Name: Diamond Light Sourcetaki XChem Tesisinde Verimli Parça Taramasının Gerçekleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Keşfedin, Diamond Light Source'taki XChem tesisinde kristal tabanlı parça taraması için X-ışını kristalografisi yöntemini. Bu verimli platform, ilaç keşfinde zayıf bağlayıcıları belirleyerek yapısal bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Elmas Işık Kaynağı ve Yapı Genomik Konsorsiyumu arasındaki büyük bir ortak çabayı temsil ediyor. Yazarlar, i04-1 ışın hattının otomasyonuna katkılarından ve tüm MX ışın hatlarında yaygın olarak çalıştırılan kolaylaştırılmış veri toplama ve otomatik işleme boru hatları sağladıkları için Diamond'ın çeşitli destek gruplarına ve MX grubuna teşekkür etmek ister. Ayrıca, kurulumu test eden ilk kullanıcılar olan esneklikleri için SGC PX grubuna ve ilk ciddi endüstriyel kullanıcı olduğu için Evotec'e teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma, Avrupa Komisyonu'nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen iNEXT-Discovery (Grant 871037) tarafından desteklenmiştir.

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu yazıda özetlenen süreç, kullanıcı topluluğu tarafından kapsamlı bir şekilde test edilmiştir ve burada açıklanan protokollerin uyarlanabilirliği, platformda tipik olarak karşılaşılan çok çeşitli projelerin ele alınmasının anahtarıdır. Bununla birlikte, kristal sisteminin birkaç ön koşulu gereklidir.
X-ışını kristalografisi kullanılarak gerçekleştirilen herhangi bir parça tarama kampanyası için, tekrarlanabilir ve sağlam bir kristal sistemi kritik öneme sahiptir. Standart XChem protokolü, parçanın doğrudan kristal damlasına eklenmesini içerdiğinden, optimizasyon, toplam kristal sayısından ziyade yüksek kaliteli kristaller içeren damla sayısına odaklanmalıdır. Damlalar birden fazla kristal içeriyorsa, hasat sürecini hafifletebilseler de etkili bir şekilde gereksizdirler. Ayrıca, kristalizasyon protokolünün ana enstitüden sahadaki tesislere aktarılması zor olabilir. Bu genellikle en iyi şekilde tekrarlanabilir çekirdeklenmeyi teşvik etmek için kristal tohumlama kullanılarak elde edilir54 ve bu nedenle, kullanıcıların protein ve kristalizasyon çözümleriyle birlikte tohum stokları sağlamaları iyi bir uygulamadır.
İyi bileşik çözünürlüğü ve desteği sağlamak için, zayıf parçaların bağlanmasını sağlamayı amaçlayan yüksek ıslatma konsantrasyonları, parça kitaplıkları organik çözücülerde, özellikle DMSO ve etilen glikolde sağlanır. İki farklı çözücünün sağlanması, kullanıcılara DMSO'yu hiç tolere etmeyen veya ilgilenilen bir bölgedeki parçaların bağlanmasını engellediği kristaller için bir alternatif sunar. Kullanıcılar sulu tamponda alternatif kütüphaneler sağlayabilir: bileşikler, tamamen çözünmeleri ve sıvı dağıtım robotuyla uyumlu plakalarda biçimlendirilmeleri koşuluyla iyi bir şekilde dağılacaktır.
Hem kütüphaneyi çözündürecek hem de kristal sistemi tarafından tolere edilecek uygun bir organik çözücü bulmanın mümkün olmadığı projeler için alternatif bir prosedür, BESSY55'te belirtildiği gibi kurutulmuş bileşiklerin kullanılmasıdır.
Toplulukta, bileşikleri yüksek tuz konsantrasyonları içeren kristalleşme koşullarında yetiştirilen kristallere batırabilme konusunda uzun süredir devam eden bir soru var. Pratik olarak, hasat aşamasında bileşiklerin daha fazla çökelmesi ve hızlı tuz kristalleri oluşumu gözlenir, bu da hasat alanının etrafına nemli bir ortam uygulanarak azaltılır. Genel olarak, kristal sistemlerde yüksek tuz kristalleşme koşullarından tarama kampanyaları, düşük tuz koşullarıyla karşılaştırılabilir bir isabet oranı verir.
