Name: Peptit Matrisi Bazlı HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitoplarının HBVye Özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Keşfedin kronik hepatit B enfeksiyonunda HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını peptit matrisi yöntemiyle analiz etmeyi. Bu protokol epitop tanımlama ve fonksiyonel alt kümelerin karakterizasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81930061), Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) ve Chinese Key tarafından desteklenmiştir. Enfeksiyon Hastalıkları için Uzmanlaşmış Proje (2018ZX10723203).

Çalışmaya dahil edilen her hastadan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Çalışma protokolü, Southwest Hastanesi tıp etik komitesinin önceden onayına yansıtıldığı şekilde 1975 Helsinki Bildirgesi'nin etik kurallarına uygundur.
1. HBV türevi peptit matrisinin tasarımı
<ol><li>HBV çekirdek antijeninin amino asit dizilerini NCBI veritabanlarından indirin (GenBank: AFY98989.1).</li>
	<li>Bir peptit sentezi servis sağlayıcısından HBV çekirdek antijen türevi peptitler (10 kalıntı, saflık &gt;% 90, 4 mg / peptit ile örtüşen 35 15-mer peptit paneli) satın alın.</li>
	<li>Matristeki her pozisyona sadece 1 peptit içeren kare 6×6 peptit matrisi kurun. 12 peptit havuzu vardır: 6 sıra peptit havuzu ve 6 sütunlu peptit havuzu, her havuzda 5-6 peptit16. Sıra peptit havuzları ve matristeki kolon peptit havuzları HBV çekirdek antijeninin 2 ayrı oluşumunu temsil eder.</li>
	<li>Satın alınan peptitlerin 3/4'ü için, matrisin aynı sırasındaki/sütunundaki peptitleri dimetil sülfit (DMSO) (her peptit için 2 μg/μL) içinde eriterek 12 ayrı peptit havuzuna karıştırın. HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi için -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Peptitlerin geri kalanını ayrı ayrı çözün (10 μg/μL) ve epitop tanımlaması için -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC' ler) izolasyonu
<ol><li>Kronik HBV enfeksiyonu hastalarından 5 mL venöz kan örneği. NOT: Kan hacmi peptit havuzlarının sayısı artı 1 arka plan kontrolü ve 1 pozitif kontrole göre kabaca tahmin edilmelidir. 1 peptit havuzunun analizi 3 x 105 PBMC'ye ihtiyaç duyar. Ortalama olarak, 1 mL kandan 1 x10 6 PBMC elde edilebilir.</li>
	<li>Ficoll yoğunluk gradyan santrifüjleme (800 × g, 20 dk) ve daha sonra kullanılmak üzere sıvı nitrojende izole EDILMIŞ PBMC'leri kullanarak PBMC'leri kandan izole edin.</li>
	<li>Açık Ficoll tabakası ile kırmızı kan hücresi tabakası arasında granülosit toplamak için bir Pasteur pipet kullanın. Üreticinin protokolüne göre genomik DNA saflaştırma kiti kullanarak granülositlerden genomik DNA çıkarın.</li>
	<li>HLA-DRB1 genotipini belirlemek için DNA örneğini genotip servis sağlayıcılarına gönderin.</li>
</ol>3. HBV Peptit Matrisi Kullanan PBMC'lerin In Vitro Genişlemesi
<ol><li>PBMC'leri çözün.<ol>
<li>Sıcak RPMI 1640, bir su banyosunda 1:10.000 benzonaz (25 U/mL) ila 37 °C ile desteklenmiştir. NOT: Benzonase, çözülme sırasında hücre topaklamayı sınırlamaya yardımcı olur. Her örnek benzonaz ile 20 mL RPMI 1640 gerektirecektir. Tüm örneklerin çözülmesi için gereken miktarı hesaplayın ve 1:10.000 Benzonaz (25 U/mL) ile ayrı bir ortam aliquot (37 °C) hazırlayın. Aynı anda en fazla 5 numuneyi çözün.</li>
		<li>Sıvı azottan numuneleri çıkarın ve donmuş şişeleri bir su banyosunda (37 °C) hızla çözün.</li>
		<li>Çözülmüş hücre süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 1 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) damla yönünde ekleyin. Santrifüj tüpüne yavaşça 6 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ekleyin, tüm hücreleri almak için diğer 2 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ile cryovial durulayın. Numunelerin geri kalanıyla mümkün olduğunca çabuk devam edin. NOT: Kriyoprezserved örneklerin yavaş seyreltilmesi, çözülmüş hücrelerin canlılığını korumanın anahtarıdır.</li>
		<li>Santrifüj (400 × g, 10 dk), süpernatantı çıkarın ve tüpe dokunarak peletı gevşetin.</li>
		<li>Peleti 1 mL sıcak Benzonase RPMI 1640'ta hafifçe yeniden bastırın. Yavaşça karıştırın ve gerekirse hücreleri 70 μm hücre süzgecinden (yani görünür bir küme varsa) filtreleyin.</li>
		<li>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) 10 μL süspansiyon ve seyreltin, Trypan mavisi ekleyin (%0,04), hemositometreye yükleyin, 1 dakika bekleyin ve canlı hücrelerin sayısını (net hücreler) sayın.</li>
		<li>Tüpe 9 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ekleyin, santrifüj (400 × g, 10 dk), süpernatantı çıkarın ve boruya dokunarak peletin gevşeyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPMI 1640'taki PBMC'leri 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve insan AB serumu (tam kültür ortamı) ile desteklenmiştir. Hücre yoğunluğunu 1,5 x 106 hücre/mL'ye ayarlayın. 3 x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda 96 kuyulu plakalarda (düz alt) PLAKA PBMC'leri.</li>
	<li>Her kuyuya HBV türevi peptit havuzları (her bir peptit için 2 μg/mL) ekleyin. Arka plan kontrolü ve pozitif kontrol kuyuları için aynı miktarda çözücü ekleyin (DMSO, 1 μL/mL). 10 U/mL IL-2 ve 10 ng/mL IL-7 ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatır.</li>
	<li>3. günde, IL-2'nin 50 U/mL'si ve IL-7'nin 10 ng/mL'si ile kültür ortamını tamamlar. NOT: 1- 3. gün arasında belirgin bir T hücre çoğalması gözlenmeyecektir. B hücreleri, NK hücreleri, NKT hücreleri ve monositler gibi T olmayan hücrelerin ölümü nedeniyle toplam hücre sayısı genellikle 1/3 ila 1/2 oranında azalacaktır.</li>
	<li>7. günde, kültür ortamının yarısını peptit (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) ve IL-7 (20 ng/mL) içeren taze ortamla değiştirin. NOT: Alttaki hücreleri rahatsız etmemek için pipet yaklaşık 90 μL kültür ortamı ortamın üstünden dikkatlice ortalar. 3 günden 7. güne kadar sağlam T hücre çoğalması gözlenecek ve çoğalan T hücreleri genellikle kümeler oluşturmak için toplanır.</li>
	<li>10. günde, hücre kümelerini parçalamak, canlı hücre sayısını saymak ve HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıt analizi için her kuyuda 2×105 hücreyi 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarmak için her kuyudaki hücre kültürünü 7-9 kez hafifçe pipetleyin.</li>
