Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

Bu metodoloji, civcivde retina gelişimi çalışmaları için bir fonksiyon kaybı yaklaşımı sağlar. Bu teknik, retinanın belirli bir bölgesindeki hedef genlerin hızlı ve kalıcı olarak baskılanmasını destekler. Bu yaklaşım, hem nöral hem de nöral olmayan dokular dahil olmak üzere civciv embriyosunun diğer kısımlarına da uygulanabilir.

Ovo elektroporasyon için, 25 miligram Fast Green FCF (Hızlı Yeşil FCF) 10 mililitre PBS içinde çözerek %0,25'lik bir Fast Green solüsyonu hazırlayın, ardından solüsyonu 0,2 mikronluk bir şırınga filtresi kullanarak süzün. Ardından, mikroRNA zümrüt GFP plazmidini Tol2 transpozaz ekspresyon plazmidi ile ikiye bir oranında karıştırarak DNA kokteyli enjeksiyon çözeltisini hazırlayın. Daha sonra enjekte edilen alanın görselleştirilmesi için hazırlanan Fast Green solüsyonunu DNA kokteyline bire 10 oranında ekleyin.

Ardından, mikroenjeksiyon aparatını kurun. Aparat, bir Hamilton şırıngası, 18 gauge iki inçlik bir iğne, iki santimetre uzunluğunda bir polivinil klorür borusu ve bir mikropipet iğnesinden oluşur. Hamilton şırıngasını ağır mineral yağ ile doldurun, ardından 18 gauge iğneyi şırıngaya takın ve şırınga pistonuna bastırarak iğnenin iç boşluğunu yağla doldurun.

Ardından, polivinil klorür borusunu iğnenin ucuna takın ve boruyu yağla doldurun. Çekilen mikropipet iğnesini boruya takın. Daha sonra ince forseps kullanarak diseksiyon mikroskobu altında, küçük bir açıklık yapmak için iğnenin ucunu 10 ila 20 mikrometre çapında kırın.

İğnenin tamamını yağ ile doldurun. Daha sonra, bir Petri kabına beş mikrolitre renkli DNA kokteyli koyun. Diseksiyon mikroskobu altında, mikropipet iğnesinin ucunu Petri kabındaki DNA çözeltisine yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça iğneye çekin.

İğnenin içindeki ve dışındaki basınç dengelendikten sonra, iğnenin ucunu DNA çözeltisinden çıkarın ve enjeksiyona kadar küçük bir beherde steril PBS'ye batırılmış halde tutun. Daha sonra elektroporasyon aparatını kurmak için, bir mikromanipülatör üzerinde bir elektrot tutucu ile bir çift platin elektrotu sıkıca ayarlayın. Elektrotların ucu arasındaki boşluğu iki milimetreye ayarlayın ve elektrotları kablolarla kare dalga darbe üretecine bağlayın.

Daha sonra, DNA mikroenjeksiyonu için, döllenmiş bir White Leghorn yumurtasını inkübatörden çıkarın ve yumurtanın yüzeyini %70 etanole batırılmış kağıt mendille silin. Daha sonra 10 mililitrelik bir şırıngaya 18 gauge iğne takın ve yumurta sarısına zarar vermemek için iğneyi yumurtanın kör ucundan aşağı doğru açılı olarak geçirin. Yumurtadan iki ila üç mililitre albümin çektikten sonra, deliği bir parça bantla kapatın ve embriyo ve vitellin zarının kabuktan ayrıldığından emin olmak için yumurtayı ışıkla mumlayın.

Daha sonra, forseps kullanarak, embriyoyu açığa çıkararak yumurtanın üstünden bir parça yumurta kabuğu çıkarın. Elektroporasyon sırasında embriyoların kurumasını önlemek için herhangi bir zamanda beşten fazla yumurtayı pencereye koymayın. İğnenin ucunu optik vezikülün içine proksimal tarafından 45 derecelik bir açıyla sokun ve mavi renkli çözelti lümeni doldurana kadar pistona yavaşça bastırarak DNA kokteylini enjekte edin.

İğneyi geri çekin ve ucunu tekrar PBS'ye yerleştirin. Elektroporasyon için darbe voltajını 15 volta, darbe uzunluğunu 15 milisaniyeye, darbe aralığını 915 milisaniyeye ve darbe sayısını beşe ayarlayın. Embriyo üzerindeki vitellin membranına birkaç damla HBSS ekledikten sonra, elektrotları embriyonun ön-arka eksenine dik olarak HBSS'ye indirmek için mikromanipülatörü kullanın.

Elektrotları optik vezikülün her iki tarafına yerleştirin, elektrotların embriyoya veya kan damarlarına temas etmemesini sağlayın, ardından darbeli elektrik alanları uygulayın. Elektroporasyon tamamlandıktan sonra elektrotları çıkarın ve albümin birikimini önlemek için elektrotları suya batırılmış steril bir pamuklu çubukla nazikçe temizleyin. Pencereyi bantla kapatın ve embriyoyu istenen gelişim aşamasına kadar yeniden inkübe edin.

Bireysel pre-mikroRNA dizilerinin HEK293T hücrelerini eksprese eden Nel AP'ye transfeksiyonu, 482 ila 502, 910 ila 930 ve 2461 ila 2481 nükleotidlerine karşı yapılar tarafından Nel ekspresyonunun önemli ölçüde baskılanmasına neden oldu. İki mikroRNA dizisinin zincirlenmesi, yıkım verimliliğini önemli ölçüde artırdı. Her üç kombinasyon da, zincirlenmemiş bireysel mikroRNA öncesi dizilere kıyasla gelişmiş baskılama aktiviteleri gösterdi.

Transfeksiyondan en az 13 gün sonra sağlam supresyon gözlendi. 482 ila 502 ve 2461 ila 2481 nükleotidlerini hedefleyen bir Nel pre-mikroRNA yapısı, transpozaz ekspresyon vektörü ile civciv retinasına birlikte transfekte edildiğinde, retinal pigment epitelindeki Nel ekspresyonu, embriyonik gün 4.5'te zümrüt GFP eksprese eden hücrelerde önemli ölçüde azaldı. Sekiz günlük embriyolarda, retinal ganglion hücrelerinde Nel ekspresyonu da azaldı.

Buna karşılık, retinadaki Nel ekspresyonu, kontrol mikroRNA'sının girişinden etkilenmedi. Bu işlemi takiben, hücre proliferasyonu ve farklılaşması, hücre ölümü, hücre ve akson takibi gibi çeşitli yöntemler kullanılarak hedef gen baskılanması üzerindeki etkiler incelenebilir.