XChem sürecinin ilk aşamaları (solvent tolerans testi ve ön eleme) nispeten küçük ölçekli ve hızlı deneylerdir, ancak proje için net bir karara izin verir. En acı verici olanı, hiçbir çözücü tolere edilmezse veya ön ekran çok düşük bir isabet oranıyla sonuçlanırsa alternatif kristal sistemlerin bulunması gerekecektir. Buna karşılık, başarılı olurlarsa, sonuçlar tarama deneyi için kullanılacak ıslatma koşulunu ve veri toplama için en iyi stratejiyi doğrudan bilgilendirir. Verilerin kalitesi, özellikle çözünürlük, isabet tanımlama ve analizi için elektron yoğunluğunun kalitesini etkileyeceğinden, amaç, kırınım kalitesi üzerinde zararlı bir etkisi olmayan mümkün olan en yüksek bileşik konsantrasyonuna batırmaktır (veri kümelerinin çoğunluğu (~% 80) 2.8 şveya daha iyi bir çözünürlüğe kırınım).
Veri analizi süreci, zayıf bağlayıcıların tespiti için PanDDA yazılımına dayanan ve kullanıcıların tarama kampanyasının sonuçlarını hızlı bir şekilde görselleştirmesine ve gözden geçirmesine olanak tanıyan XChemExplorer içinde kolaylaştırılmıştır. XChemExplorer, Diamond'da bulunan paketlerden (DIALS16, autoPROC30, STARANISO31 ve Xia214) veri işleme sonuçlarını, her paket için standart yöntemle belirlenen çözünürlük sınırlarıyla (yani, CC1/2 = 0.3) içe aktarır. Varsayılan olarak, veri kümesi seçimi I/sigI, tamlık ve bir dizi benzersiz yansımadan hesaplanan bir puana dayanır, ancak hem genel olarak hem de tek tek örnekler için kullanım için belirli işleme sonuçları seçilebilir25. Veriler ayrıca çözünürlük, R'siz ve referans ve hedef veriler arasındaki birim hücre hacmindeki fark (varsayılanlar sırasıyla 3,5 Å, 0,4 ve %12'dir) gibi kriterlere dayalı olarak PanDDA tarafından analizden hariç tutulur, böylece zayıf kırılan, yanlış merkezlenmiş veya yanlış indekslenmiş kristaller analizi etkilemez.
PanDDA algoritması, standart kristalografik haritalarda görünmeyen kısmi doluluk ligandlarını tespit etmek için bir parça kampanyası sırasında toplanan önemli sayıda veri kümesinden yararlanır. Başlangıçta PanDDA, solvent tolerans testi ve ön eleme adımları sırasında toplanan verileri, daha sonra bir temel durum modeli oluşturmak için kullanılan bir ortalama yoğunluk haritası hazırlamak için kullanır. Bu model sonraki tüm analiz adımları için kullanılacağından, fragman ekranı için kullanılan koşullar altında ligandlanmamış proteini doğru bir şekilde temsil etmesi hayati önem taşır. PanDDA daha sonra bağlı ligandları tanımlamak için istatistiksel bir analiz kullanır ve kristalin bağlı durumu için bir olay haritası oluşturur. Kristalin bağlanmamış fraksiyonunun kısmi doluluk veri kümesinden çıkarılmasıyla bir olay haritası oluşturulur ve ligand tam dolulukta bağlansaydı ne gözlemleneceğini sunar. Konvansiyonel 2mFo-DF c haritalarında net görünen parçalar bile, olay haritalarına başvurulmazsa yanlış modellenebilir32. PanDDA, ortalama haritalardan (genellikle parça bağlamanın göstergesidir) farklı veri kümelerini tanımlamak için güçlü bir yöntem olsa da ve iyileştirme sırasında RSCC, RSZD, B-faktör oranı ve RMSD gibi ölçümler kullanıcıların yararına sağlanırken, gözlemlenen yoğunluğun beklenen ligandı ve en uygun konformasyonu doğru bir şekilde gösterip göstermediğine karar vermekten nihai olarak kullanıcı sorumludur.