	<li>12. günde epitop tanımlaması için hücrelerin geri kalanını kültlü hale almaya devam edin, kültür ortamının hacmini 100 μL'ye ayarlayın (aşırı ortamı atma) ve peptitler (4 μg / mL), IL-2 (100 U / mL) ve IL-7 (20 ng / mL) içeren 100 μL taze tam kültür ortamı ile kültürü tamamlayın. NOT: 7 günden 10. güne kadar T hücreleri kuvvetli bir şekilde çoğalmaya devam ediyor. Ortam sararırsa, 3.5. Genel olarak, hücre sayısı 10×da 6×105'i geçecektir. Her kuyu genellikle benzer hücre numarasını gösterir, 3 kuyuda hücre numarasını sayar ve ortalama değeri tüm kuyular için hücre sayısının tahmini olarak kullanır.</li>
</ol>4. HBV'ye özgü CD4 T-Hücre yanıtlarının hücre içi akış sitometrisi ile analizi
<ol><li>Peptit havuzları ile PBMC'leri uyarma<ol>
<li>96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarılan hücreler için, bir tabakta 3 kez yıkayın (550 × g, 3 dk). Her yıkama için 200 μL orta kullanın (ilk 2 yıkama için RPMI 1640, son yıkama için tam kültür ortamı). Üstünlükleri atın. NOT: Kültürdeki artık sitokinlerin tekrar tekrar yıkanarak uzaklaştırılması hücre içi akış sitometrisi analizinde arka planı etkili bir şekilde azaltabilir.</li>
		<li>Belirli bir peptit havuzu ile uyarılan her hücre kuyusu için, aynı peptit havuzları ile desteklenmiş 200 μL tam kültür ortamı ekleyin (her bir peptit için 2 μg / mL). Arka plan kontrolü kuyusu için, 1 μL / mL DMSO ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin. Pozitif kontrol kuyusu için, 1 μL / mL DMSO, 150 ng / mL phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ve 1 μmol / L iyonomisitin ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin. NOT: Yüksek dozda DMSO, T hücrelerinin sitokin salgısını engelleyecektir (en önemlisi TNF-α için). 5 μL/mL'den yüksek DMSO dozu önerilmez. Genel olarak, deneyimizdeki DMSO dozu 1 μL / mL'yi geçmez.</li>
		<li>37 °C'de kuluçkaya yatır ve 6 saat boyunca%5 CO 2.</li>
		<li>1 saat kuluçkadan sonra, kültüre Monensin (1.37 μg / mL) ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış sitometrisi<ol>
<li>6 saat kuluçkadan sonra. Santrifüjlemeden sonra (550 × g, 3 dk) süpernatantı çıkarın, hücreleri 200 μL DPBS (550 × g, 3 dk), leke yüzeyi işaretleyicileri (CD3, CD4 ve CD8) ve canlılık işaretleyicisiyle (Düzeltilebilir Canlılık Boyası kullanarak) 4 °C buzdolabında 30 dakika boyunca bir kez yıkayın.</li>
		<li>200 μL DPBS (550 × g, 3 dk) ile bir kez yıkayın. Hücreleri sabitle ve permeabilize et ve hücre içi sitokinleri (TNF-α ve IFN-γ) 4 °C buzdolabında 45 dakika lekele.</li>
		<li>Hücre içi boyamada son yıkamadan sonra, hücreleri 150 μL akış sitomemetri tamponunda (DPBS +% 0,5 BSA) yeniden biriktirin.</li>
		<li>Akış sitometresinde akış sitomemetrisi verilerini alın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış sitometrisi sonuçlarının analizi<ol>
<li>Olumlu kuyunun tanımı: Arka plan kontrolünün en az iki katı kadar sitokin salgılayan bir sitokin sıklığına sahipse olumlu olarak düşünün(Şekil 1).</li>
		<li>Aşağıdaki formüle göre, analiz edilen her sitokin için yanıt oranını hesaplayın (Şekil 2): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62387/62387eq01.jpg"> NOT: Sıra peptit havuzu ve matristeki kolon peptit havuzları HBV çekirdek antijeninin 2 farklı oluşumunu temsil eder, bu nedenle nihai yanıt oranı 2'ye bölünmelidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. HBV'ye özgü HLA-DR Kısıtlı CD4 T hücreli Epitopların Tanımlanması
<ol><li>T-75 şişesinde (5-20 ×106 hücre, 20 mL tam kültür ortamında) allojenik B lenfoblastoid hücre hatlarını (BLCL' ler) çözün ve koruyun. NOT: BLCL'lerin iyi durumunu garanti etmek için, bu adım hastaların PBMC'lerinin çözülmesinden 2 hafta önce başlatılmalıdır. Genotipleme sonucuna göre, hastalar BLCL'ler ile aynı HLA-DRB1 alelesini paylaşmalıdır.</li>
	<li>Kimlik tespiti için aday peptitlerin taranır (Şekil 3)<ol>
<li>10. gün T hücre yanıt oranı sonuçlarına göre, en yüksek yanıt oranına sahip 2 peptit havuzunu (1 sıra peptit havuzu ve 1 sütun peptit havuzu) tarayın.</li>
		<li>Bu peptidi içeren diğer peptit havuzu da T hücre yanıt analizinde olumlu bir sonuç gösteriyorsa, bu 2 havuzdaki peptidi aday peptit olarak ayarlayın. Daha sonra epitop tanımlaması için diğer peptit havuzuyla genişletilen PBMC'leri kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peptit ile zonklayan BLCL'ler<ol>
<li>12. günde, uygulanabilir BLCL sayısını sayın, hücreleri 15 mL santrifüj tüplerine, santrifüje (350 × g, 10 dk) aktarın ve süpernatantı çıkarın. Hücre peletini tam kültür ortamında ve aliquot BLCL'leri 80 μL tam kültür ortamında 4×104 hücre / kuyuda 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) yeniden biriktirin.</li>
		<li>Tek bir peptit (10 μg/ mL) ekleyin, 37 °C'de kuluçkaya yaslanın ve 2 saat boyunca%5 CO 2. Set 2 arka plan kontrolü: HLA-DR blokajı ile peptit titreşimi (1 saat boyunca anti-HLA-DR (10 μg / mL) ile ön işlem); DMSO (1 μL/mL) titreşim. Her kuyudaki tam kültür ortamının son hacmi 100 μL'dir.</li>
		<li>Mitomycin C (100 μg/mL) ekleyin, 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve 1 saat boyunca% 5 CO2 ekleyin.</li>
		<li>Darbesiz peptit ve mitomycin C'yi çıkarmak için bir plakada 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 dk) ile 3 kez yıkayın. İlk yıkama için kuluçka kültürünü 100 μL RPMI 1640 ile tamamlar.</li>
		<li>Hücreleri 120 μL tam kültür ortamında yeniden biriktirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PEPTİt darbeli BLCL'lerle PBMC'leri uyarmak.<ol>
<li>12. günde PBMC'leri 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarın.</li>
		<li>Bir tabakta santrifüjlemeden (550 × g, 3 dk) sonra süpernatantı çıkarın, bir tabakta 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 dk) ile iki kez yıkayın. NOT: Kültürdeki artık sitokin ve peptitlerin tekrar tekrar yıkanarak uzaklaştırılması hücre içi akış sitotmetrisi analizinde arka planı azaltmak için anahtar adımdır. Özellikle artık peptitler için BLCL'lere bağlanır ve arka planı önemli ölçüde arttırır.</li>
