Name: Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Öğrenin, Drosophila tükürük bezlerinde HP1 protein işaretleyicisi kullanarak heterokromatin kümelerini immünofluoresan boyama ile görselleştirme yöntemini. Bu protokol genetik mutantlarda kromatin yapısını değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Marco Antonio Rosales Vega ve Abel Segura'ya bazı konfokal görüntüleri aldıkları için, medya hazırlığı için Carmen Muñoz'a ve mikroskopların kullanımı konusunda tavsiyeler için LMNA'dan Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui ve Dr. Chris Wood'a teşekkür ederiz.

1. Üçüncü instar larva kültürü
<ol><li>100 g maya, 100 g arıtılmamış tam kamış şekeri, 16 g agar, 10 mL propiyonik asit ve 14 g jelatin ekleyerek 1 litre standart ortam hazırlayın. Maya hariç tüm malzemeleri 800 mL musluk suyunda çözün ve ardından mayayı çözün. 30 dakika boyunca hemen otoklavlayın.<ol>
<li>Daha sonra, ortamın 60 ° C'ye soğumasını bekleyin ve son konsantrasyona% 0.01 propiyonik asit ekleyin. Jelatin oluşana kadar şişeyi bekletin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3o instar larva kültürünü optimize etmek için, önce 5 ila 10 günlük yetişkinleri toplayın ve 50 'yi (25 erkek ve 25 kadın) geniş bir boyun standart medya şişesine yerleştirin.</li>
	<li>Sinekleri içeren şişeyi, yumurtlanan yumurta sayısı 50 olana kadar (vahşi tip suş için yaklaşık 12 saat) 25 ° C'de kontrollü bir sıcaklık inkübatörüne yerleştirin.</li>
	<li>Kuluçka süresi bittikten sonra, yetişkinleri çıkarın ve prosedürü tekrarlamak için yeni bir şişeye aktarın. Embriyoların 72 saat boyunca 18 °C'de büyümesine izin verin NOT: Drosophila stok bakım koşulları hakkında daha fazla şey için tennessen > Thymmel13'e bakın.</li>
</ol>2. Larva koleksiyonu
<ol><li>Larva koleksiyonu için hiç spiracles olmayan gezgin larvaları seçin. Spiracles'ın eversiyondan sonra larva prepupal aşamaya girer ve analiz için uygun mükemmel politen kromozomlarını korur. Sadece 12 saat sonra tükürük bezinin hücreleri programlanmış hücre ölümü için hazırlanmaya başlar14,15.</li>
	<li>On beş 3 ° başlangıç larvası alın ve yıkamak için bir saat camına koyun. Ardından bunları buz gibi bir tuzlu su çözeltisine veya PBS'ye aktarın (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH'ı 7,4'e ayarlayın).</li>
	<li>Stereoskopik mikroskop altında proteaz inhibitörleri ile soğuk PBS'de 15 ila 30 çift tükürük bezini (veya 30 dakikada mümkün olduğunca çok) parçalara ayrıştırın. Tükürük bezlerini buz gibi PBS ile 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>1 mL PBS artı proteaz inhibitörleri ile bir kez yıkayın. Dokunun tüpün dibine ulaşmasını bekleyin.</li>
	<li>Yıkamadan sonra PBS'yi 1000 μL pipetle çıkarın. Dokuya dokunmamaya dikkat edin.<ol>
<li>Alternatif olarak, bu yıkama adımına olan ihtiyacı ortadan kaldırmak için tükürük bezlerini 5 mL PBS'de parçalara ayrıştırın ve tükürük bezlerini aşağıda açıklanan Ruvkun sabitleme tamponunun 0,5 mL'sine aktararak 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tükürük bezi doku fiksasyonu
<ol><li>PBS'yi son adımdan çıkardıktan sonra, doğrudan% 50 metanol (0.5 mL metanol ekleyin) ve% 2 formaldehit ile 0.5 mL 1x Ruvkun sabitleme tamponu ekleyin. NOT: 2x Ruvkun çözeltisi 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, pH 7.4'te 30 mM BORULAR'dır.</li>
	<li>Hafif dönüş ile 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
</ol>4. Tükürük bezi doku yıkama
<ol><li>1 mL Tris/Triton tamponu (100 mM Tris pH 7,4, %1 Triton X-100 ve 1 mM EDTA) ile 5 dakikalık bir dönüş yıkaması gerçekleştirin. NOT: Dokunun tüpün altına ulaşmasını bekleyin.</li>