Veri analizi ve iyileştirmenin ardından, tüm kullanıcıların XChemExplorer kullanarak Protein Veri Bankası'na (PDB) aynı anda birden fazla yapı yatırması mümkündür. Her parça ekranı için iki grup biriktirme yapılır. İlk biriktirme, MMCIF dosyalarına dahil edilen PanDDA olay haritalarını hesaplamak için katsayılarla birlikte tüm parçaya bağlı modelleri içerir. İkinci biriktirme, deneyin tüm veri kümelerinin ölçülen yapı faktörleri boyunca eşlik eden temel durum modelini sağlar: bu veriler PanDDA analizini yeniden üretmek ve gelecekteki algoritmaları geliştirmek için kullanılabilir. Vuruşların yapılarına gelince, parça doluluğu düşük olduğunda, modeller ligand'a bağlı ve kafa karıştırıcı zemin durum yapılarının bir bileşimi ise, arıtma daha iyi davranır32; Bununla birlikte, uygulama sadece sınır durum kesirlerini biriktirmektir, çünkü tam bileşik modeller genel olarak karmaşıktır ve yorumlanması zordur. Sonuç olarak, PDB tarafından yeniden hesaplanan bazı kalite göstergeleri (özellikle R/Rfree) bazen biraz yükselir. Zenodo56 gibi platformları kullanarak tüm ham verileri sağlamak da mümkündür, ancak bu şu anda XChem boru hattı tarafından desteklenmemektedir.
Genel olarak, 2016'daki operasyonundan bu yana, bu prosedür kullanılarak hedeflerin %95'inden fazlasında fragman ligandları tanımlanabildi. XChem'in desteklediği birçok projeden elde edilen deneyim, kristal hazırlama33 için en iyi uygulama haline getirilirken, parça ilerlemesine yardımcı olmak için hazır konseptiuygulayan bir parça kitaplığı geliştirildi 29 ve aynı zamanda kitaplık kompozisyonunu halka açık hale getirme uygulamasının oluşturulmasına yardımcı oldu. Platform, burada ayrıntılı olarak açıklanan bakımlı altyapının ve belgelenmiş süreçlerin önemini gösterdi ve diğer parça kitaplıklarınıdeğerlendirmeyi 57,58, kitaplıkları karşılaştırmayı48 ve işbirlikçi EUOpenscreen-DRIVE kitaplığınıntasarımını bilgilendirmeyi mümkün kıldı 59,60.

Parça Tabanlı İlaç Keşfi (FBDD), kurşun keşfi için yaygın olarak kullanılan bir stratejidir ve 25 yıl önce ortaya çıkmasından bu yana, klinik kullanım için dört ilaç sunmuştur ve 40'tan fazla molekül klinik deneylereilerlemiştir 1,2,3. Fragmanlar, genellikle moleküler ağırlığı 300 Da veya daha az olan küçük kimyasal varlıklardır. Mükemmel fizikokimyasal özelliklere sahip yüksek ligand verimli inhibitörlerin geliştirilmesi için iyi başlangıç noktaları sağlayan düşük kimyasal karmaşıklıkları nedeniyle seçilirler. Büyüklükleri, proteinlerin bağlanma manzarasını daha büyük ilaç veya kurşun benzeri bileşiklerin kütüphanelerinden daha kapsamlı bir şekilde örnekledikleri ve böylece sıcak noktaları ve varsayılan allosterik bölgeleri ortaya çıkardıkları anlamına gelir. Yapısal bilgilerle birleştirildiğinde, fragmanlar, protein ve ligand arasındaki potansiyel moleküler etkileşimlerin ayrıntılı bir haritasını sağlar. Bununla birlikte, hedef proteine zayıf bağlanma eğiliminde olan bu varlıkların güvenilir bir şekilde tespit edilmesi ve doğrulanması, Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR), Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) veya İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi (ITC) gibi bir dizi sağlam ve hassas biyofiziksel tarama yöntemi gerektirir4,5.
