tr><td>Perpsex kapaklı</td><td></td><td></td> akrilik kapaktan yapılmış numune montajı<td>, yerleşik döndürme anahtarı,</td></tr><tr><td>Taumatin tozu</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>T7638</td> <td>Buhar difüzyonu ile taumatin kristallerinin üretimi için kullanılır</td></tr></tbody></table>

diamond light source'daki beamline i23'te vakum İçi uzun dalga boyu kristalografisi için Örnek hazırlama ve transfer protokolü

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Uzun dalga boyu makromoleküler kristalografi (MX), genellikle makromoleküllerde doğal olarak bulunan kükürt, fosfor, potasyum, klor veya kalsiyum gibi elementlerin anormal saçılma özelliklerinden yararlanır. Bu, ek etiketlemeye gerek kalmadan deneysel fazlama yoluyla proteinlerin ve nükleik asitlerin doğrudan yapı çözümünü sağlar. Bu dalga boyu rejiminde X ışınlarının önemli ölçüde hava emilimini ortadan kaldırmak için bu deneyler vakum ortamında gerçekleştirilir. Diamond Light Source, UK'deki Beamline I23, 5 Å'ya doğru uzun dalga boyu aralığında MX deneyleri için tasarlanmış ve optimize edilmiş türünün ilk senkrotron cihazıdır. 
Bunu mümkün kılmak için, büyük bir vakum kabı numune ortamının tüm endstation bileşenlerini içine eder. Vakumda depolama ve veri toplama sırasında numunelerin kriyojenik sıcaklıklarda tutulması gerekliliği, termal iletken numune tutucuların kullanılmasını gerektirir. Bu, numunenin yaklaşık 50 K'ya kadar soğutulmasını sağlamak için verimli ısı gidermeyi kolaylaştırır. Mevcut protokol, I23 kiriş hattında numunelerin hazırlanması ve vakuma aktarılması için kullanılan prosedürleri açıklar. Makromoleküler kristalografi topluluğu içinde önceden oluşturulmuş uygulama ve yöntemlerde homojenliğin sağlanması, standart MX araçları ile donatılmış herhangi bir laboratuvar ortamında sıvı azot sıcaklığına numune soğutması yapılabilir. 
Kriyojenik depolama ve numunelerin taşınması sadece standart ticari olarak mevcut ekipman gerektirir. Kriyogenik olarak soğutulmuş kristallerin sıvı azottan vakum son istasyonuna aktarılması için özel ekipman gereklidir. ısmarlama numune taşıma araçları ve özel bir Kriyojenik Transfer Sistemi (CTS) geliştirilmiştir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan örneklerde toplanan kırınım verileri, işlem sırasında numunelerin kalitesinin değişmediğini gösteren mükemmel birleştirme istatistikleri gösterir. Bu, standart senkrotron kiriş çizgilerinin ötesinde bir dalga boyu aralığında vakum içi MX için benzersiz fırsatlar sunar.