</ol>5. Permeabilizasyon
<ol><li>Tükürük bezlerini 1 mL Tris/Triton X-100'de kuluçkaya yatırın (yukarıdakiyle aynı). Bazı proteinler için% 1 β-mercaptoethanol eklemek gerekebilir.</li>
	<li>Hafif sallama (300 rpm) ile 37 ° C'de 2 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
</ol>6. Koruma adımı (isteğe bağlı)
NOT: Antikor ile hemen inkübasyona devam etmiyorsanız, dokuyu aşağıdaki gibi koruyun.
<ol><li>1 mL BO3 tamponu (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) ile yıkayın ve ardından37° C'de BO 3 /10 mM DTT'de hafif sallanarak (300 rpm) 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçka süresinin sonunda, sadece 1 mL BO3 tamponu ile bir yıkama gerçekleştirin. NOT: Dokunun tüpün altına ulaşmasını bekleyin.</li>
	<li>1 mL PBS ekleyin. Bu çözeltideki dokuyu 4 °C'de 72 saate kadar koruyun ve ardından bir sonraki adıma geçin. Bu adım, gecikmiş bir yaşam döngüsü sunabilecek farklı mutant suşlarıyla çalışırken özellikle yararlıdır, bu nedenle immünodeteksiyon kontrollerle birlikte aynı anda gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>7. Doku engelleme
<ol><li>Tükürük bezlerini 1 mL Tampon B'de (PBS + % 0.1 BSA + % 0.5 Triton X-100 + 1 mM EDTA) oda sıcaklığında 2 saat boyunca rotasyonla kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>8. İmmünasyon
<ol><li>Tüm B tamponlarını çıkarın ve A tamponu (PBS + % 0.1 BSA) artı faiz antikoru ekleyin. NOT: Hybridoma Bank'tan 1:3000'e kadar HP1a C1A9c (konsantre antikor) kullanıyoruz. C1A9'ları (supernatant) kullanırken 1:100 ila 1:500 seyreltmeyi denedik ve bu rütbe arasındaki herhangi bir seyreltme iyi çalışıyor) bir gecede 4 oC'de rotasyonla. Bu noktada, titremenin antikora zarar verebilecek kabarcıkları yükseltmemesi önemlidir.</li>
</ol>9. İmmünasyon yıkama
<ol><li>Her seferinde 1 mL kullanarak oda sıcaklığında karıştırma altında B tamponu ile 3 x 15 dakikalık yıkamalar gerçekleştirin.</li>
	<li>Bezleri B tamponu ile birlikte ikincil antikor ile birlikte 4 oC'de dönme altında 2 saat boyunca bir florofora aktarın (ikincil antikor Alexa flor 568 Invitrogen 1:3000 kullanıldı).<ol>
<li>İkincil antikorun ışıktan korunması için tüpü alüminyum kağıt folyo ile örtün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL Tampon B ile rotasyon sırasında oda sıcaklığında 2 x 15 dakikalık yıkamalar gerçekleştirin.</li>
	<li>Sytox (2 μL 5 mM stok alın ve 1 mL Tampon B'de çözün) veya Hoechst (10 mg/mL stokun 1 μL'sinde alın ve 1 mL Tampon B'de çözün) gibi bir DNA işaretleyicisi ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rotasyonla inkübte edin.</li>
	<li>B Tamponu ile bir yıkama yapın ve PBS ile bir kez, her biri oda sıcaklığında dönerken 10 dakika süren yıkama. NOT: Işıktan korumayı unutmayın.</li>
</ol>10. Görüntüleme
<ol><li>Tükürük bezlerini bir kaydırağa monte edin, kapaklı bir havuz haline getirin.</li>
	<li>Tükürük bezlerini havuzun ortasına koyun ve viskoz sıvıyı her yere uzatan kabarcıkların oluşumunu önlemek için AF1 citifluor ile örtün. Sonra tüm tarafları açık oje ile kapatın.</li>
	<li>Floresan veya konfokal mikroskop altında gözlemleyin. Numune aynı gün gözlemlenmeyecekse, 4 °C'de ışıktan uzak durun.</li>
	<li>Tüm grafikleri ve istatistiksel analizleri oluşturmak için GraphPad Prism 6'yı kullanın.</li>
	<li>Kruskal-Wallis testini kullanarak tükürük bezlerindeki HP1a dağılımından elde edilen verileri analiz edin. İstatistiksel önem (p < 0.05*, < 0.01 **, < 0.001***, < 0.0001**** olarak belirlendi.</li>
</ol>