X-ışını kristalografisi, FBDD araç setinin önemli bir parçasıdır: zayıf bağlayıcıları tanımlayacak kadar hassastır ve moleküler düzeyde etkileşimler hakkında doğrudan yapısal bilgi verir. Diğer biyofizik taramaları için tamamlayıcıdır ve genellikle kurşun bileşiklere parça isabetlerini ilerletmek için gereklidir; yüksek kaliteli kristal sistemleri gerektirir, yani kristalleşmenin yüksek oranda tekrarlanabilir olduğu ve kristallerin ideal olarak 2.8 şçözünürlükten daha iyi kırıldığı anlamına gelir.
Tarihsel olarak, ister akademide ister endüstride olsun, kristalografiyi birincil fragman ekranı 6,7,8 olarak kullanmak çok zor olmuştur. Buna karşılık, senkrotronlar robotik, otomasyon 9,10,11 ve dedektör teknolojisinde 12,13 büyüklük sırasına göre iyileştirmeler elde etti ve eşit derecede hızlandırılmış bilgi işlem gücü ve veri işlemealgoritmaları 14,15,16 ile birleştiğinde, tam kırınım veri kümeleri saniyeler içinde ölçülebilir ve LillyCAT7'de öncülük edildiği gibi çok sayıda tamamen gözetimsiz olarak ölçülebilir ve daha sonra MASSIF17,18 (Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi (ESRF)). Bu, senkrotronların, kristal tabanlı parça taramasını birincil ekran olarak geniş bir kullanıcı topluluğu için erişilebilir hale getirmek için son derece akıcı platformlar geliştirmesine yol açtı (XChem at Diamond; EMBL/ESRF19'da CrystalDirect; BESSY, Helmholtz-Zentrum, Berlin20'de; MaxIV21'de FragMax).
Bu makale, numune hazırlamadan 3D modellenmiş isabetlerin nihai yapısal sonuçlarına kadar X-ışını kristalografisi ile parça taraması için XChem platformunu oluşturan protokolleri belgelemektedir. Boru hattı (Şekil 1), kristal tanımlama22, ıslatma23 vehasat 24 için yeni yaklaşımların yanı sıra veri yönetimi yazılımı 25 ve şu anda toplulukta yaygın olarak kullanılan parçaları26 tanımlamak için algoritmik bir yaklaşım geliştirmeyi gerektiriyordu. Kristal hasat teknolojisi artık bir satıcı tarafından satılmaktadır (Malzeme Tablosuna bakınız) ve aletlerin açık kullanılabilirliği, diğer senkrotronların bunları eşdeğer platformlar kurmak için uyarlamasına izin vermiştir21. Devam eden projeler, Fragalysis platformu27 aracılığıyla veri analizi, model tamamlama ve veri dağıtımını ele almaktadır. Numune hazırlama laboratuvarı I04-1 ışın hattının bitişiğindedir ve yüzlerce donmuş numunenin ışın hattına aktarılması lojistiğini basitleştirir ve I04-1'de özel ışın süresi, kampanyaya rehberlik etmek için hızlı X-ışını geri bildirimine olanak tanır.
XChem, yılda iki kez (Nisan başı ve Ekim) yapılan Diamond kullanıcı programının ayrılmaz bir parçasıdır. Hakem değerlendirme süreci, Akademi ve Endüstri'den ilaç keşfi uzmanlarına danışılarak rafine edilmiştir. Güçlü bir bilimsel vakanın yanı sıra, teklif süreci28 , başvuru sahiplerinin yalnızca kristal sistemin hazır olup olmadığını değil, aynı zamanda biyokimyasal ve ortogonal biyofiziksel yöntemlerdeki uzmanlıklarını ve takip kimyası yoluyla tarama isabetlerini ilerletme kapasitelerini de kendi kendilerine değerlendirmelerini gerektirir. Erişim modları da çok disiplinli kullanıcı topluluğunu barındıracak şekilde gelişmiştir:
Katman 1 (tek proje), keşif aşamasındaki projeler içindir ve isabet doğrulama araçlarının (biyofizik veya biyokimyasal araçlar) ve takip stratejilerinin mevcut olması gerekmez. Kabul edilirse, projeye, kavram kanıtı için yeterli sayıda ışın zamanı kayması verilir.
