Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama

Bu protokolün amacı Drosophila hücrelerinde heterokromatin agregalarını görselleştirmektir. Bunu başarmak için, üçüncü instar larvaların tükürük bezlerinde bulunan politen hücrelerini kullanıyoruz Bu hücrelerin genomu yaklaşık bin kez yükseltilir ve kromozomlar arayüz hücrelerinin özelliklerini korur. İyi tanımlanmış telomerleri ve kromomer adı verilen köprüleri vardır ve tüm merkezcilerin toplandığı köprüler vardır ve esas olarak heterokromatiktir.

Üçüncü instar larva dokusunu kullanarak, farklı genetik mutantların arka planında heterokromatik agregalardaki değişimi değerlendirmemize izin verir. Üçüncü başlangıç larva kültürünü optimize etmek için, önce 5 ila 10 günlük yetişkinleri toplamanız ve standart bir ortamın geniş bir boyun şişesine yaklaşık 50 koymanız gerekir. 25 erkek ve 25 kadın.

Şişeyi 12 saat boyunca 25 santigrat derecede kontrollü bir sıcaklık inkübatörüne yerleştirin. Kuluçka süresi bittikten sonra, yetişkinleri çıkarın ve prosedürü tekrarlamak için yeni bir şişeye aktarın. Embriyoların 22 saat boyunca 18 santigrat derecede büyümesine izin verin.

Larva toplama için, aşırı küresel olmayan gezgin larvaları seçtiğinizden emin olun. Mikroskop altında protesto inhibitörleri ile soğuk PBS'de 15 çift tükürük bezini veya 30 dakika içinde kesebildiğin kadarını parçalara ayrıştırın. Tükürük bezlerini buz gibi PBS ile başka bir tüpe aktarın.

Soğuk PBS artı protesto inhibitörleri ile bir kez yıkayın. Unutmayın, her zaman dokunun tüpün dibine ulaşmasını bekleyin. PBS'yi son adımdan çıkardıktan sonra, doğrudan bir X grubu diş eti fiksasyon tamponunun 0,5 mililitresini ve% 50 metanol artı% 2 formaldehit ekleyin.

Hafif dönüş ile dört santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatır. Tris-Triton tamponu ile bir mililitre ekleyerek bir beş dakikalık dönüş yıkama gerçekleştirin. Her zaman dokunun tüpün dibine ulaşmasını bekleyin.

Not: dokunun tüpün altına ulaşmasını bekleyin. Tükürük bezlerini Tris-Triton ile kuluçkaya yatırın, yukarıdakiyle aynı, artı beta mercaptoethanol'un% 1'i hafif titreme ile 37 santigrat derecede iki saat boyunca. BO3 tamponu ile yıkayın ve 37 santigrat derecede BO3 artı 10 milimolar DTT ile 15 dakika hafif sallanarak kuluçkaya yatır.

Kuluçka süresinin sonunda, tek başına bir mililitre BO3 tamponu ile bir yıkama gerçekleştirin. Tükürük bezlerini bir mililitre tampon B'de oda sıcaklığında iki saat boyunca rotasyonla kuluçkaya yatırın. Tüm B tamponlarını çıkarın ve A tamponu artı ilgi antikoru ekleyin.

Bu durumda, Iridium bankasından HP bir, A C 18 9 kullanıyoruz. 3'te 1, 000 gece boyunca dört derecede rotasyonlu. Bu noktada, titremenin antikora zarar verebilecek kabarcıkları yükseltmemesi önemlidir.

Her seferinde bir milimetre kullanarak oda sıcaklığında karıştırarak B tamponu ile 15 dakika yıkama yapın. Bezler, ikincil antibiyotik çifti ile birlikte B tampona, dört derecede dönme altında iki saat boyunca bir zemine aktarılır. Bu adımda, ikincil antikorun ışıktan korunması için tüpün alüminyum kağıt folyo ile örtülmek önemlidir.

Oda sıcaklığında 2x15 dakikalık pullar gerçekleştirirken, Sydox veya OH gibi bir DNA işaretleyicisi ile bir mililitre tampon B.Incubate ile rotasyon yapın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir mililitre tampon B içinde çözün. Oda sıcaklığında dönerken, her biri 10 dakika süren B tamponu ile bir yıkama ve PBS ile bir kez yıkama yapın. Son olarak, tükürük bezlerini bir kaydıramaya monte edin, kapak kayması olan bir havuz haline getirin.

Tükürük bezlerini havuzun ortasına koyun ve Sidiflor ile örtün. Kabarcık deformasyonunu önlemek için, viskoz sıvıyı her yere uzatın. Ardından, tüm slaytları açık oje ile kapatın.

Floresan veya konfokal mikroskop altında gözlemleyin. Örnek aynı gün gözlemlenmeyecekse, ışıktan dört derecede saklayın. Drosophila tükürük bezlerinde HB1 monostaining'in temsili sonuçları şekil bir olarak gösterilmiştir.

Olumlu bir sonuç, A, atero kromatik agrega veya yoğuşma gibi bir odak noktasını gözlemlemektir. Negatif sonuç sinyal veya dağınık sinyal değildir. Bazen, çift sinyal C'de çift nokta gibi gözlemlenebilir, ancak genellikle daha küçük miktarlarda gerçekleşir.

Verileri analiz etmek için, HP1'in dağılımını farklı mutant arka planlarla karşılaştırarak bir çubuk grafik olarak temsil edilebilirler. Örneğin, ikinci şekilde, çekirdeklerin% 98'inin bir nokta dağılımı sunduğunu görebiliriz. Ve vahşi tipteki iki odak noktasının %2'si.

Mutantta oran değişti ve iki odak varlığı% 40'a yükseldi Şekil üç monostainingde temsili trimetilasyon lizin 9H3'ü gösteriyor. Sonuç Drosophila tükürük bezleri B'de bir odak noktasını gözlemler, kromatik agregada veya yoğuşmada olumlu bir sonuçtur, C'de çift veya üçlü bir sinyal nadir durumlarda görülebilir, ancak küçük miktarlarda. Bu protokolün sonunda, durum sınırlamalarına rağmen HP1 proteininin diyokromatik kondensatlarını görebileceksiniz, iyi bir ilk yaklaşım olacaktır.