		<li>PBMC'leri her kuyuda 210 μL tam kültür ortamıyla yeniden kullanılabilir.</li>
		<li>Epitop tanımlama için seçilen PBMC'lerin kuyusu için, aliquot'u (her biri 70 μL) peptit darbeli BLCL'lerle (2 arka plan kontrolü dahil 3 kuyu) karıştırın. NOT: 12. günde, genişletilmiş PBMC'lerin sayısı genellikle kuyu başına 5-7×105'in üzerine ulaşır, bu nedenle PBMC/BLCL'lerin oranı yaklaşık 6/1 ila 4/1'dir.</li>
		<li>37 °C'de kuluçkaya yatır ve 6 saat boyunca%5 CO 2.</li>
		<li>1 saat kuluçkadan sonra, kültüre Monensin (1.37 μg / mL) ekleyin. Her kuyudaki tam kültür ortamının son hacmi 200 μL'dir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış sitometrisi<ol>
<li>4.2. adımdakiyle aynı işlemleri yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış sitometrisi sonuçlarının analizi<ol>
<li>Bu peptit darbeli BLCC'lerle inkübe edilen PBMC'ler, arka plan kontrolleri ile inkübe edilen PBMC'lerin en az iki kez SITokin salgılayan CD4 T hücrelerinin bir frekansını gösteriyorsa, bir peptidi HLA-DR kısıtlı CD4 T hücreleri epitopu olarak doğrulayın (HLA-DR ön blokajı ile peptit titreşimi; DMSO titreşimi) (Şekil 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+T-cell+epitopes+in+hepatitis+B+virus%3A+identification%2C+genotypic+variation+and+relevance+to+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Therapy%22%5BJournal%5D)">A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics.</a> Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).</li>
<li>Mizukoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+responses+to+the+hepatitis+B+virus+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase.</a> Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).</li>
<li>Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CD137+to+study+the+full+repertoire+of+CD8%2B+T+cells+without+the+need+to+know+epitope+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities.</a> Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).</li>
<li>Reiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+activation+induced+marker+%28AIM%29+assays+for+sensitive+identification+of+antigen-specific+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells.</a> PLoS One. 12, 0186998(2017).</li>
<li>Herati, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successive+annual+influenza+vaccination+induces+a+recurrent+oligoclonotypic+memory+response+in+circulating+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells.</a> Science Immunology. 2, (2017).</li>
<li>Bowyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+Markers+Detect+Vaccine-Specific+CD4%2B+T+Cell+Responses+Not+Measured+by+Assays+Conventionally+Used+in+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials.</a> Vaccines. 6, (2018).</li>
<li>Morou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+differentiation+is+central+to+HIV-specific+CD4%28%2B%29+T+cell+dysfunction+in+progressive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease.</a> Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).</li>
<li>Grifoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targets+of+T+Cell+Responses+to+SARS-CoV-2+Coronavirus+in+Humans+with+COVID-19+Disease+and+Unexposed+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals.</a> Cell. 181, 1489-1501 (2020).</li>
<li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+Regulatory+and+Cytotoxic+SARS-CoV-2-Reactive+CD4%2B+T+Cells+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19.</a> Cell. , (2020).</li>
<li>Boni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hepatitis+B+virus+%28HBV%29-specific+T-cell+dysfunction+in+chronic+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection.</a> Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).</li>
<li>Chang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+hepatitis+B+virus+%28HBV%29-specific+CD4%2B+T-cell+responses+in+human+immunodeficiency+virus+type+1-HBV-coinfected+individuals+receiving+HBV-active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).</li>
<li>Boni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restored+Function+of+HBV-Specific+T+Cells+After+Long-term+Effective+Therapy+With+Nucleos%28t%29ide+Analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues.</a> Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).</li>
<li>Kennedy, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+T-cell+function+in+children+and+young+adults+with+immune-tolerant+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).</li>
<li>de Niet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+T+cell+function+in+chronic+hepatitis+B+patients+upon+treatment+with+interferon+based+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy.</a> Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).</li>
<li>Rinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus-specific+T+cell+responses+after+stopping+nucleos%28t%29ide+analogue+therapy+in+HBeAg-negative+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B.</a> Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1%2FIFN-%CE%B3+profile+of+HBV-specific+CD4+T+cells+is+associated+with+liver+damage+and+viral+clearance+in+chronic+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection.</a> Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).</li>
<li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li>
<li>Anthony, D. D., Lehmann, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+epitope+mapping+using+the+ELISPOT+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach.</a> Methods. 29, 260-269 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokoldeki en kritik adımlar şu şekilde listelenmiştir: 1) PBMC genişlemesini başlatmak için yeterli yüksek uygulanabilirlik PBMC'leri; 2) PBMC genişlemesi için uygun ortam; ve 3) EPITOP TANıMLAMASINDAN ÖNCE PBMC kültüründe artık peptit havuzlarının tamamen çıkarılması.
Bu protokoldeki tüm analizler CD4 T hücrelerinin sağlam çoğalmasına bağlıdır. Genel olarak, 10 günlük genişlemeden sonra PBMC sayısı ilk sayının 2-3 katı olacaktır. PBMC'lerin hücre numarası ve uygulanabilirliği PBMC'lerin...