Katman 2 (tek proje), iyi doğrulanmış projeler içindir ve aşağı akış araçlarının ve takip stratejilerinin uygulanmasını gerektirir. Kabul edilirse, projeye tam bir fragman tarama kampanyası için yeterli ışın süresi tahsis edilir. Tekil projeler (Tier 1 veya Tier 2), tahsis süresinin 6 ayı içinde (Nisan-Eylül veya Ekim-Mart) tamamlanacaktır.
Blok Tahsis Grubu (BAG), BAG içinde sağlam bir hedef seçim ve önceliklendirme sürecinin yanı sıra net bir takip hattının uygulandığı bir grup ve proje konsorsiyumu içindir. BAG'ler, faaliyetlerini Diamond personeli ile koordine eden ve BAG üyelerini eğiten, tamamen XChem tarafından eğitilmiş en az bir uzmana (süper kullanıcı) sahip olmalıdır. Tahsis edilen ışın zamanı kayma sayısı, BAG'deki bilimsel olarak güçlü projelerin sayısı ile tanımlanır ve BAG'nin raporuna dayalı olarak tahsis süresi başına yeniden değerlendirilir. Erişim 2 yıl boyunca kullanılabilir.
XChem deneyi, her biri için bir karar noktası olan üç aşamaya ayrılmıştır: solvent tolerans testi, ön ekran ve ana ekran (Şekil 2). Solvent tolerans testi, ıslatma parametrelerini, kristal sisteminin tolere edebileceği solvent miktarını (DMSO, etilen glikol veya gerekirse diğer kriyoprotektanları) ve ne kadar süreyle tanımlamaya yardımcı olur. Solvent konsantrasyonları tipik olarak en az iki zaman noktasında %5-%30 arasında değişir. Kırınım verileri toplanır ve kristal sisteminin temel kırınımı ile karşılaştırılır; Bu, bir sonraki aşama için ıslatma parametrelerini belirleyecektir. Ön eleme için, çözücü testinde belirlenen koşullar kullanılarak 100-150 bileşik ıslatılır ve amacı, kristallerin bu koşullarda bileşikleri tolere edebildiğini doğrulamaktır. Gerekirse, kriyoprotektan daha sonra parçaları içeren damlalara eklenir. Başarı kriterleri, kristallerin %80'inin veya daha fazlasının iyi ve tutarlı kalitede kırınım verileri verecek kadar iyi hayatta kalmasıdır; Bu başarısız olursa, ıslatma koşulları genellikle ıslatma süresi veya çözücü konsantrasyonu değiştirilerek revize edilir. Başarılı bir ön elemenin ardından, deney için seçilen bileşiklerin geri kalanı nihai parametreler kullanılarak ayarlanabilir.
DSI'ye hazır kütüphane (Materyal Tablosuna bakınız), hazır kimya29 kullanılarak hızlı takip ilerlemesine izin vermek için özel olarak tasarlanmıştır ve tesisin beygir kütüphanesi olmuştur. DMSO'da 500 mM konsantrasyonda kullanıcılar tarafından kullanılabilir. Akademik kullanıcılar, DMSO'da 100-500 mM konsantrasyonlarda (toplamda 2.000'den fazla bileşik) işbirlikçiler tarafından sağlanan diğer kütüphanelere de erişebilirler (tam liste web sitesinde bulunabilir28). Genel koleksiyonun çoğu, DMSO'yu tolere etmeyen kristal sistemler için etilen glikolde de mevcuttur. Kullanıcılar, akustik sıvı taşıma sistemi ile uyumlu plakalarda olmaları koşuluyla kendi kitaplıklarını da getirebilirler (bkz. Malzeme Tablosu).
Deneyin üç adımı için de (çözücü karakterizasyonu, ön eleme veya tam ekran), aşağıdaki numune hazırlama prosedürleri aynıdır (Şekil 3): görüntüleme yoluyla bileşik dağıtım yerinin seçimi ve kristalizasyon damlalarının TeXRank22 ile hedeflenmesi; hem çözücü hem de bileşikler için akustik sıvı dağıtım sistemini kullanarak damlalara dağıtma23; Kristal değiştirici24 kullanılarak kristallerin verimli bir şekilde toplanması; ve örnek bilgilerin ışın hattı veritabanına (ISPyB) yüklenmesi. Deney tasarımı ve yürütmesi için mevcut arayüz, platformun farklı ekipmanları için gerekli girdi dosyalarını oluşturan ve tüm sonuçları bir SQLite veritabanında izleyen ve kaydeden Excel tabanlı bir uygulamadır (SoakDB). Barkod tarayıcılar, numunelerin izlenmesine yardımcı olmak için süreç boyunca çeşitli aşamalarda kullanılır ve bu veriler veritabanına eklenir.
