Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Bu protokol oldukça önemlidir, çünkü kütle spektrometrisi ile protein arginin metilasyonunun küresel analizi için en gelişmiş iş akışını temsil eder. Bu, R-metillenmiş proteini, diğer biyokimyasal tekniklerle elde edilemeyen tek bir stil çözünürlüğü ile tanımlamak ve profillemek için tek yöntemdir. Birçoğu klinik çalışmalarda ve anti-kanser ilaçlarında bulunan PRMT inhibitörlerinin kullanımı ile birleştiğinde, bu protokol etki mekanizmalarının derinlemesine analizine izin verir.

Başlamak için, ultra saf suda 4.5 milimolar nihai konsantrasyonda çözünmüş bir DTT stok çözeltisi kullanarak tiol protein grubunun indirgenmesini gerçekleştirin ve reaksiyonun 55 santigrat derecede 30 dakika boyunca gitmesine izin verin. 10 milimolar konsantrasyonda iyodoasetamid ekleyerek ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe ederek tiol protein grubunun alkilasyonunu gerçekleştirin. Proteoliz verimliliğini doğrulamak için, SDS-PAGE Coomassie boyalı jel üzerinde daha sonraki analizler için bir miktar protein ekstraktını saklayın ve sindirimden sonra karşılık gelen miktarda numune ile karşılaştırın.