<ol><li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emil+Heitz%2C+a+true+epigenetics+pioneer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572(2019).</li>
<li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+function+for+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li>
<li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li>
<li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+markers%3A+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin%2C+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li>
<li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1a%3A+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li>
<li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li>
<li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+%28VAR%293-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039(2002).</li>
<li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li>
<li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-effect+variegation%2C+heterochromatin+formation%2C+and+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li>
<li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1a%3A+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li>
<li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li>
<li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li>
<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1%CE%B1+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li>
<li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li>
<li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li>
<li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li>
<li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin%3A+Lessons+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li>
<li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li>
<li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li>
<li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li>
<li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).</li>
<li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li>
<li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeti%2C+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene%2C+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li>
<li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p8%2FTTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li>
<li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li>
<li>Farkaš, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+%282%29gl-dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li>
<li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li>
<li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyteny%3A+still+a+giant+player+in+chromosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Ökaryotik organizmaların hücresel işlevi, kromatin ile farklı proteinler ve RNA dahil olmak üzere çeşitli moleküller arasındaki etkileşimlerle desteklenen çekirdek içindeki 3D yapıyı tanımlayabilir. Son üç yılda, heterokromatin de dahil olmak üzere alaka düzeyi olan biyolojik kondensatlar, aktif ve baskıcı kromatin 16 , 17,18'inayrı nükleer mekansal organizasyonuna teşvik eden faz ayrımının belirlenmesinde temel bir rol üstlenmi...