Kırınım verileri, ışın hattı I04-1 üzerinde özel ışın süresi kullanılarak katılımsız modda toplanır. Optik ve X-ışını tabanlı olmak üzere iki merkezleme modu mevcuttur17. İğne ve çubuk şeklindeki kristaller için, X-ışını merkezleme tavsiye edilirken, daha kalın kristaller genellikle daha hızlı olan ve bu nedenle ayrılan ışın süresinde daha fazla numunenin toplanmasına izin veren optik modu destekler. Kristallerin çözünürlüğüne bağlı olarak (platforma girmeden önce oluşturulan) veri toplama 60 s veya 15 s toplam maruz kalma olabilir. Solvent testi aşamasında veri toplama, genellikle ışın hattı I04-1'in performansıyla hangi kombinasyonun en iyi şekilde çalışacağını bildirir.
Büyük hacimli veri analizi, PanDDA 26 kullanılarak isabet tanımlama adımını başlatmak için de kullanılabilen XChemExplorer (XCE)25 aracılığıyla yönetilir. XCE, protein-ligand yapılarının büyük ölçekli analizini destekleyen bir veri yönetimi ve iş akışı aracıdır (Şekil 4); Diamond Light Source'ta (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 ve STARANISO31) toplanan verilerden elde edilen otomatik işleme sonuçlarını okur ve veri kalitesine ve bir referans modele benzerliğe dayalı olarak sonuçlardan birini otomatik olarak seçer. Modelin XChem taraması için kullanılan kristal sistemini temsil etmesi önemlidir ve tüm suları veya diğer çözücü moleküllerini ve ayrıca yalnızca çözücü ile ıslatılmış kristallerde görülebilen tüm kofaktörleri, ligandları ve alternatif konformasyonları içermelidir. Bu referans modelin kalitesi, model oluşturma ve iyileştirme aşamasında gereken iş miktarını doğrudan etkileyecektir. PanDDA, tüm verileri analiz etmek ve bağlanma yerlerini belirlemek için kullanılır. Yapıları bir referans yapıya hizalar, istatistiksel haritaları hesaplar, olayları tanımlar ve olay haritalarınıhesaplar 26,32. PanDDA paradigmasında, tam kristalografik modeli oluşturmak ne gerekli ne de arzu edilir; Modellenmesi gereken şey, yalnızca bir parçanın bağlı olduğu proteinin görünümüdür (bağlı durum modeli), bu nedenle olay haritası32'ye göre yalnızca ligand ve çevresindeki kalıntıları/çözücü moleküllerini oluşturmaya odaklanılmalıdır.

<table><tbody><tr><td>DSI'ye hazır kütüphane</td><td>Enamine</td><td>DSI-896</td><td>parça kütüphanesi</td></tr><tr><td>Echo 550 ve 650 serisi</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td>akustik dağıtım sistemi</td></tr><tr><td>Echo mikroplakalar</td><td>Beckman-Coulter</td><td>001-12380; 001-8768; 001-6025</td><td>1536 kuyulu ve 384 kuyulu mikroplakalar</td></tr><tr><td>Değiştirici</td><td>Oxford Lab Technology</td><td></td><td>hasat cihazı</td></tr><tr><td>Mikroplaka açılır rotorlu santrifüj</td><td>Sigma</td><td>model 11121</td><td>mikroplaka santrifüj</td></tr><tr><td>3 damla kristalizasyon plakaları</td><td>Swissci</td><td>3W96T-UVP</td><td>Kristalizasyon plakaları</td></tr><tr><td>Formulatrix plaka görüntüleyici ve Rockmaker yazılımı</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Kristalizasyon plakaları görüntüleme cihazı</td></tr></tbody></table>

diamond light source'taki xchem tesisinde verimli parça taramasının gerçekleştirilmesi

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

Parça bazlı ilaç keşfinde, ~ 300 Da'dan daha küçük yüzlerce veya genellikle binlerce bileşik, güçlü ilaç adaylarına dönüştürülebilecek kimyasal varlıkları tanımlamak için ilgilenilen proteine karşı test edilir. Bileşikler küçük olduğundan, etkileşimler zayıftır ve bu nedenle tarama yöntemi oldukça hassas olmalıdır; Ayrıca, yapısal bilgiler, bu isabetleri kurşun benzeri bileşiklere dönüştürmek için çok önemli olma eğilimindedir. Bu nedenle, protein kristalografisi her zaman altın standart bir teknik olmuştur, ancak tarihsel olarak birincil ekran olarak yaygın kullanım bulmak için çok zor olmuştur.