Vakum endstation'ına yukarıda özetlenen protokol kullanılarak bir thaumatin kristali tanıtıldı. Kırınım verileri, görüntü başına 0,1° ve 0,1 s pozlama artışıyla 3600 görüntü olarak 2,7552 ş(E = 4500 eV) dalga boyunda toplanmıştır. Işın boyutu 150 μm x 150 μm'ye ayarlandı ve 7,1 x 109 foton/sn'lik bir akı ölçümü ile 'a düşürüldü. φ = 2.7552 şseçimi, anormal sinyal ve numune emilim etkilerindeki artış ile çözünürlüğün daha uzun dalga boylarına düşmesi arasındaki uzlaşmaya dayanmaktadır. Kükürt teorik emilim kenarına yakın olmasa da (φ= 5.0095 Å), bu dalga boyunda, kükürt f" saçılma faktörüne hayali katkı 1.57 e - , 1.7 ile 2 şarasındaki dalga boylarına kıyasla 1.6-2.1 daha büyük bir faktördür. Ortaya çıkan daha güçlü anormal sinyaller, daha zorlu projeler için başarılı S-SAD aşamaları sağlar.
I2324,25,26,27 kiriş hattında çeşitli zorlu aşama deneyleri zaten gerçekleştirilmiştir ve veriler bu dalga boyunda toplanmıştır. S-SAD ile fazlama çok daha kısa dalga boyları kullanılarak mümkün olsa da, bu genellikle 10028'in üzerinde çokluk değerlerine ulaşmak için birçok izomorf kristalden gelen verileri birleştirerek anormal sinyal oluşturmayı gerektirir. Daha uzun dalga boylarındaki gelişmiş anormal sinyal nedeniyle, I23'te çözülen çoğu aşama projesi yalnızca bir kristalden veri gerektiriyordu. Şekil 7'de sol tarafta temsili bir kırınım görüntüsü gösterilir. Xia2-3dii29 kullanılarak veri işleme, Tablo 1'de belirtildiği gibi mükemmel birleştirme istatistikleri üretti. Şekil 7, doğru, thaumatin veri kümesinden temsili bir kırınım görüntüsünün bir kısmını gösterir ve genellikle vakum kurulumunda gözlenen büyük I/σ(I) değerlerine katkıda bulunan Bragg yansımalarını çevreleyen düşük arka planı gösterir ve yalnızca numune tarafından saçılan X ışınlarının dedektöre ulaşmasını sağlar.
1.8 Å'nın maksimum ulaşılabilir çözünürlüğü dedektör geometrisi ve X-ışını radyasyonunun seçilen dalga boyundan kaynaklanmaktadır. Veri kümesi, 2.677 anormal normal olasılık parametresinin orta eğimine yansıyan çok güçlü anormal sinyal verdi ve otomatik fazlama ardışık düzeni CRANK2 ile yapı çözümünü kolaylaştırdı. Elde edilen elektron yoğunluk haritasının yüksek kalitesi, CRANK231 içindeki Buccaneer30 modülü tarafından başarılı otomatik model oluşturmayı ve thaumatin amino asit dizisinin% 100'ü için doğru yerleştirmeyi sağladı. ANODE11 ile hesaplanan aşamalı anomalili fark Fourier haritası, Tablo 2'deki anormal saçılmacıların konumlarındaki zirvelerin 18 önemli yüksekliği tarafından doğrulanan iki alternatif konformasyonla Cys159'dan 16 çok iyi sıralanmış kükürt atomunu ve bir kükürt atomunu ortaya koymaktadır. Thaumatin içindeki 16 sistein kalıntısı, hepsi 2Fo-Fc haritasında açıkça görülebilen 8 disülfid köprü oluşturur (Şekil 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> Şekil 1: Uzun dalga boyu MX deneylerinden elde edilen yüksek çözünürlüklü kırınım verileri. (A) I23 kiriş hattında erişilebilen ışık elemanlarının emilim kenarlarını gösteren enerjiye karşı f" değerlerinin grafiği. (B) P12M dedektörünün köşelerinde enerjiye karşı elde edilebilen maksimum çözünürlük. Kısaltma: MX = makromoleküler kristalografi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> Şekil 2: Vakum kabından geçen yatay bölüm, son istasyonun tüm bileşenleri ile. Kısaltma: OAV = eksenli görüntüleme sistemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> Şekil 3: Numune taşıma araçları. (A) I23 Numune tutucu. (B) Adaptörlü