Emil Heitz1'inilk çalışmalarından bu yana heterokromatin gen ekspresyonu, kromozomların meiotik ve mitotik ayrılması ve genom stabilitesinin korunması gibi hücresel süreçlerin önemli bir düzenleyicisi olarak kabul edilmiştir2,3,4.
Heterokromatin esas olarak iki türe ayrılır: karakteristik olarak tekrarlayan dizileri tanımlayan konsitutive heterokromatin ve telomerler ve centromeres gibi belirli kromozom bölgelerinde bulunan transpoze edilebilir elementler. Bu tür heterokromatin esas olarak H3 (H3K9me3) histone 9 lizin di veya tri-metilasyonu ve Heterokromatin proteini 1a (HP1a)5,6bağlanması gibi spesifik histone izleri ile epigenetik olarak tanımlanır. Öte yandan, öğretim üyesi heterokromatin kromozomun kollarında lokalize eder ve esas olarak gelişimsel olarak susturulmuş genlerden oluşur7,8. Metafaz hücrelerindeki heterokromatin bloklarının immünostainasyonu veya ara hücrelerdeki heterokromatin agregalarının gözlemlenmesi, heterokromatik bölgelerin oluşumu ve işlevinin anlaşılmasında çok fazla ışık ortaya çıkarmıştır9.
Drosophila'nın bir model sistemi olarak kullanılması, elektron mikroskopisi kullanmadan heterokromatin çalışması için gerekli aletlerin geliştirilmesine izin10. Pozisyon etkisi değişkenliğinin tanımlanması ve HP1a gibi heterokromatin ilişkili proteinlerin keşfi ve çeviri sonrası değişikliklerden bu yana, birçok grup bu heterokromatik bölgelerin görselleştirilmesine izin veren çeşitli immünohistokimyasal teknikler geliştirmiştir10,11.
Bu teknikler, heterokromatin ilişkili proteinleri veya histone izlerini tanıyan spesifik antikorların kullanımına dayanmaktadır. Her hücre tipi ve antikor için fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, ezme teknikleri gibi ek mekanik işlemler kullanılırsa koşullar değişebilir. Bu protokolde, heterokromatik odakları incelemek için Drosophila tükürük bezlerinin kullanımını açıklıyoruz. Tükürük bezleri, genomun 1.000'den fazla kopyasını içeren politenize hücrelere sahiptir, böylece uydu DNA'sı ve çoğaltılmış olan bazı heterokromatik bölgeler hariç, kromatin özelliklerinin çoğunun genişletilmiş bir görünümünü sağlar. Bununla birlikte, heterokromatin bölgeleri politen kromozom preparatlarında kolayca görselleştirilir, ancak kabarma teknikleri bazen karakteristik kromatin bağlı kompleksleri veya kromatin mimarisini bozabilir. Bu nedenle, tüm tükürük bezi dokusundaki proteinlerin immünolokalizasyonu bu istenmeyen etkileri aşabilir. Bu protokolü birkaç kromatin bağlı proteini tespit etmek için kullandık ve mutant Drosophila stokları ile birlikte bu protokolün heterokromatin bozulmasını incelemek için kullanılabileceğini gösterdik12.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Axygen MCT-150-C</td><td>11351904</td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>%16 formaldehit</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>AF1 Citifluor</td><td>Ted pella</td><td>19470</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>BSA, Moleküler Biyoloji Sınıfı</td><td>Roche</td><td>10735078001</td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>Tam, proteaz inhibitörleri Ultra EDTA içermeyen proteaz inhibitörler</td><td>Merck</td><td>5892953001</td><td></td></tr><tr><td>Lamel</td><td>Corning</td><td>CLS285022-200EA</td><td>22x22, marka kritik değil</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>d9779</td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>Cam kaydırak</td><td>Altın mühür</td><td>3011</td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Baker</td><td>0084-01</td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>8889</td><td></td></tr><tr><td>HP1a</td><td>Hybridoma Bank</td><td>C1A9</td><td>Ürün Formu&nbsp; Konsantre 0.1 mL</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Baker</td><td>3040-01</td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Baker</td><td>9070-03</td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>PIPES</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>&nbsp; Labquake Tüp Çalkalayıcı</td></tr><tr><td>Termo Karıştırıcı C</td><td>Eppendorf</td><td>13527550</td><td>SmartBlock 1.5 mL</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Milipore</td><td>648311</td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>100 mL, marka kritik değil</td></tr> <tr><td>ve beta;-merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td>25 mL, marka kritik değil</td></tr></tbody></table>

drosophila tükürük bezlerinde heterokromatin İlişkili proteinlerin görselleştirilmesi için İmmünofluoresan boyama

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Heterokromatin agregalarının immünostainleme ile görselleştirilmesi zor olabilir. Kromatin birçok memeli bileşeni Drosophila melanogaster'da korunur. Bu nedenle, heterokromatin oluşumunu ve bakımını incelemek için mükemmel birmodeldir. Üçüncü instar D. melanogaster larvalarının tükürük bezlerinde bulunanlar gibi politenize hücreler, yaklaşık bin kez yükseltilen kromatinleri gözlemlemek için mükemmel bir araç sağlar ve araştırmacıların çekirdekteki heterokromatin dağılımındaki değişiklikleri incelemelerine izin verir. Heterokromatin bileşenlerinin gözlemi doğrudan politen kromozom preparatlarında yapılsa da, bazı proteinlerin lokalizasyonu tedavinin şiddeti ile değiştirilebilir. Bu nedenle, hücrelerde heterokromatin'in doğrudan görselleştirilmesi bu tür bir çalışmayı tamamlar. Bu protokolde, bu doku için kullanılan immünostaining tekniklerini, sekonder floresan antikorların kullanımını ve bu heterokromatin agregalarını daha fazla hassasiyet ve ayrıntıyla gözlemlemek için konfokal mikroskopiyi açıklıyoruz.

Drosophila tükürük bezlerinde HP1a immünostaininginingin temsili sonuçları Şekil 1'degösterilmiştir. Olumlu bir sonuç, bir odak noktasını gözlemlemektir (Şekil 1a) (heterokromatik agrega veya yoğuşma). Negatif sonuç sinyal veya dağınık sinyal değildir. Bazen çift noktalı, yani çift noktalı (Şekil 1c) çift sinyal gözlenebilir, ancak genellikle daha küçük miktarlarda meydana gelir.
Veri analizi, HP...

