Kentsel Çevrenin Taranması - Çevre Rezervuarlarından SARS-CoV-2'nin Örneklemesi ve Tespiti için Bir Boru Hattı
9 Nisan 2021
Sars-CoV-2 için çevre örnekleri toplamak üzere San Diego sakinlerini işe almak için bir vatandaş bilimi projesi tasarlandı. Kullanıcı dostu bir mobil cihaz arayüzü kullanılarak veri gönderimi için çok dilli bir web tabanlı platform oluşturuldu. Laboratuvar bilgi yönetim sistemi, gerçek zamanlı sonuç takibi ile binlerce coğrafi çeşitlilikte numunenin toplanmasını kolaylaştıran bir sistemdir.
Bu çalışma, gaz pompası kolları, oyun alanları ve ATM'ler gibi kentsel ortamda nadiren temizlenen yüzeylerde SARS-CoV-2'yi tespit etmek için yeni bir iş akışı sunmaktadır. Bir pandemide, erzak kıtlığı vardır. Temel laboratuvar ortamlarında bulunan kolayca elde edilebilen malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar kullanıyoruz.
Soğuk zincir olmadan RNA'yı koruyan bir ekstraksiyon yöntemi ve inhibitörlere dayanıklı bir algılama yöntemi kullanıyoruz. Bu protokol kamu sağlığını ilgilendiriyor. Gelecekteki küresel salgınlar sırasında mevcut COVID-19 salgını ve diğer bulaşıcı ajanlar için çevresel viral rezervuarların değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar.
Yerel ve sosyal medya aracılığıyla yayınlanan doğrudan ve net bir eylem çağrısı kullanarak vatandaş bilim adamlarını işe alın. Konuyu sosyal medya içeriğine bağlamak için bir sosyal medya tanıtıcısı oluşturun. Çevrimiçi bir formda belirtilen biyogüvenlik ile ilgili soruları yanıtlayarak bireylerin çevresel örnekleme çabalarına katılmak için başvurmaları için birden fazla dilde gezinmeyi sağlamak için çok dilli bir eklenti sağlayarak SMP'ye bir bağlantı oluşturun.
örnekleme bölümüne İngilizce ve İspanyolca grafik ve görsel-işitsel protokolleri ekleyin. Bir bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan jeo uzamsal uygulama programlama arabirimini kullanarak jeo uzamsal verileri görselleştirin. Merkezi depolamayı, işleme iş akışlarının izlenmesini ve lojistiğin yönetimini kolaylaştırmak için SMP aracılığıyla LIMS'ye gönderilen verileri depolayın.
Veri türü uyumluluğunu etkinleştirmek ve hatayı en aza indirmek için örnek kit kimliği, örnek kimliği, tarih, saat ve genel konumlandırma sistemi koordinatları gibi ön yükleme bilgileri. Katılımcılar için, tüm örnekleri topladıktan sonra kullanabilecekleri bir örnek teslim alma isteği bağlantısı ekleyin. Maske ve eldiven, numune alma protokolü ve biyogüvenlik ile ilgili bilgiler gibi gerekli kişisel koruyucu ekipman da dahil olmak üzere tüm örnekleme malzemelerini içeren bir kit oluşturun.
Bir santimetrekare polyester emici bezeyi deterjanla ıslatarak ve 10 santimetrekarelik bir yüzeyi temizleyerek evlerde ve kentsel çevrede yüzeyleri nadiren dezenfekte etti. Bir kürdan yardımıyla, her örnek çubuğu 200 mikrolitre guanidinium tiyosiyanat içeren önceden etiketlenmiş tüpe batırın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her numunenin toplanması için sağlanan maskeyi ve yeni bir çift eldiven takın.
Örneklemesi bitirdikten sonra, sağlanan el dezenfektanını kullanın. Tüpleri laboratuvara taşınana kadar dört santigrat derecede saklayın. Numuneler laboratuvara ulaştığında eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Taramanın hızını artırmak için örnekleri havuzlarda işleyin. Havuz pozitifse, her örneğin RNA'sını bağımsız olarak ayıklayın. Sekiz numunenin her birinin 50 mikrolitresini bir mikrosantrifüj tüpüne bir araya getirerek ve kalan örnekleri eksi 80 santigrat derecede kurtararak her örnekleme kitinden alınan örnekleri iki havuzda birleştirin.
15 saniye boyunca 80 mikrolitre kloroform ve girdap ekleyin. Sonra dört santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yaslanın. 13,000 kez G'de 20 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj.
Sulu tabakayı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kalan arayüzü ve pembe sıvıyı eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Bu fraksiyonlar DNA ve protein içerir.
Guanidinium tiyosiyanat bazlı RNA ham ekstraksiyon protokolü kullanarak kurtarılan sulu tabakadan RNA çıkarın. Borulama kaybını hesaba katmak için ODA SıCAKLıĞıNDA %10 fazla hacimde RT-LAMP reaksiyon karışımını hazırlayın. Numune reaksiyona beş mikrolitre RNA ve beş mikrolitre RNA artı çivili reaksiyona 2,5 mikrolitre sentetik SARS-CoV-2 RNA ekleyin.