bir I23 örnek tutucunun yanında MX omurga standardı pim (solda) (sağda). (C) I23 numune tutuculu (mavi) combipuck kapak ve taban. Blok pak kapağı ve tabanı iki transfer bloğu (altın). Arkada hem tarak hem de blok paklarla uyumlu kuru bir gönderici bastıcı görülebilir. (D) Dört I23 örnek tutuculu transfer bloğu. (E) Blok pak tabanının dönmesi için kullanılan anahtar aracı. (F) Ayırıcı değnek. (G) Yüksek ve düşük ayarları gösteren iki oklu puck ayırıcı aracı. (H) Dört boş Cu bloğu ile blok pak tabanı. (I) Blok pakı için kapak. (J) Numune tutucuları combipuck tabanlarından bakır bloklara aktarmak için gerekli tüm aletlere sahip köpük kap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> Şekil 4: Kriyojenik Transfer Sistemi. (A) Mekik takılı CTS Örnek istasyonu ve dolum için kullanılan huniler. (B) CTS. (C) CTS kontrol yazılımı dokunmatik ekranının içine yerleştirilmiş iki transfer bloğuna sahip bir blok pak. Kısaltma: CTS = Kriyojenik Transfer Sistemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> Şekil 5: Kriyojenik Transfer Sistemi Örnek İstasyonu. Kısaltmalar: LED'ler = ışık yayan diyotlar; LN2 = sıvı nitrojen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> Şekil 6: Kriyojenik Transfer Sistemi Mekiği. Kısaltmalar: LED'ler = ışık yayan diyotlar; LN2 = sıvı nitrojen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> Şekil 7: Kırınım görüntüleri. Solda, thaumatin kristalinde toplanan veri kümesinden bir kırınım görüntüsü. Doğru, düşük sayı arka plan pikselleriyle çevrili bir kırınım noktası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> Şekil 8: Otomatik boru hattı CRANK2 ile Thaumatin yapı çözümü (varsayılan ayarlar, sonraki iyileştirme yok). (A) 1.6φ (mavi) 2Fo-Fc haritalı thaumatin'e genel bakış ve 5φ'de aşamalı anormal fark Fourier haritası ANODE (yeşil) olarak hesaplanır. (B) Sadece aşamalı anormal farkı gösteren thaumatin'e genel bakış Fourier haritası 5φ'de. (C) Thaumatin'de 1,6φ 'de 2Fo-Fc haritası ve 5φ'de aşamalı anormal fark Fourier haritası ile mevcut bir disülfid köprünün yakından görünümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ad</td>
			<td>Thaumatin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Veri toplama dalga boyu (Å) (enerji (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Görüntü sayısı x kama boyutu (°)</td>
			<td>3600 x 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Boşluk Grubu</td>
			<td>
P 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Birim hücre sabitleri</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözünürlük (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bütünlüğü</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicity</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Orta eğim</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Thaumatin için veri toplama ve işleme istatistikleri 2.755 şdalga boyunda, beamline I23, DLS. Çözünürlük, tamlık, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) ve çokluk için yüksek çözünürlüklü kabuklar parantez içinde gösterilir. Kısaltma: DLS = Elmas Işık Kaynağı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>En yakın atom</td>
			<td>Tepe yüksekliği (sigma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>MET112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Anormal fark Fourier, CRANK2'den aşamalı ve otomatik olarak oluşturulan modeli kullanarak ANODE tarafından hesaplanan tepe yüksekliklerini eşler.