Bu protokol, Drosophila politen hücrelerindeki heterokromatin agregalarını görselleştirmeyi amaçlamaktadır.

Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

Bu protokolün amacı Drosophila hücrelerinde heterokromatin agregalarını görselleştirmektir. Bunu başarmak için, üçüncü instar larvaların tükürük bezlerinde bulunan politen hücrelerini kullanıyoruz Bu hücrelerin genomu yaklaşık bin kez yükseltilir ve kromozomlar arayüz hücrelerinin özelliklerini korur. İyi tanımlanmış telomerleri ve kromomer adı verilen köprüleri vardır ve tüm merkezcilerin toplandığı köprüler vardır ve esas olarak heterokromatiktir.Üçüncü instar larva dokusunu kullanarak, farklı genetik mutantların arka planında heterokromatik agregalardaki değişimi değerlendirmemize izin verir. Üçüncü başlangıç larva kültürünü optimize etmek için, önce 5 ila 10 günlük yetişkinleri toplamanız ve standart bir ortamın geniş bir boyun şişesine yaklaşık 50 koymanız gerekir. 25 erkek ve 25 kadın.Şişeyi 12 saat boyunca 25 santigrat derecede kontrollü bir sıcaklık inkübatörüne yerleştirin. Kuluçka süresi bittikten sonra, yetişkinleri çıkarın ve prosedürü tekrarlamak için yeni bir şişeye aktarın. Embriyoların 22 saat boyunca 18 santigrat derecede büyümesine izin verin.Larva toplama için, aşırı küresel olmayan gezgin larvaları seçtiğinizden emin olun. Mikroskop altında protesto inhibitörleri ile soğuk PBS'de 15 çift tükürük bezini veya 30 dakika içinde kesebildiğin kadarını parçalara ayrıştırın. Tükürük bezlerini buz gibi PBS ile başka bir tüpe aktarın.Soğuk PBS artı protesto inhibitörleri ile bir kez yıkayın. Unutmayın, her zaman dokunun tüpün dibine ulaşmasını bekleyin. PBS'yi son adımdan çıkardıktan sonra, doğrudan bir X grubu diş eti fiksasyon tamponunun 0,5 mililitresini ve% 50 metanol artı% 2 formaldehit ekleyin.Hafif dönüş ile dört santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatır. Tris-Triton tamponu ile bir mililitre ekleyerek bir beş dakikalık dönüş yıkama gerçekleştirin. Her zaman dokunun tüpün dibine ulaşmasını bekleyin.Not: dokunun tüpün altına ulaşmasını bekleyin. Tükürük bezlerini Tris-Triton ile kuluçkaya yatırın, yukarıdakiyle aynı, artı beta mercaptoethanol'un% 1'i hafif titreme ile 37 santigrat derecede iki saat boyunca. BO3 tamponu ile yıkayın ve 37 santigrat derecede BO3 artı 10 milimolar DTT ile 15 dakika hafif sallanarak kuluçkaya yatır.Kuluçka süresinin sonunda, tek başına bir mililitre BO3 tamponu ile bir yıkama gerçekleştirin. Tükürük bezlerini bir mililitre tampon B'de oda sıcaklığında iki saat boyunca rotasyonla kuluçkaya yatırın. Tüm B tamponlarını çıkarın ve A tamponu artı ilgi antikoru ekleyin.Bu durumda, Iridium bankasından HP bir, A C 18 9 kullanıyoruz. 3'te 1, 000 gece boyunca dört derecede rotasyonlu. Bu noktada, titremenin antikora zarar verebilecek kabarcıkları yükseltmemesi önemlidir.Her seferinde bir milimetre kullanarak oda sıcaklığında karıştırarak B tamponu ile 15 dakika yıkama yapın. Bezler, ikincil antibiyotik çifti ile birlikte B tampona, dört derecede dönme altında iki saat boyunca bir zemine aktarılır. Bu adımda, ikincil antikorun ışıktan korunması için tüpün alüminyum kağıt folyo ile örtülmek önemlidir.Oda sıcaklığında 2x15 dakikalık pullar gerçekleştirirken, Sydox veya OH gibi bir DNA işaretleyicisi ile bir mililitre tampon B.Incubate ile rotasyon yapın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir mililitre tampon B içinde çözün. Oda sıcaklığında dönerken, her biri 10 dakika süren B tamponu ile bir yıkama ve PBS ile bir kez yıkama yapın. Son olarak, tükürük bezlerini bir kaydıramaya monte edin, kapak kayması olan bir havuz haline getirin.Tükürük bezlerini havuzun ortasına koyun ve Sidiflor ile örtün. Kabarcık deformasyonunu önlemek için, viskoz sıvıyı her yere uzatın. Ardından, tüm slaytları açık oje ile kapatın.Floresan veya konfokal mikroskop altında gözlemleyin. Örnek aynı gün gözlemlenmeyecekse, ışıktan dört derecede saklayın. Drosophila tükürük bezlerinde HB1 monostaining'in temsili sonuçları şekil bir olarak gösterilmiştir.Olumlu bir sonuç, A, atero kromatik agrega veya yoğuşma gibi bir odak noktasını gözlemlemektir. Negatif sonuç sinyal veya dağınık sinyal değildir. Bazen, çift sinyal C'de çift nokta gibi gözlemlenebilir, ancak genellikle daha küçük miktarlarda gerçekleşir.Verileri analiz etmek için, HP1'in dağılımını farklı mutant arka planlarla karşılaştırarak bir çubuk grafik olarak temsil edilebilirler. Örneğin, ikinci şekilde, çekirdeklerin% 98'inin bir nokta dağılımı sunduğunu görebiliriz. Ve vahşi tipteki iki odak noktasının %2'si.Mutantta oran değişti ve iki odak varlığı% 40'a yükseldi Şekil üç monostainingde temsili trimetilasyon lizin 9H3'ü gösteriyor. Sonuç Drosophila tükürük bezleri B'de bir odak noktasını gözlemler, kromatik agregada veya yoğuşmada olumlu bir sonuçtur, C'de çift veya üçlü bir sinyal nadir durumlarda görülebilir, ancak küçük miktarlarda. Bu protokolün sonunda, durum sınırlamalarına rağmen HP1 proteininin diyokromatik kondensatlarını görebileceksiniz, iyi bir ilk yaklaşım olacaktır.

