İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi, lazer cımbızına dayanan tek moleküllü bir tekniktir ve yük altındaki miyozin motorlarının kemomekaniğini en yüksek zaman çözünürlüğü ile araştırmayı mümkün kılar. Bu teknik, kuvvet yönü üzerinde tam kontrol ile motor etkileşiminin her aşamasında kuvveti sabit tutarak kuvvet üretiminde çok hızlı olayların araştırılmasını sağlar. Uygun ayarlamalar yapılarak, bu protokol, düzenlemeyi zorla ortaya çıkarmak için kinezinler ve dineinler de dahil olmak üzere diğer tür işlemsel motorlara kolayca uygulanabilir.

Bir dizi akusto-optik deflektörü doğrusal bir çeviriciye monte ettikten sonra, bir iris alın ve diyaframını objektif arka diyafram açıklığı boyutuna uyacak şekilde ayarlayın. Hedefi dişli objektif muhafazası üzerinde ortalanmış iris ile değiştirin. Piezo kristali tarafından bloke edilen ışının iristen sonra görülebilen kısmı görünene kadar çeviriciyi lazer ışınına doğru hareket ettirin ve ışın iris açıklığını tamamen doldurana kadar çevirmeni hafifçe geriye doğru çevirin.

Pentil asetat içinde silika boncuklar hazırlamak için, önce vorteks ve 30 saniyelik sonikasyon ile 1-1.5 mililitre aseton içinde 20 mikrolitre 1.2 mikron% 10 katı silika boncuk seyreltin. Sonikleştikten sonra, boncukları santrifüjleme ile toplayın ve boncuk peletini ikinci bir yıkama için 1 mililitre taze asetonda yeniden askıya alın. İkinci aseton yıkamadan sonra, boncukları aynı santrifüj koşulları altında yıkama başına 1 mililitre taze pentil asetat içinde üç kez yıkayın ve peleti 100 mikrolitre% 1 nitroselüloz ve 900 mikrolitre pentil asetat içinde yeniden askıya alın.

Daha sonra, camı doğrudan etanol içinde durulamak için temiz cımbız kullanmadan ve kapak kaymasının yumuşak azot akışı altında kurumasına izin vermeden önce 24 x 24 milimetrelik bir cam kapak kapağını dikkatlice silmek için saf bir etanol ıslatılmış laboratuvar mendili parçası kullanın. Vorteks ve hazırlanan silika boncuk stoğunu 30 saniye boyunca sonikleştirin ve 2 mikrolitre silika boncuk çözeltisini daha küçük kapak kaymasının yüzeyine bulaştırmak için etanolle temizlenmiş 24 x 60 milimetrelik bir kapak kayması kullanın. Boncuklar kururken, gösterildiği gibi 26 x 76 milimetrelik bir sürgüyü temizleyin ve kızağın uzun kenarlarına bantlanmış 3 milimetre çift taraflı iki adet 60-100 mikron kalınlığında çizgi yerleştirin.

Temiz cımbız kullanarak, boncuk kaplı kapak kayışını, boncuklar sürgülü odanın içine bakacak şekilde bant üzerine yerleştirin ve odayı 15 milimolar fosfat tamponu ve yüzer polistiren boncuk çözeltisi ile doldurun. Ardından, odayı silikon gres ile kapatın. Parlak alan kamerasının piksel-nanometre oranını kalibre etmek için, görüş alanının merkezinden yaklaşık 5 mikron uzaktaki kapak kayması yüzeyinde bir silika boncuğun ilk görüntüsünü elde edin.

Boncuğu 10 mikron görüş alanının merkezine doğru değiştirmek için sahne alanını hareket ettirin ve ikinci bir görüntü alın. Boncuğun iki konumu arasındaki piksel mesafesini ölçerek kamera kalibrasyon sabitini hesaplayın. Tuzak konumunu kalibre etmek için, tek bir yüzen parçacığı bir tuzakta yakalayın ve akusto-optik deflektörleri 0.2 megahertz adımlarında hareket ettirin, parçacığın bir görüntüsünü ve her adım için deflektörlerin karşılık gelen frekansını elde edin.

Ardından, ikinci tuzak için kalibrasyonu aynı şekilde tekrarlayın. Tuzak gücünü ve sertliğini kalibre etmek için, her tuzakta tek bir parçacığı yakalayın ve akusto-optik deflektörleri kullanarak her iki tuzağı da 0.2 megahertz adımlarla yerinden oynatın, Kadran Fotodiyot Dedektörleri ile her iki tuzakta parçacığın Brownian hareketini ve akusto-optik deflektörlerin karşılık gelen frekansını kaydedin. Bir Lorentzian fonksiyonunu kaydedilen Brownian hareketinin güç spektrumuna takarak kalibrasyon sabitleri elde edin.