Burada, uzun dalga boyu makromoleküler X-ışını kristalografi deneyleri için Diamond Light Source'daki I23 kiriş hattında kriyojenik numune hazırlama ve kristallerin vakum endstationına aktarılması için bir protokol sunuyoruz.

Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Uzun dalga boyu makromoleküler kristalografi, proteinlerde ve nükleik asitlerde doğal olarak bulunan ışık atomlarından gelen anormal sinyali sömürür. Bu teknik, kristalografik yüz problemini deneysel olarak çözmek ve bu elementlerin kimliğini ve yerini belirlemek için kullanılır. Diamond Light Source'daki Beamline I23, beş angstroma kadar uzun dalga boylarındaki deneyler için optimize edilmiş benzersiz bir senkrotron cihazıdır.Kalsiyum, potasyum, klor, kükürt ve fosfor gibi yüksek biyolojik alaka düzeyine sahip elementlerin emilim kenarlarına erişim sağlar. Uzun dalga boyu rejiminde x ışınlarının hava yoluyla önemli ölçüde emilimi nedeniyle bu deneyler vakum ortamında yapılmaktadır. Numuneleri vakum ortamında kriyojenik sıcaklıklarda tutmak için kristaller özel, termal iletken numune tutuculara monte edilir.Sıvı azottan vakum uç istasyonuna kriyojenik numune transferi kriyo-elektron mikroskopisinde kullanılan tekniklere çok benzer. Bu protokol, Diamond Light Source'da geliştirilen araç ve gereçleri kullanarak kristallerin vakum ortamına aktarılması prosedürünü sunar. Kapağı CombiPuck'ın tabanından ayırarak başlayın, böylece numune tutucular tabana bağlı kalır ve şişeler kapakta tutulur.Kapağı sıvı nitrojene şişelerle batırın, ardından bir numune tutucu ve adaptörü manyetik bir değnek takın ve kristalleri hasat edin. Her numuneyi doğrudan CombiPuck'a soğuyun ve numune konumunu not edin. Pakı kapatmak için, tabanı kapağına tutturmak için bir pak değneği kullanın.CombiPuck'ı sıvı nitrojenden kuru göndericiye veya depolamaya aktarın. Boş transfer bloklarıyla doldurulmuş blok pakının tabanını bir köpük kaptaki destek tabanına yerleştirin, ardından sıvı nitrojenle doldurun. Daha sonra, CombiPuck'ı sıvı nitrojenle dolu köpük kaba yerleştirin, pakın tabanının köpük kabın içindeki manyetik tutucuya sabit olduğundan emin olun.Sıvı nitrojende gerekli tüm aletleri önceden soğutur. Daha sonra, kapağı yüksek ayardaki pak ayırıcı aracını kullanarak tabandan ayırın, böylece taban manyetik tutucuya bağlı kalır ve numune tutucuları sıvı nitrojenin içine maruz kalır. Ayırıcı değneği numune tutucusuna ve adaptörün üzerine olabildiğince aşağı yerleştirin ve asanın dikey olduğundan emin olun.Ayırıcı değnekteki küçük kolu, numune tutucuyu içeride sabitlemek için tıklayana kadar başparmağınızla aşağı hareket ettirin ve numune tutucuyu adaptörden çekin. Ayırıcıyı istediğiniz transfer bloğu konumuna düşürün, üç uçlardan birinin transfer bloğunun merkezi deliğine sığmasını sağlar. Kolu tekrar yukarı hareket ettirerek numune tutucuyu serbest bırakın.Örnekleri bir sonraki aktarım bloğuna yüklemek için, boş bir aktarım bloğunu yatay konuma döndürmek için dönen atlıkarınca anahtar aracını kullanın. Tüm numune tutucular transfer edildikten sonra, kapağı sıvı nitrojene yerleştirerek blok pakını kapatın. Sıcaklığın dengelemesini bekleyin ve ardından kapağı tabanın üzerine takın ve atlıkarıncadan serbest bırakmak için hafifçe kaldırın.Mekiği istasyona bağlayın. Azot gazı ve hava vanalarını açın ve gazların aktığından emin olun. Ardından CTS'yi kapatın.Hem banyoyu hem de mekiği sıvı nitrojenle soğutun. Birlikte verilen huniyi mekik üzerindeki dolum portuna yerleştirin ve ekrandaki seviyeyi izlerken huninin içine yavaşça sıvı azot dökün. Gösterge kırmızıdan maviye döndüğünde durun.Huniyi kullanarak banyoyu sıvı nitrojenle doldurun. Bir blok pakı sıvı azottan CTS banyosuna ekli pak ayırıcı aracını kullanarak aktarın. Blok pakın kapağını çıkarın ve CTS banyosunun kapağını kapatın.Mekiğe bir transfer bloğu tanıtmak için, mekik kolunu saat yönünde 90 derece döndürerek kilidini açın ve tutamak üzerindeki kılavuzlu parçanın doğru seyahat yolunu zorlaması için banyoya doğru ilerletin. Blok kapağı soğuduktan sonra, bloğu mekiğe sokmak için tutamağı ilerletin. Aktarım