İnce Tabaka Kromatografisi ile Mikobakterilerin Lipid Bileşiminin Analizi

Mikobakteri Lipitleri cinsin önemli bir özelliğidir ve konak Mycobacteria etkileşimlerinde kritik öneme sahiptir. Hız ve çok yönlülük bu prosedürün başlıca avantajlarıdır. Bu yöntem lipitlerin rolünü ve mikobakterilerin patojenikliğini ve immünostimülatör etkilerini anlamak için kullanılabilir.

Kovalent olmayan bağlı lipitlerin çıkarılması için, laminer akış başlığı altında PTFE astar vidalı kapaklı bir cam tüpe metanol çözeltisine bir ila iki kloroformdan 15 mililitre ekleyin. Ardından, katı bir ortamdan 200 miligram mikobakteri çizin ve mikobakterileri cam tüpe ekleyin. Tüpü sürekli karıştırarak bir gecede kuluçkaya yatırın.

Ertesi gün, organik çözücüleri filtre kağıdı ile kaplı bir cam huniden cam bir tüpe filtreleyin. Azot gazı akısını kullandıktan sonra, tüpteki sıvı fazı buharlaştırmak için, tüpü dört santigrat derecede saklamak için tüpü azot gazı ile doldurun. Daha sonra, hücresel döküntüye metanol çözeltisine iki ila bir kloroformdan 15 mililitre ekleyin ve tüpü sürekli karıştırarak bir gecede kuluçkaya bırakın.

Ertesi sabah, organik çözücüleri aynı cam toplama tüpüne bir filtre kağıdı astarlı cam hunisine aktarmak için pasteur pipet kullanmadan önce karışımın bir saat dinlenmesine izin verin. Daha sonra, tüpü dört santigrat derece depolama için azot gazı ile doldurmadan önce, gösterildiği gibi sıvı fazı buharlaştırın. Mikolik asit ekstraksiyonu için, PTFE astar vidalı kapaklı bir hermetik cam tüpe iki ila beş mililitre tirifying çözeltisi ve 200 miligram mikobakteri biyokütlesi ekleyin ve içeriği girdapla karıştırmak için.

Karışımı bir gecede 80 santigrat derecede kuru bir banyonun içinde kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, tüp oda sıcaklığını soğutduğunda, iki mililitre N heksan ekleyin ve içeriği girdaplayarak 30 saniye karıştırın. tüpün iki net faz görünene kadar oturmasına izin verin ve üst N heksam fazını yeni bir tüpe aktarın.

Tüp içeriğiyle iki mililitre daha N heksan karıştırın ve üst tabakayı tekrar toplayın. Daha sonra, azot akışı ile tüp içeriğini buharlaştırın ve azotla kaplı numuneyi gösterildiği gibi dört santigrat derecede saklayın. TlC ile numuneleri analiz etmek için, TLC odasının bir duvarını bir filtre kağıdı ile kaplayın, hazneyi kapatmak için oda köşelerine Vazelin ekleyin, çözücü karışımını filtre kağıdının üzerine getirin ve çözücünün kalan hacmini TLC odasının altına ekleyin.

Doygunluğa sahip olmak için TLC haznesini en az 20 dakika kapatın. Bu arada, cam tüpteki lipitleri 200 ila 1000 mikrolitre kloroformda çözün ve lipid kloroform süspansiyonun 10 mikrolitresini doğrudan TLC plakasına uygulamak için kılcal cam bir tüp kullanın. Numunenin beş dakika kurumasına izin verdikten sonra, plakayı doymuş TLC haznesine yerleştirin ve mobil fazın TLC'den geçmesine izin verin.

Çözücü plakanın üst ucundan bir santimetreye ulaştığında, plakayı silika tamamen kuruyana kadar laminar akı altına yerleştirin. Daha sonra, kurutulmuş plakayı 15 ila 20 mililitre% 10 molar veri fosforik asit hidrat ile plaka parlak sarı olana kadar etanolde püskürtün ve plakayı 120 santigrat derecede iki ila beş dakika ısıtın. Bu temsili analizde, çeşitli mikobakteri türlerinden çıkarılan mikolik asit, iki farklı elüasyon sistemi ve iki boyutlu TLC kullanılarak tek boyutlu TLC ile analiz edilmiştir.

Tip beş mikolik asit varlığını doğrulamak için iki tip metilasyon işlemi de yapıldı. Her iki elüsyon sisteminde de mikolik asitler plakanın yaklaşık ortasında yer almasına rağmen, tip beş mikolik aside karşılık gelen nokta sadece saponifikasyondan sonra gözlenmiştir. İki boyutlu TLC ayrıca bireysel mikolik asit türlerinin tanımlanmasını sağlar.

Örneğin, mikobakterileryum brumae sadece tip bir mikolik asitleri, mikobakteri bovis BCG tip bir ve dörtü, mycobacterium fortuitum tip bir ve beşi ve mikobakteriyum abcessus tip bir ve iki mikolik asit profillerini ifade eder. Çeşitli mikobakteri türlerinden elde edilen toplam lipid özleri polariteleri ve büyüklükleri açısından analiz edildi. PDIM'ler gibi çoğu A polar lipitinin mikobakteri bovis BCG'de bulunduğunu, ancak mikobakteriyum fortuitum, mikobakteri brumae ve M abcessus'un pürüzsüz morfotipinde bulunmadığını ortaya koymaktadır.

Fenolik GlikoLipidler sadece mikobakteri bovis BCG'de bulunurken, GlycoPeptidoLipids sadece mikobakteri abcessus örneklerinde görülür. Mikolik asitlere benzer şekilde, Acylglycerols ve PDIM'ler, PIM'ler, tek boyutlu TLC veya 2D TLC analizi ile de kolayca görselleştirilebilir. PiM'leri tek boyutlu TLC'de ortaya çıkarmak için iki tür leke kullanıldı.

Bu protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, prosedür boyunca herhangi bir plastik alet kullanmamaktır.