Ölçüm için bir numuneyi bir araya getirmek için, kapak kayma yüzeyinde silika boncukları bulunan yeni bir odaya mililitre biyotinile BSA başına 1 miligram ekleyin. 5 dakika sonra, odayı AB tamponu ile yıkayın ve odaya mililitre streptavidin başına 1 miligram ekleyin. 5 dakika sonra, odayı gösterildiği gibi yıkayın ve 2 mikromolar Kalmodulin ile desteklenmiş M5B tamponuna 3 nanomolar biyotinile Miyosin-5B ağır meromiyozin ekleyin.

5 dakika sonra, odayı AB tamponunda 2 mikromolar Kalmodulin ile desteklenmiş mililitre başına 1 miligram biyotinillenmiş BSA ile üç kez yıkayın ve son yıkamadan sonra 3 dakika bekleyin. Reaksiyon karışımını akıtın ve odayı silikon gres ile kapatın. Numuneyi ölçmek için, odayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve yüzen alfa-aktinin boncukları odaklanana kadar hedefi hareket ettirin.

Bir tuzağı açın ve bir boncuğu yakalayın. İlk tuzak işgal edildikten sonra, birden fazla boncuğun yakalanmasını önlemek için sıkışmış boncuğu kapak kayması yüzeyine yakın konumlandırmak için çevirmeni hareket ettirin ve ikinci tuzağa bir boncuk yakalayın. Çözelti içinde en az 5 mikron uzunluğundaki aktin filamentlerini bulmak için numuneyi uzun menzilli çevirmenler aracılığıyla değiştirin.

Bir filament tespit edildiğinde, sıkışmış bir boncuğun filamentin bir ucuna yaklaşmasına izin vermek için numuneyi hareket ettirin. Filament bağlandıktan sonra, boncuğun mesafesini yaklaşık filament uzunluğuna ayarlayın ve bağlanmamış boncuk yönünde bir akış oluşturmak için sahneyi hareket ettirin. Filament akış tarafından gerilecek ve sonunda ikinci boncuğa bağlanacaktır.

Elde edilen komplekse dambıl denir"Aktin-miyozin teması kurmak için, iki tuzağı nazikçe ayırın ve filamenti yaklaşık 3 pikonewtona kadar ön gerilme seviyelerine ayarlayın. Dambılın sertliğini araştırmak için, bir akusto-optik deflektörün frekansını değiştirerek ve hareketin konum sinyali aracılığıyla takip eden boncuğa iletimini doğrulayarak üçgen bir dalgada bir tuzak salınımı yapın. Dambılın kaideli bir silika boncuğun yakınına yerleştirmek için sahneyi hareket ettirin ve dambılın yüksekliğini, aktin filamentinin silika boncuk yüzeyi ile temas etmesi için ayarlayın.

Bu temsili konum kaydında gözlemlendiği gibi, miyozin motoru aktin filamenti ile etkileşime girmediğinde, sıkışmış boncuklar çözeltinin viskoz sürükleme kuvvetine karşı sabit bir hızda hareket eder. Miyozin motoru filament ile etkileşime girmeye başladığında, hareketli filament tarafından taşınan kuvvet çok hızlı bir şekilde proteine aktarılır ve sistem hızı sıfıra düşer, adım atma olayları koşunun sonuna kadar sabit kuvvet altında gerçekleşir. Kuvvet, boncuk kullanıcı tarafından ayarlanan salınım aralığının kenarına ulaştığında kuvvet yönünü değiştiren geri besleme sistemi tarafından pozitiften negatif yöne geçirilir.

Miyozin filamenti pozitif yöne doğru bağladığında ve yerinden oynattığında, boncuğu salınım aralığının üst kenarına doğru iter. Bu yardımcı kuvvet altında gerçekleşirse, miyozin çalışması, salınım kenarındaki kuvvet yönü tersine çevrilmesi ile kesintiye uğrayacak ve koşunun uzunluğunu dambıl salınımının genliği ile sınırlayacaktır. Optik sistemin hassas hizalaması, optimum mekansal ve zamansal çözünürlüğü elde etmek için gereklidir, uygulanan kuvvetlerin değerlerini tam olarak belirlemek için doğru bir kalibrasyon gereklidir.

Bu teknik, DNA'daki transkripsiyon faktörlerinin kayan ve hedeflenen araştırmasının yanı sıra mikrotübül filamentleri üzerinde indüklenen mekanotransdüksiyon proteinleri arasındaki dinamik etkileşimleri incelemek için uyarlanmıştır.