bloğunu mekik üzerine kilitlemek için tutamacı saat yönünde 180 derece döndürün.Tutamacı orijinal arka konuma geri çek ve saat yönünün tersine 90 derece döndürerek yerine kilitleyin. Mekik tahliyesine başlamak için ekran ekranında Mekik Vana Pompasını Kapat'a basın. Mesajlar Mekik hareket etmeye hazır olduğunda ve Çubuğu hareket ettirmeyin, valf kapalı dokunmatik ekranda görüntülenir, mekiğin altındaki kola basın ve üstteki kolu kullanarak dikkatlice kaldırın.Mekiği vakum uç istasyonundaki hava kilidine dik bir konumda taşıyın ve takın. Dokunmatik ekrandaki ilgili düğmeye basarak ve örnek oteli doğru yükleme konumuna taşıyarak kap içinde boş bir blok konumu seçin. Örnek bir otel yer aldıktan sonra, vakum kilitleme sırasını başlatmak için Aç düğmesine basın.Sıra tamamlandıktan ve durum Airlock açık olarak değiştikten sonra, mekikte blok, çubuğun kilidini açmak için kolu saat yönünde 90 derece bükün. Çubuğu yavaşça gemiye itin, böylece kılavuzlu parça örnek otele doğru seyahat yolunu zorlar. Kılavuz için ekranda görüntülenen video akışını kullanarak aktarım bloğunu yavaşça otele yerleştirin ve dokunmatik ekrandaki blok konumu simgesinin etkinleştirildiğinden emin olma.Etkinleştirildikten sonra, aktarım bloğunu serbest bırakmak ve çubuğu gemiden çıkarmak için kolu saat yönünün tersine 180 derece döndürün. Tamamen geri çekildikten sonra, çubuğu kilitlemek için kolu saat yönünün tersine 90 derece döndürün. Son istasyon vakum vanasını kapatmak ve mekik ile gemi arasındaki boşluğu atmosferik basınca boşaltmak için Kapat düğmesine basın.Hava kilidi ekranı ayırmak için Tamam durumunu gösterdiğinde mekiği çıkarın. Mekiği CTS banyosuna geri döndürün ve bir sonraki örnek bloğu yüklemeden önce mekiği tahliye etmek için Açık Mekik Vanası'na basın. Trafik ışığı yeşil olduğunda ve çubuğu taşımak için Tamam mesajı göründüğünde, bir sonraki aktarım bloğu mekiğe tanıtılabilir.Bir sonraki transfer bloğunu hazırlamak için, blok pakını banyonun içinde döndürün. Akrilik kapağın üstündeki yerleşik döndürme tuşunu blok pakın ortasındaki kilidin içine itin. Basılı tutarken, istediğiniz transfer bloğunu teslim alma konumuna getirmek için anahtarı çevirin.Tüm bloklar aktarıldıktan sonra, mekik vanasının açık olduğundan emin olun, dokunmatik ekrandaki Bake düğmesine basın, hem Banyo hem de Mekik'i seçin ve ardından Başlat Bake'ye basın. Diamond Light Source'daki uzun dalga boyu makromoleküler kristalografi kiriş çizgisi I23, kalsiyum, potasyum, klor, kükürt ve fosfor gibi biyolojik önemi yüksek elementlerin emilim kenarlarına erişebilir ve bu elementlerin makromoleküller içinde fazlanması veya bulunması için kullanılabilecek gelişmiş anormal sinyal verir. Kırınım verileri, dalga boyu 2.75 angstrom'daki tek bir thaumatin kristalinden toplanmış, daha uzun dalga boylarında artan anormal sinyal ve numune emilim etkileri arasında bir uzlaşma olarak seçilmiştir.Vakum kurulumu, sadece numune tarafından saçılan x ışınlarının dedektöre ulaşmasını sağlayarak Bragg yansımalarının etrafında düşük arka plan sağlar. Veri kümesi çok güçlü anormal sinyal verdi ve otomatik fazlama ardışık düzeni CRANK2 ile yapı çözümünü kolaylaştırdı. Elde eden elektron yoğunluk haritasının yüksek kalitesi, thaumatin amino asit dizisinin% 100'ü için doğru yerleştirme ile başarılı otomatik model oluşturmayı sağladı.Thaumatin içindeki 16 sistein kalıntısı, elektron yoğunluk haritasında açıkça görülebilen sekiz disülfid köprü oluşturur. Vakum içi uzun dalga boyu protein kristalografisi yeni bir alan olduğundan, yeni numune taşıma araçları ve ekipmanları geliştirdik. Bu protokol, Diamond Light Source'daki I23 beamline'daki vakum uç istasyonuna güvenli bir şekilde numune aktarma konusunda kullanıcılara rehberlik eder.Vakum ortamı, diğer kiriş hatlarında erişilemeyen bir dalga boyu aralığında kırınım deneyleri yapmak için benzersiz fırsatlar sunar. Uzun dalga boyundaki x-ışını kristalografisi, makromoleküllerin doğrudan doğal kristallerden deneysel olarak aşamasını sağlar. Ayrıca moleküllere bağlı iyonların kesin olarak tanımlanmasına izin verir.