Pozitif kontrole 2,5 mikrolitre sentetik SARS-CoV-2 RNA ve negatif kontrole beş mikrolitre su ekleyin. İyice karıştırın ve reaksiyonları kısın. Kolorimetrik gözlem için negatif bir sonuç pembe, pozitif sonuç ise sarı ile gösterilir.
RT-LAMP'den sonra jel elektroforez gerçekleştirin. Örnek toplama sitelerinin dağılımı burada gösterilmiştir. Kitlerin çoğunluğu tamamlandı ve ilgili veriler LIMS'ye yüklendi.
%100 frekansta algılama sınırı 25 mikrolitre reaksiyon başına 500 kopya idi. Kolorimetrik RT-LAMP'de pozitif örnekler, pH kayması nedeniyle pembeden sarıya renk değiştirdi. Düşük kopya numaralarında, numuneler, ortaya çıkan merdiven benzeri desenle pozitifleri doğrulamak için bir agarose jel üzerinde çalıştırıldı.
RT QPCR yöntemleri çevresel örneklerle test edilmiştir. Tüm ana karışımlar, pozitif kontrolün düşük kopya sayısı konsantrasyonlarında inhibitörlere karşı hassastı. Şablonun düşük konsantrasyonlarında, geleneksel RT PCR yöntemleri yanlış pozitifler ve yanlış negatifler gösterdi.
Son olarak, yuvarlanan daire amplifikasyonu adı verilen bir teknik, hedef sıranın küçük miktarlarını tespit etti. Bununla birlikte, bir RNA şablonunun yokluğunda probun amplifikasyonu gösterdi. Toplumun tüm sektörlerine ulaşan bir eylem çağrısı yayınlamak çok önemlidir, bu nedenle örnekleme gerçekten bu topluluğun tüm üyelerinin maruz kalma riskini temsil eder.
Bu çerçeve SARS-CoV-2 genetik materyali tespit eder. Viral canlılığı test etmek için yapılan çalışmalar bir sonraki adımdır.
Genel Bakış
Bu makale, COVID-19 pandemisi sırasında nadiren temizlenen kentsel yüzeylerde SARS-CoV-2 tespiti için vatandaş bilimi tabanlı bir iş akışı sunmaktadır. Protokol, kolayca erişilebilen malzemeleri ve reaktifleri kullanarak, tedarik zinciri kısıtlamaları altında bile geniş ölçekli çevresel örnekleme ve viral RNA'nın hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu yaklaşım, çevresel örneklerde yaygın olarak bulunan inhibitörlere karşı dirençli olacak şekilde tasarlanmıştır ve diğer virüslerin gelecekteki halk sağlığı sürveyans çalışmaları için uyarlanabilir niteliktedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Çevresel viroloji
- Halk sağlığı sürveyansı
- Moleküler tanı
Arka Plan
- SARS-CoV-2'nin yüzeyler aracılığıyla bulaşması, COVID-19 pandemisi sırasında bir endişe kaynağıydı.
- Çevresel sürveyansların çoğu, hastaneler ve toplu taşıma araçları gibi yaygınlığın yüksek olduğu bölgelere odaklanmıştır.
- Nadir temizlenen kentsel yüzeyler, viral rezervuarlar olarak hizmet edebilir.
- Pandemi sırasındaki tedarik sıkıntıları, alternatif örnekleme ve tespit stratejilerini zorunlu kılmıştır.
Çalışmanın Amacı
- Nadir olarak dezenfekte edilen kentsel yüzeylerde SARS-CoV-2'yi tespit etmek için bir iş akışı geliştirmek ve doğrulamak.
- Vatandaş bilimcileri büyük ölçekli çevresel örnekleme süreçlerine dahil etmek.
- Tedarik eksikliklerine ve çevresel inhibitörlere karşı dayanıklı bir protokol oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Çok dilli destekle, yerel ve sosyal medya aracılığıyla 350 vatandaş bilimcinin katılımının sağlanması.
- Kişisel koruyucu donanım (KKD), sürüntü çubukları ve protokoller içeren örnekleme kitlerinin dağıtımı.
- Deterjanla ıslatılmış poliester sürüntü çubukları kullanılarak 10 cm2 yüzey alanlarından sürüntü alınması.
- Örneklerin, soğuk zincir gereksinimi olmaksızın guanidinyum tiyosiyanat ile korunması.
- İlk tarama için örneklerin havuzlanması ve havuzlar pozitif sonuç verdiğinde bireysel RNA ekstraksiyonunun yapılması.
- Guanidinyum tiyosiyanat tabanlı bir protokol kullanılarak RNA ekstraksiyonu.
- Kolorimetrik RT-LAMP yoluyla tespit ve jel elektroforezi ile onaylama.
- RT-qPCR ve yuvarlanan halka amplifikasyonu yöntemleri ile karşılaştırma.
- Laboratuvar Bilgi Yönetim Sistemi (LIMS) ve coğrafi görselleştirme araçları kullanılarak merkezi veri yönetimi.