Şu anda antijene özgü T hücrelerini analiz etmek için 3 ana yaklaşım bulunmaktadır. İlk yaklaşım, T hücre reseptörü ile peptit (epitop) arasındaki etkileşime dayanır. Antijene özgü T hücreleri doğrudan peptit-majör histocompatibility complex (MHC) multimerleri ile boyanabilir. Bu yöntemin avantajı, aşağı akış transkriptomik / metabolomik analizi için uygun canlı antijene özgü T hücreleri elde etmenindir. Bu yöntemin bir sınırlaması, belirli bir antijen için tanımlanmış epitopların sayısı şimdilik sınırlıyken, doğrulanmış epitop peptitleri gerektirdiğinden, belirli bir antijene tüm T hücresi yanıtı hakkında bilgi sağlayamamış olmasıdır. Hepatit B virüsüne (HBV) özgü CD8 T hücreli epitoplarla karşılaştırıldığında, HBV'ye özgü CD4 T hücre epitopları1,2olaraktanımlanmıştır,bu da bu yöntemi şu anda HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin analizi için daha az uygulanabilir hale getirmiştir.
İkinci yaklaşım, antijen peptit stimülasyonundan sonra bir dizi aktivasyon kaynaklı belirtecin yukarı doğrulasyonuna dayanır3. Yaygın olarak kullanılan belirteçler CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4'leriiçerir. Bu yöntem artık aşılanmış bireylerde antijene özgü T hücre yanıtlarını analiz etmek için kullanılmıştır5,6, İnsan İmmün Yetmezlik Virüs enfeksiyonu hastaları7ve Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2 enfeksiyon hastaları8,9. Peptit-MHC multimers bazlı testlerin aksine, bu yöntem doğrulanmış epitoplar tarafından kısıtlanmamıştır ve aşağı akış analizi için uygulanabilir hücreler elde edebilir. Bu yöntemin bir sınırlaması, antijene özgü T hücrelerinin sitokin profili hakkında bilgi sağlayamamasıdır. Ayrıca, bu aktivasyon kaynaklı belirteçlerin bazı aktif antijen içermeyen hücreler tarafından ifade edilmesi, analizdeki arka plan sinyallerine katkıda bulunabilir, bu da özellikle hedef antijene özgü T hücreleri nadir olduğunda bir sorun olabilir. Şu anda, bu yöntemin HBV'ye özgü CD4 T hücreleri4üzerinde sınırlı uygulanması vardır. Bu yöntemin HBV'ye özgü CD4 T hücrelerini güvenilir bir şekilde analiz etmek için kullanılıp kullanılamayacağı daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyar.
Üçüncü yaklaşım antijen peptit stimülasyonundan sonra sitokin salgısına dayanır. Aktivasyon kaynaklı işaret tabanlı analiz gibi, bu yöntem de doğrulanmış epitoplar tarafından kısıtlanmamıştır. Bu yöntem antijene özgü T hücrelerinin sitokin profilini doğrudan ortaya çıkardı. Bu yöntemin hassasiyeti, antijene özgü T hücrelerinin sitokin salgılanmasına dayandığı ve test edilen sitokin sayısı genellikle sınırlı olduğu için aktivasyon kaynaklı belirteç bazlı yöntemden daha düşüktür. Şu anda, bu yöntem HBV'ye özgü T hücrelerinin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Sitokin salgılayan HBV'ye özgü T hücreleri doğrudan ex vivo peptid stimülasyonu ile neredeyse tespit edilemediğinden10,11, HBV'ye özgü T hücrelerinin sitokin profili genellikle 10 günlük in vitro peptidin uyarılmış genişlemesi12 , 13,14,15,16'dan sonra analiz edilir. Peptit havuzlarının matris formunda düzenlenmesi, antijene özgü epitopların tanımlanmasını kolaylaştırmak için kullanılmıştır17,18. Peptit matrisi ve sitokin salgı analizinin kombinasyonu ile HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmek ve HBV'ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamak için bir yöntem geliştirilmiştir16. Bu protokolde, bu yöntemin ayrıntıları açıklanmıştır. HBV çekirdek antijeni bu protokolde bir gösteri örneği olarak seçilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Albümin Sığır V (BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST023</td><td></td></tr><tr><td>APC-konjuge Anti-insan TNF-&alfa;</td><td>eBioscience</td><td>17-7349-82</td><td>Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>Benzonaz Nükleaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Hücre kümelenmesini sınırlayın</td></tr><tr><td>B lenfoblastoid hücre hatları (BLCL'ler)</td><td>FRED HUTCHINSON KANSER ARAŞTIRMA MERKEZİ</td> IHW09126 <td></td><td>HLA-DRB1*0803 homozigot</td></tr><tr><td>B lenfoblastoid hücre hatları (BLCL'ler)</td><td>FRED HUTCHINSON KANSER ARAŞTIRMA MERKEZİ</td><td></td> IHW09121 <td>HLA-DRB1*1202 homozigot</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Şişesi (T75)</td> <td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Plakası (96 oyuklu, düz dipli)</td> <td>Corning</td><td>3599</td><td>Düz tabanlı</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Plakası (96 oyuklu, yuvarlak tabanlı)</td> <td>Corning</td><td>3799</td><td>Yuvarlak tabanlı</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci</td><td>Corning</td><td></td><td>CLS431751 Gözenek boyutu 70 &nbsp; &mu; m, beyaz, steril</td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpü (15 mL)</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpü (50 mL)</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Santrifüj, Soğutmalı</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj, Soğutmalı</td><td>Thermo</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj, Soğutmalı</td><td>Thermo</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kiti (Transkripsiyon Faktörü Tampon Seti)</td><td>BD Biosciences</td><td>562574</td><td>Kullanmadan önce çözeltiyi hazırlayın</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Kristalleşmeyi önlemek için oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuzlu Sal</td><td></td><td></td><td>NaCl <8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) ve Na2HPO4.7H2O (2160 nbsp; mg) içeren ddH sub <> / sub >O (1000 ml) hazırlayın. PH'ı 7.4'e ayarlayın. Otoklav ile sterilize edin.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Uçları (0.5-10)</td><td>Kirgen</td><td>KG5131</td><td>Steril Filtre Uçları</td></tr><tr><td>(100-1000)</td><td>Kirgen</td><td>KG5333</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Filtre Uçları (1-200)</td><td>Kirgen</td><td>KG5233</td><td>Steril</td></tr><tr><td>FITC konjuge Anti-insan CD4</td><td>BioLegend</td><td>300506</td><td>Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>GolgiStop Protein Taşıma İnhibitörü (Monensin İçeren)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>Protein Taşıma İnhibitörü</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Marka</td><td>718620</td><td></td></tr><tr><td>HBV Çekirdek Antijen Türetilmiş Peptitler</td><td>ChinaPeptides</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>İnsan Serumu AB</td><td>İkizler Biyo-Ürünler</td><td>100-51</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>İyonomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395-0500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100781-0500</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Akış Sitometresi</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpü (1.5 mL)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td> Mikroplaka Çalkalayıcıları <td>kullanmadan önce otoklavlanmış sterilizasyon</td></tr><tr><td></td><td>Bilimsel Endüstriler MicroPlate</td><td>Genie</td><td></td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100348-0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241-0500</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tüpleri (0.2 mL)</td><td>Kirgen</td><td>KG2331</td><td></td></tr><tr><td>PE / Cy7-konjuge Anti-insan CD8</td><td>BioLegend</td><td>300914</td><td>Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>PE konjuge Anti-insan IFN-&gama;</td><td>eBioscience</td><td>12-7319-42</td><td>Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Gibco</td><td></td><td>15140122 100 ml</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-konjuge Anti-insan CD3</td><td>eBioscience</td><td>45-0037-42</td><td>Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Orta 1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat, 100mM</td><td>Gibco</td><td>15360070</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke (% 0.4)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Saflaştırılmış Anti-insan HLA-DR</td><td>BioLegend</td><td>307648</td><td></td></tr><tr><td>Sihirbazı Genomik DNA Arıtma Kiti</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

