Ganglioside Ekstraksiyonu, Saflaştırma ve Profilleme

Gangliosidler tüm omurgalı hücre yüzeylerinde eksprese edilir ve özellikle sinir hücrelerinde bol miktarda bulunur. Hücre sinyalizasyonunu ve hücre-hücre tanımayı düzenlerler. Bu protokol ganglioside izolasyonu ve analizini tanıtmaktadır.

Teknikler, saflaştırmayı kolaylaştırırken büyük ve küçük ölçeklerde ganglioside verimini en üst düzeye çıkarmak için seçildi. Ayrıca, kalitatif ve yarı kantitatif gangliosid analizlerini nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirmek için yöntemler de açıklıyoruz. Lipitler, özellikle gangliosidler gibi polar lipitler üzerinde çalışmak, proteinler veya nükleik asitlerle çalışmaktan farklı araçlar ve teknikler gerektirir.

Bu video sizi bu moleküllerle nasıl çalışacağınız konusunda bilgilendiriyor. Kloroform ve tetrahidrofuran gibi çözücüler yaygın plastikleri çözdüğü için, bu prosedürler boyunca Teflon kaplı kapaklı cam şişeler ve şişeler, cam pipetler, cam, paslanmaz çelik mikroşırıngalar ve Teflon cam homojenizatörleri kullanıyoruz. Bunun yapılmaması, ürünlerde analizlere müdahale edebilecek plastik polimerlere neden olur.

Başlamak için, doku ıslak ağırlığının gramı başına 4.1 mililitre su ekleyin ve 10 vuruşla homojenleştirin. Gram doku başına 13 mililitre metanol ekleyin. 22 santigrat derece ortam sıcaklığına aktarın ve karıştırın.

Dokuyu PTFE astarlı vidalı kapaklı kalın duvarlı, cam, vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve iyice karıştırın. Gram doku başına 6,5 mililitre kloroform ekleyin, kapatın ve iyice karıştırın. 15 dakika boyunca 450 kez g'de santrifüj.

Daha sonra şeffaf süpernatantı taze, vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve hacmi geri kazanılan ekstrakt hacmi olarak ölçün. Bölümleme için, berrak süpernatana geri kazanılan ekstrakt su hacminin 0.173 katını ekleyin. Sonra kapağını kapatın.

Vorteksi kuvvetlice yapın. 15 dakika boyunca 450 kez g'de santrifüj. Gangliosidleri içeren üst fazı, PTFE astarlı vidalı kapaklı taze, cam bir tüpe aktarın.

Ters fazlı kartuş kromatografisi yapmak için, beş mililitrelik bir cam şırınga kullanarak bir tC18 katı fazlı ekstraksiyon kartuşunu üç mililitre metanol ile yıkayın. Daha sonra iki ila 43 ila 55 oranında üç mililitre kloroform-metanol su ekleyin. Önceki adımdaki üst fazı aynı cam şırıngadan tC18 kartuşuna yükleyin.

Akış akışını toplayın ve adsorpsiyonu optimize etmek için sütuna yeniden yükleyin. Kartuşu üç mililitre kloroform-metanol su ve ardından üç mililitre metanol su ile yıkayın. Gangliosidleri üç mililitre metanol ile taze, vidalı kapaklı bir tüp haline getirin.

45 santigrat dereceden daha düşük veya eşit bir sıcaklıkta yumuşak bir azot akışı altında kuruluğa buharlaştırın. Metanol içinde orijinal doku ıslak ağırlığının gramı başına bir mililitrede çözün. Bir karıştırıcıya 100 gram beyin gri maddesi yerleştirin ve gram başına bir mililitre beyin ıslak ağırlığı, pH 6.8'in soğutulmuş, 10 milimolar potasyum fosfat tamponunu ekleyin.

Daha sonra 20 saniye boyunca düşükte homojenize edin. Gram beyin ıslak ağırlığı başına sekiz mililitre tetrahidrofuran ekleyin ve 10 saniye boyunca düşük hızda homojenize edin. Cam santrifüj şişelerine dekant yapın ve 15 dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüj yapın.

Süper nantantı toplayın, hacmini ölçün ve ardından bir cam ayırıcı huniye aktarın. Süpernatanın mililitresi başına 0.3 mililitre etil eter ekleyin. Kuvvetlice sallayın.

Daha sonra, iki fazın, bir üst eter fazının ve bir alt sulu fazın ayrıldığı 30 dakika boyunca bozulmadan oturmasına izin verin. Gangliosidleri içeren alt fazı, PTFE astarlı kapaklı bir cam şişede toplayın. Ayırma hunisinde kalan üst eter fazına, önceki adımdan mililitre orijinal süpernatant başına 0.1 mililitre su ekleyin.

Kuvvetlice sallayın. Aşamaların ayrılmasına izin verin. Daha sonra alt sulu fazı toplayın ve daha önce toplanan alt faz ile birleştirin.

Kombine alt fazları kuru bir toza buharlaştırın ve tartın. Ters faz kromatografisi yapmak için, büyük ölçekli bir tC18 katı fazlı ekstraksiyon kartuşunu, yıkama başına bir dakikadan az bir süre vakum veya basınç kullanarak kolondan 50 mililitre çözücü geçirerek önceden yıkayın. Üst fazı, sabunlaşma sonrası faz ayrımından kolona vakum veya basınçla yükleyin.