sample-preparation-transfer-protocol-for-vacuum-long-wavelength

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu yazıda Gelişmiş Foton Kaynak at GSECARS 13-BM-C beamline bir elmas örs hücre ile tek kristal X-ışını kırınım deneyleri yürütmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. ATREX ve RSV programları verileri analiz etmek için kullanılır.

Yüksek Basınçlı PX de Tek Kristal Kırınımı ^ 2

Protein mikro kristalleri kullanılarak X-ışını kristalografisi için bir protokol sunulmuştur. Saflaştırmadan sonra ya da selüloda in vivo büyümüş mikrokristalleri analiz eden iki örnek karşılaştırılmıştır.

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Makromoleküler X-ışını Kristalografi için yeni bir örnek tutucu ile birlikte uygun bir kullanım Protokolü sunulmaktadır. Sistem, kristal büyümesi, kristal ıslanmasına ve herhangi bir kristal manipülasyon veya montaj gerek kalmadan her iki, ortam ve kriyojenik sıcaklık içinde situ dikesasyon veri toplama sağlar.

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Bu protokolün amacı, yakın zamanda Avustralya senkrotronunda görevlendirilen yüksek viskoz enjektör Lipidico'da veri toplama için seri kristalografi örneklerinin nasıl hazırlanacağını göstermektir.

Avustralya Senkrotron'da Seri Kristalografi Ölçümleri için Lipidico Enjeksiyon Protokolü

Diamond beamline I24'te seri senkrotron kristalografisi için sabit hedef numune hazırlama, veri toplama ve veri işleme için kapsamlı bir kılavuz sunuyoruz.

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Helmholtz-Zentrum Berlin'deki kristalografik parça taraması, özel bileşik kütüphaneler, kristal işleme araçları, hızlı veri toplama tesisleri ve büyük ölçüde otomatik veri analizi içeren bir iş akışı kullanılarak gerçekleştirilir. Sunulan protokol, aşağı akış yapısına dayalı ligand tasarımı için umut verici başlangıç noktaları sağlamak için bu tür deneylerin çıktısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır.

Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar

Verilerin sinyal-gürültü oranı, mikrokristallerden X-ışını kırınım ölçümlerinin yapılmasında en önemli hususlardan biridir. VMXm kiriş çizgisi, bu tür deneyler için düşük gürültülü bir ortam ve mikrobülans sağlar. Burada, VMXm ve diğer mikro odak makromoleküler kristalografi kiriş hatları için mikrokristallerin montajı ve soğutulmasından dolayı örnek hazırlama yöntemlerini açıklıyoruz.

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

Bu belge, erişim başvurusundan ve veri dağıtımına kadar sonraki tüm adımlardan başlayarak kristal tabanlı parça taraması için tüm XChem sürecini açıklamaktadır.

Diamond Light Source'taki XChem Tesisinde Verimli Parça Taramasının Gerçekleştirilmesi

Harwell'deki Araştırma Kompleksi'ndeki kristalizasyon tesisini kullanarak proteinlerin kristalleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz ve ardından Diamond'ın Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ (VMXi) ışın hattındaki plakalar içindeki kristallerden yerinde X-ışını kristalografik veri topluyoruz. Numune gereksinimlerini, kristalizasyon protokollerini ve veri toplama yönergelerini açıklıyoruz.

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

Öğrenin, Diamond Light Source I23 hattında uzun dalga boylu makromoleküler kristalografi için kriyojenik örnek hazırlama ve vakum içi transfer protokolünü. Bu yöntem, proteinlerdeki hafif atomların anomal saçılmasını kullanarak deneysel fazlama sağlar.

Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü

Daha fazla video keşfet