peptit matrisi bazlı hla-dr-restricted cd4 t-cell epitoplarının hbv'ye Özgü cd4 t hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

CD4 T hücreleri kronik hepatit B patogenezinde önemli roller oynar. Çok yönlü bir hücre popülasyonu olarak, CD4 T hücreleri salgıladıkları sitokinlere göre farklı fonksiyonel alt kümeler olarak sınıflandırılmıştır: örneğin, CD4 T yardımcı 1 hücreleri için IFN-γ, CD4 T yardımcı 2 hücreleri için IL-4 ve IL-13, CD4 T foliküler yardımcı hücreler için IL-21 ve CD4 T yardımcı 17 hücre için IL-17. Hepatit B virüsüne (HBV) özgü CD4 T hücrelerinin HBV türevi peptit stimülasyonundan sonra sitokin salgısına dayalı analizi, sadece HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtının büyüklüğü hakkında değil, aynı zamanda HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin fonksiyonel alt kümeleri hakkında da bilgi sağlayabilir. Transkriptomik ve metabolomik analiz gibi yeni yaklaşımlar, HBV'ye özgü CD4 T hücreleri hakkında daha ayrıntılı işlevsel bilgiler sağlayabilir. Bu yaklaşımlar genellikle peptit majör histocompatibility complex-II multimers baz alınarak uygulanabilir HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin izolasyonunu gerektirirken, şu anda HBV'ye özgü CD4 T hücreli epitoplar hakkındaki bilgiler sınırlıdır. HBV türevi peptit matrisine dayanarak, kronik HBV enfeksiyonu hastalarından periferik kan mononükleer hücre örnekleri kullanılarak HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmek ve HBV'ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamak için bir yöntem geliştirilmiştir.