immunofluorescent-staining-for-visualization-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Nöron dendritler gibi karmaşık hücre şekilleri, geliştirme sırasında nasıl elde edilir anlamak için, bu, doğru tahlil mikrotübül organizasyonu edebilmek için önemlidir. Burada dendritik arborization duyusal nöron dendritler mikrotübül organizasyonu, trakea, kas incelemek için sağlam bir immünohistolojik bir etiketleme yöntemi açıklamak ve...

Immünohistolojik Duyusal Nöron Dendritler Mikrotübüller Etiketleme, trakea ve kaslar Drosophila Larva Vücut Duvar

Bu video, glial hücrelerin tek hücreli görüntülenmesi için transgenik bir Drosophila beyninin immünofloresan boyamasını göstermektedir. Beyin, glial spesifik bir rekombinaz sisteminin kontrolü altında farklı antijenik epitop kombinasyonları ile kaynaşmış zar hedefli proteinleri eksprese eder. İzole ve sabit beyinler, antijenik epitoplara özgü primer antikorlarla boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Bu etiketleme, çeşitli beyin bölgelerinde farklı glial hücre alt...

Glial Hücrelerin Tek Hücreli Görüntülenmesi için Drosophila Beyinlerinin İmmünofloresan Boyaması

Drosophila spermatogenez sırasında centrosomal proteinlerin Görüntüleme sentrozom biyoloji için önemli bir yeni proteinleri tespit etmek yanı sıra, bu işlem bilinen oyuncu belirli bir işlevi aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir.

Fly Testislerin görüntüleme centrosomes

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Öğrenin, Drosophila tükürük bezlerinde HP1 protein işaretleyicisi kullanarak heterokromatin kümelerini immünofluoresan boyama ile görselleştirme yöntemini. Bu protokol genetik mutantlarda kromatin yapısını değerlendirmeye yardımcı olur.

Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama

Daha fazla video keşfet