Ardından akışı toplayın, yeniden yükleyin ve sonraki analizler için akışı yeniden toplayın. Kolonu her biri 30 mililitre kloroform-metanol su, ardından metanol su ile yıkayın. Daha sonra gangliosidleri 50 mililitre metanol ile ve daha sonra tekrar 10 mililitre metanol ile süzün.

Her yıkama ve elüsyonu ayrı ayrı toplayın. Gangliosidlerin akışta bulunmadığını doğrulamak için ince tabaka kromatografisi veya TLC kullanın ve metanolün ilk elüsyonunda yıkayıp salınımını yapın. Salınımlı gangliosidleri kuru bir toza buharlaştırın ve tartın.

TLC'yi gerçekleştirmek için, çalışan çözücüyü, çözücü derinliği 0,5 santimetre olacak şekilde paslanmaz çelik kapaklı 10 x 10 santimetrelik bir cam TLC odasına dökün. Odayı örtün ve yaklaşık 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Metanol kullanarak 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasını eğimli bir iğne ile yıkayın.

İğnenin ölü hacmini doldurmak için bir mikrolitre metanolü bir cam şırıngaya ve ardından bir mikrolitre numune veya standart olarak çekin. Şırıngada bir mikrolitreden az metanol çözücü kalana kadar numuneyi beş milimetrelik, önceden işaretlenmiş çizgiler üzerine eşit şekilde yerleştirin. Tüm numuneler tespit edildikten sonra plakanın 22 santigrat derecede kurumasına izin verin.

Benekli ve kurutulmuş plakayı, alt kenarı çalışan çözücüye batırılmış olacak şekilde önceden dengelenmiş TLC odasına yerleştirin. Solvent önü plakanın üst kısmından bir santimetre içeri ulaşana kadar çalışan çözücünün kılcal hareketle plakayı yukarı doğru ilerletmesine izin verin. Plakanın kenarındaki çözücü önünü çıkarın ve bir kalemle işaretleyin.

Çözücülerin bozulmadan veya hafif hava akışı altında tamamen buharlaşmasına izin verin. Kimyasal bir duman davlumbazında, davlumbazın duvarlarını asit spreyinden korumak için çözülmüş gangliosid kökenli TLC plakasını kesilmiş bir karton kutuya baş aşağı yerleştirin. Resorsinol sprey reaktifini bir cam TLC püskürtücüye yerleştirin.

Bir basınçlı azot kaynağına takın ve plakayı dikey ve yatay yönlerde çapraz olarak hafifçe püskürtün. Plakayı hemen aynı boyutlarda temiz, kuru, cam bir kapak plakasıyla örtün ve kapak plakasını bağlayıcı klipslerle yerine sabitleyin. Kapalı plakayı 20 dakika boyunca 125 santigrat derecede ısıtın.

Gangliosidler beyaz bir arka plana karşı koyu mor görünecektir. Lipid boyama işlemini gerçekleştirmek için, TLC plakasını, çözülmüş gangliosid orijinli tarafı aşağı doğru olan anisaldehit boyası içeren bir beherin içine batırın. İki saniyeden biraz fazla bir süre boyunca koşu cephesine daldırın.

Sonra boşalmasına izin verin. TLC plakasını bir sıcak plaka üzerinde düşük bir sıcaklıkta ısıtmak için ısıtın. Bu protokol, kalitatif ve kantitatif belirleme için yeterli miktarda ve saflıkta gangliosidler sağlar.

Bir mikrolitrenin TLC çözünürlüğü, resorsinol tespiti için yeterli malzeme sağlar ve vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş fareler için tüm büyük beyin gangliosidlerini çözer. Hazırlanan karışık gangliosidler diğer majör lipitlerden arındırılmış olmamakla birlikte, negatif modda doğal saflaştırılmış gangliosidler olarak veya pozitif modda pre-metilasyondan sonra kütle spektrometrik tayini için yeterli saflığa sahiptirler. Büyük ölçekli saflaştırma, biyolojik deneyler ve daha ileri kimyasal ve enzimatik modifikasyonlar için uygun saflaştırılmış majör beyin gangliosidleri sağlamak için ekstraksiyon, sabunlaştırma ve HPLC çözünürlüğünü içerir.

Örnek bir HPLC profili ve ardından gelen TLC analizleri gösterilmiştir. Alkali muamelesi veya sabunlaştırma, kirletici fosfolipitleri hidrolize etmek ve uzaklaştırmak için gereklidir, ancak aynı zamanda bazı bağlamlarda önemli olabilecek O-asetillenmiş sialik asitler gibi gangliosidlerin doğal modifikasyonlarını hidrolize edecektir. Ekstraksiyon, solvent bölümleme ve TLC çözünürlüğü için doğru çözücü oranları, geri kazanımı, saflığı ve analizleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir.

Kanserden metabolizmaya ve beyin fonksiyonuna kadar, gangliosidler fizyolojik değiştiriciler ve terapötik hedeflerdir. Ganglioside izolasyonu, saflaştırma ve analizler, biyomedikal keşif ve terapötik gelişim için temel taşlardır.