Ana Sonuçlar
- Çeşitli kentsel yüzeylerden 4.000'den fazla örnek toplanmıştır.
- RT-LAMP testi, net bir kolorimetrik okuma ile 25 µL reaksiyon başına 500 kopya tespit sınırı göstermiştir.
- Havuzlama yöntemi tarama verimliliğini artırmıştır; pozitif havuzlar bireysel analiz için ayrıştırılmıştır.
- RT-qPCR, düşük kopya sayılarında inhibitörlere karşı duyarlılık göstermiş ve bu durum yanlış pozitif/negatif sonuçlara yol açmıştır.
- Yuvarlanan halka amplifikasyonu, RNA kalıbı yokluğunda spesifik olmayan amplifikasyon göstermiştir.
- İş akışı, toplumu başarılı bir şekilde sürece dahil etmiş ve kapsamlı çevresel sürveyans imkanı sağlamıştır.
Sonuçlar
- Tanımlanan protokol, erişilebilir malzemeler ve vatandaş katılımı kullanarak kentsel yüzeylerdeki SARS-CoV-2 RNA'sının hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar.
- İş akışı, çevresel inhibitörlere karşı dayanıklıdır ve gelecekteki diğer virüs salgınları için uyarlanabilir.
- Tespit edilen yüzeylerdeki viral canlılığı değerlendirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Kentsel yüzeylerdeki viral RNA için yürütülen çevresel sürveyans, toplumsal bulaşma risklerinin ve çevresel rezervuarların erken tespiti için ölçeklenebilir bir çerçeve sunar. Bu iş akışı, tedarik zinciri kısıtlamaları altında bile hızlı ve dağıtık örnekleme ile güçlü bir deteksiyona olanak tanıyarak halk sağlığı ve biyofarma Ar-Ge'sinde öngörücü güveni destekler. Bu yaklaşım, keşiften sürveyansa kadar uzanan süreklilik boyunca risk değerlendirmesini ve müdahale stratejilerini bilgilendirerek gelecekteki patojen izleme çalışmaları için uyarlanabilir niteliktedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bulaşma dinamikleriyle ilgili çevresel viral rezervuarların hipotez odaklı değerlendirmesine olanak tanır.
- Çeşitli yüzeylerde viral RNA varlığını ve dağılımını netleştirerek biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Enfeksiyöz ajanlar için çevresel maruziyet modellerinde öngörüsel güvenilirliği kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Karmaşık çevresel matrislerde viral RNA'nın yüksek hassasiyetle tespit edilmesi için valide edilmiş protokoller sağlar.
- Geniş kohortlar boyunca tekrarlanabilir ve kantitatif çıktılar elde etmek için örnek toplama ve işlemeyi standartlaştırır.
- İnhibitörlere karşı analiz dayanıklılığını göstererek gerçek dünya koşullarında güvenilir taramaları destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Salgın hazırlığı için çevresel sürveyans verilerini halk sağlığı biyobelirteç stratejileriyle hizalar.
- Çevresel tespit aşamasından preklinik risk modellemesine ve müdahale planlamasına kadar süreklilik sağlar.
- Yeni ortaya çıkan patojenler için sürveyans araçlarının riskten arındırılmış şekilde geliştirilmesini destekler.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu iş akışı; çevresel örnekleme, moleküler tespit ve merkezi veri yönetimini birbirine bağlayarak, erken keşif aşamasından translasyonel sürveyansa kadar olan süreci konumlandırmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Çevresel bulaşma ve rezervuar haritalama üzerine hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Havuzlanmış ve bireysel örneklerden viral RNA'nın tekrarlanabilir, kantitatif tespitini sağlar.
- Analizler: Karşılaştırmalı analiz ve uyumluluk için coğrafi ve LIMS tabanlı verileri entegre eder.
- Translasyonel Araştırma: Halk sağlığı biyobelirteç hizalaması ve salgın yanıt stratejilerine temel oluşturur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Gelecekteki patojen sürveyans girişimleri için ölçeklenebilir ve uyarlanabilir bir platform kurar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Çevresel risk değerlendirmesi ve hedef doğrulamada öngörüsel güveni artırır.
- Operasyonel Değer: Kaynak kısıtlamaları altında standartlaştırılmış, ölçeklenebilir örnekleme ve tespit imkanı sağlar.
- Stratejik Değer: Sürveyans yayılımı ve müdahale önceliklendirmesi için verilen devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Sürveyans ve tanı aracı geliştirilmesinin riskle uyumlu önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Moleküler tanı ve çevresel örnekleme protokollerinde uzmanlık gerektirir.
- Temel laboratuvar altyapısına ve veri yönetimi için LIMS erişimine ihtiyaç duyar.
- Örnek toplama, işleme ve veri raporlama için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Minimum malzeme gereksinimleri ile çeşitli kentsel ve toplumsal ortamlara uyarlanabilir.
- Saptama viral RNA ile sınırlıdır; canlılık çalışmaları gerekli bir sonraki adımdır.