Sitokin salgılayan CD4 T hücrelerinin sıklığı hem tek üreticilerin hem de çift üreticilerin toplamı olarak hesaplanır. Şekil 1'degösterildiği gibi, TNF-α CD4 T hücrelerini salgılama sıklığı ve arka plan kontrolünde (DMSO) CD4 T hücrelerini salgılayan IFN-γ sıklığı sırasıyla% 0.154 ve% 0.013'tür. TNF-α cd4 T hücrelerinin salgılanması sıklığı ve PEPTİT HAVUZU Core11'e özgü IFN-γ salgılayan CD4 T hücrelerinin sıklığı sırasıyla 0.206 ve 0.017'dir, bu nedenle hem TNF-α cd4 T hücre yanıtını salgıl...

Hepatit B virüsü (HBV) türevi peptit matrisi baz alınarak, HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtları HBV'ye özgü CD4 T hücreli epitopların tanımlanmasına paralel olarak değerlendirilebilir.

Peptit Matrisi Bazlı HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitoplarının HBV'ye Özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

Kronik HBV enfeksiyonunda, CD4 T hücreleri hem viral boşlukta hem de geri dönenlerde önemli roller oynar. Bu yöntem, HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmemizi ve HBV'ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamamızı sağlar. Prosedürü gösteren jianmei Xiao, bir araştırma asistanı.Ve Xing Wan, Bilao'dan bir teknisyen. Başlamak için, 20 dakika boyunca 800 kez G'de Ficoll yoğunluk gradyan santrifüjleme kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerini veya PBMC'leri kandan izole edin. Daha sonra, bir pastör pipet kullanarak granülositleri ve kırmızı kan hücresi tabakası arasında toplayın.Çözülmüş hücre süspansiyonu 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarın, Önceden ısıtılmış Benzonase RPMI 1640'ın bir mililitresini ekleyin, akıllıca bırakın, sonra yavaşça altı mililitre daha ekleyin. Kalan hücreleri almak için kriyo şişesini iki mililitre Benzonase RPMI 1640 ile durulayın. Daha sonra tüpü 10 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin.Üstnatantı çıkarın ve tüpe dokunarak peletin gevşeyin. Peleti bir mililitre sıcak Bensenase NACE RPMI 1640'ta hafifçe yeniden askıya alın. Hücreleri hafifçe karıştırın ve herhangi bir hücre topaklanması görünüyorsa, 70 mikrometre hücre süzgecinden filtreleyin.Trippan mavisi ve hemositometre kullanarak uygulanabilir hücreleri sayın. Mililitre IL2 başına 10 birim ve mililitre IL7 başına 10 nanogram içeren PBMC'leri ve komple kültür ortamını yeniden askıya alın. Mililitre başına 6 hücreye hücre yoğunluğunu 1,5x10 olarak ayarlayın.Daha sonra hücreleri 96-Kuyu düz alt plakalarda kuyu başına 3x10'luk bir yoğunlukta beşinci hücrelere plakalayın. Her Kuyuya hepatit B virüsü veya HBV türevi peptit havuzları ekleyin. Arka plan ve pozitif kontrol Wells için aynı miktarda çözücü ekleyin.Plakaları 37 santigrat derecede ve%5 karbondioksitte kuluçkaya yatır. Üçüncü günde, kültür ortamını IL2 mililitresi başına 50 birim ve IL7 mililitresi başına 10 nanogram ile tamamlar. Yedinci günde, kültür ortamının yarısını mililitre peptit başına dört mikrogram, mililitre IL2 başına 100 birim ve mililitre IL7 başına 20 nanogram içeren taze ortamla değiştirin.10. günde, hücre kümelerini toplamak için her Kuyudaki hücreleri yedi ila dokuz kez hafifçe pipetle. HPV'ye özgü CD4 T hücre yanıt analizi için 96 Kuyu yuvarlak alt plakanın her bir kuyusuna uygulanabilir hücre sayısını sayın ve beşinci hücrelere 2x10 aktarın. 96-Well düz alt plakadaki artık hücreler için, aşırı ortamı atarak kültür ortamının hacmini 100 mikrolitreye ayarlayın.Daha sonra, kültürü mililitre peptit başına dört mikrogram, mililitre IL2 başına 100 birim, mililitre IL7 başına 20 nanogram içeren 100 mikrolitre taze, tam kültür ortamı ile tamamlayın. 12. günde epitop tanımlaması için hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte kültlü hale devam edin. 96 Kuyu yuvarlak alt plakadaki hücreleri 200 mikrolitre RPMI 1640 ekleyerek, plakayı üç dakika boyunca 550 kez G'de santrifüjleyarak ve süpernatantı atarak yıkayın.Son yıkama için tam kültür ortamını kullanarak yıkamayı iki kez tekrarlayın. Belirli bir peptit havuzu ile uyarılan her hücre kuyusu için, aynı peptit havuzu ile desteklenmiş 200 mikrolitre tam kültür ortamı ekleyin. Arka Plan Kontrol Kuyusu için, mililitre başına bir mikrolitre DMSO ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin.Pozitif Kontrol Kuyusu için mililitre DMSO başına bir mikrolitre, mililitre PMA başına 150 nanogram ve iyonomisinin litresi başına bir mikromole ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede%5 karbondioksitte altı saat kuluçkaya yatır. Bir saatlik inkübasyondan sonra, kültüre mililitre monensin başına 1.37 mikrogram ekleyin.Altı saatlik inkübasyon tamamlandıktan sonra, plakayı üç dakika boyunca 550 kez G'de santrifüjleyin. Üstnatantı çıkarın ve hücreleri daha önce gösterildiği gibi 200 mikrolitre DPP ile bir kez yıkayın. CD3, CD4 ve CD8 yüzey belirteçleri ve canlılık işaretleyicisi için leke.Hücreleri vibratörle askıya aldıktan sonra plakayı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede soğutun. Plakayı 200 mikrolitre DPBS ile bir kez yıkadıktan sonra, hücreleri sabitleyin ve permeabilize edin, hücre içi sitokinler, TNF Alfa ve Interferon-gama için lekeleyin ve plakayı dört santigrat derecede 45 dakika soğutun. Hücreleri bir kez daha yıkayın ve 150 mikrolitre akış sitometri tamponunda yeniden askıya alın.Ardından, akış sitometresi kullanarak akış sitomemetri verilerini alın. Alerjenik B-lenfoblastoid hücre hatlarını veya BLCL'leri bir T-75 şişesinde koruyun. PBMC genişlemesinin 12.Hücreleri 10 dakika boyunca 350 kez G'de santrifüjleyin ve üst saltantı çıkarın. Hücre peletini ve tam kültür ortamını yeniden askıya alın. Daha sonra BLCL'leri kuyu başına dördüncü hücrelere 4x10'da 96-Well yuvarlak bir alt plakaya ve 80 mikrolitre tam kültür ortamına aliquot.Tek bir peptitin mililitresi başına 10 mikrogram ekleyin ve iki arka plan kontrolü ayarlayın. HLADR blokajı ile peptit titreşimi ve DMSO titreşimi. Plakaları iki saat boyunca 37 santigrat derece ve%5 karbondioksitle kuluçkaya yatır.Mililitre Mitomycin C başına 100 mikrogram ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir saat kuluçkaya yatırın. Plakası 200 mikrolitre RPMI 1640 ile üç kez yıkayarak itici peptidi ve Mitomisin C'yi çıkarın, ardından vibratör kullanarak hücreleri 120 mikrolitre tam kültür ortamında yeniden askıya alın. PBMC genişletmesinin 12.Plakadaki hücreleri santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi 200 mikrolitre RPMI 1640 ile iki kez yıkayın. PBMC'leri her kuyuda 210 mikrolitre tam kültür ortamıyla yeniden askıya alın. Epitop tanımlaması için seçilen PBMC Wells için, hücre süspansiyonunun 70 mikrolitresini aliquot ve iki arka plan kontrolü de dahil olmak üzere üç Kuyuda peptit darbeli BLCL'lerle karıştırın.Plakayı 37 santigrat derecede ve%5 karbondioksitle altı saat kuluçkaya yatır. Bir saatlik inkübasyondan sonra, kültüre mililitre monensin başına 1,37 mikrogram ekleyin ve her kuyudaki son hacmi tam kültür ortamı ile 200 mikrolitreye getirin. Bu temsili örnekte, peptid havuzu Core11 için TNF Alpha ve Interferon-gama salgılayan CD4 T hücre yanıtları, arka plan değerlerinin iki katından daha düşüktür, bu nedenle negatif olarak kabul edilir.Bu arada, peptit havuzu Core09 için yanıtlar arka planın iki katından daha yüksektir ve olumlu olarak kabul edilir. Gri arka plan, pozitif CD4 T hücre yanıtına sahip Wells'i ve epitop tanımlama için aday peptitlerin kırmızı ile belirtildiğini, Core01'in sütun peptit havuzlarındaki CD4T hücrelerini salgılayan hem TNF Alpha hem de Interferon-gama'dan değerlendirildiğinde en yüksek yanıt oranına sahip olduğunu gösterir. Bu peptit havuzunda C1 ila 15, C31 ila 45, C61 ila 75 ve C91 ila 105 peptitleri, bu peptitleri içeren peptit havuzlarının sırası da olumlu sonuçlar gösterdiğinden aday peptitler olarak ayarlanır.Peptit havuzları core07, 08, 09 ve 10 ile genişletilen PBMC'ler, bu peptitlerin epitop tanımlaması için kullanılır. Benzer şekilde, Core09 satır peptit havuzlarında en yüksek yanıt oranına sahiptir. Bu havuzdaki tüm peptitler aday peptitler olarak ayarlanır ve peptit havuzları ile genişletilen PBMC'ler:Core01, 02, 03, 04, 05 ve 06 bu peptitlerin epitop tanımlaması için kullanılır.Peptit havuzu Core08 genişletilmiş PBMC'ler için, peptit C31 ile 45 darbeli BLCL ile uyarılmadan sonra, TNF Alpha ve Interferon-gama salgılayan CD4 T hücrelerinin frekansları arka plan kontrollerinden iki kat daha yüksektir. Bu nedenle, peptit C31 ila 45 doğrulanmış bir HLADR sınırlı CD4 T hücre epitopsudur. Oradaydı, epitop tanımlamadan sonra kalan ek genişletilmiş PBMC'ler.Tanımlanan epitopların ince işaretlemesi kısaltılmış peptitlerden oluşan bir panel kullanılarak yapılabilir.

analysis-hbv-specific-cd4-t-cell-responses-identification-hla-dr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.

Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

İnsan papillomaviri gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlerin T-hücresi epitoplarının karakterizasyonu, dolaşımdaki T hücresi sayısının sınırlı olması nedeniyle zorludur. Nadir T hücrelerinin, çok az sayıdaki hücreden başlanarak izole edildiği ve karakterize edildiği bir yöntem açıklanmıştır.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma...

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

Video, farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonunu inhibe etmek için insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi CD8+ T hücrelerinin kullanıldığı bir testi göstermektedir. HBV'ye özgü reseptörlerle tasarlanan bu T hücreleri, transgenik farelere aktarılır. Replikasyona yetkin HBV genom plazmitleri daha sonra doğrudan karaciğere enjekte edilerek viral DNA alımını sağlar. Viral antijenler hibrid MHC-I molekülleri tarafından eksprese edilip sunulduğunda, tasarlanmış T hücreleri bu...

Viral Antijene Özgü T Hücreleri Kullanılarak Hepatit B Virüsü Replikasyonunun Baskılanması

Rekombinant insan MHC II molekülleri ile biyokimyasal analizler hızlı, kantitatif immünojenik epitop tanımlaması içine anlayışlar, silme ya da tasarım sağlayabilir. Burada, 384 oyuklu plakalara ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Bu maliyet etkin biçim protein deimmunization ve aşı tasarım ve geliştirme alanlarında yararlı ispatlamak zorundadır.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Bozulmamış sınıf I HLA / peptit kompleksleri potansiyel ilgili kanser biyobelirteç temsil, kanser hücreleri tarafından dökülür. Monoklonal antikorlar, atkı aralığı MIF / HLA-A saptanmasını taklit etiketi içermeyen sensör teknolojisi ve T-hücresi reseptörü kullanmak * 02: MDA-MB-231 hücre süpernatantlan içinde 01 kompleksleri, insan serumu katıldı ve hastanın plazma gelişmesine olanak gösterilmektedir Bir roman kanseri teşhis platformu.

Etiket-ücretsiz Biyosensör Teknolojisi kullanılması Meme Kanserinde İnsan Lökosit Antijen BİYOMARKÖRLERİN Algılama

Burada, AIDS virüsü karşısında Rhesus macaque CD8 + T hücreleri, numaralandırma ve karakterize etmek için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu makale, HIV immünoloji alanında değil, aynı zamanda CD8 + T hücre yanıtları hastalık sonucunu etkileyebilecek bilinen biyomedikal araştırmanın diğer bölgelerine sadece yararlıdır.

Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi + Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin

İnsan lökosit antijeni (HLA) serileri organ donörü ve alıcı çiftleri arasındaki uyuşmazlıklar antikor aracılıklı ret organ nakli yapılan en önemli nedeni vardır. Burada Anti-donör HLA alloantibodies organ alıcıları içinde soruşturma için bireysel bağış HLA dizileri üzerinde temel alan özel antijen diziler kullanımı mevcut.

Peptid diziler HLA Alloantibodies Organ nakli olarak algılanması için kişiselleştirilmiş

Bu iletişim kuralı açıklar tek zinciri MHC sınıf ı insan CD8 + T hücre aktivasyonu moleküler etkileşimlerde araştırmaya kompleksleri: mühendislik antijen sunan tek zincir ifade hücreleri nesil oluşturur, kültür insan CD8 + T hücre klonu ve T hücre aktivasyonu deneyler.

Tek zincir MHC Co-agonism insan CD8 + T hücre aktivasyonu içinde araştırmak için teknoloji kullanımı

Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.

Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar

Burada, MHC sınıf I ve sınıf II peptit komplekslerinin yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler sağlayan fare ve insan hücre çizgilerinden arındırılması için bir protokol sunuyoruz. Protokol, piyasada bulunan antikorları kullanarak numune hazırlamaya odaklanır.

İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

Keşfedin kronik hepatit B enfeksiyonunda HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını peptit matrisi yöntemiyle analiz etmeyi. Bu protokol epitop tanımlama ve fonksiyonel alt kümelerin karakterizasyonunu sağlar.

Peptit Matrisi Bazlı HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitoplarının HBV'ye Özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması

Daha fazla video keşfet