İlk XChem deneyleri 2014 yılında gösterildi ve daha sonra süreci doğrulamak için akademik ve endüstriyel işbirlikçilerle denendi. O zamandan beri, büyük bir araştırma çabası ve önemli ışın süresi, numune hazırlamayı kolaylaştırdı, hızlı takip olanaklarına sahip bir parça kütüphanesi geliştirdi, gözetimsiz veri toplama için I04-1 ışın hattının kapasitesini otomatikleştirdi ve geliştirdi ve veri yönetimi, analizi ve isabet tanımlaması için yeni araçlar uyguladı.
XChem artık büyük ölçekli kristalografik parça taraması için bir tesistir, tüm kristallerin biriktirilmesine kadar olan süreci destekler ve dünya çapındaki akademik ve endüstriyel kullanıcılar tarafından erişilebilir. Hakemli akademik kullanıcı programı, 2016 yılından bu yana, iyi doğrulanmış ve keşif projeleri de dahil olmak üzere mümkün olduğunca geniş bir bilimsel kapsamdan projeleri barındırmak için aktif olarak geliştirilmiştir. Akademik erişim, hakemli teklifler için yılda iki kez yapılan çağrılar yoluyla tahsis edilir ve tescilli çalışmalar Diamond'ın Endüstriyel İrtibat grubu tarafından düzenlenir. Bu iş akışı, çeşitli terapötik alanlardan yüzden fazla hedefe rutin olarak uygulanmıştır ve hem bileşik tasarım için yüksek kaliteli başlangıç noktaları olarak hizmet eden hem de bağlama bölgeleri hakkında kapsamlı yapısal bilgi sağlayan zayıf bağlayıcıları (%1-%30 isabet oranı) etkili bir şekilde tanımlar. Sürecin dayanıklılığı, ana proteaz için 2 haftalık bir geri dönüş de dahil olmak üzere, COVID-19 salgını sırasında SARS-CoV-3 hedeflerinin sürekli taranmasıyla gösterildi.

X-Işını kristalografisi ile parça taraması için XChem boru hattı, bilimsel topluluk tarafından benimsenmesini sağlayacak şekilde kapsamlı bir şekilde düzenlenmiştir (Şekil 5). Bu süreç, isabet oranı %1 ile 0 arasında değişen 150'den fazla tarama kampanyasında47,48,49,50,51,52 ve birçok tekrar eden kullanıcı tarafından doğrulanmıştır. Uygun olmayan (düşük çözünürlüklü, kristalleşme veya kırınım kalitesinde tutarsız) veya DMSO veya etilen glikolü tolere edemeyen kristal sistemler, işlemin erken aşamalarında elimine edilerek zamandan, emekten ve kaynaktan tasarruf edilir. Başarılı kampanyalar, hedef protein üzerindeki potansiyel etkileşim bölgelerinin üç boyutlu bir haritasını sağlar; tipik bir sonuç, SARS-CoV-2'nin ana proteazının XChem ekranıdır (Şekil 6). Tipik olarak, fragman isabetleri şurada bulunur: (a) enzim aktif bölgeleri ve alt cepler48 gibi bilinen ilgi alanları; (b) varsayılan allosterik bölgeler, örneğin, protein-protein etkileşimlerinde53; (c) genellikle yanlış pozitifler olarak kabul edilen kristal paketleme arayüzleri (Şekil 6). Bu yapısal veriler genellikle parça isabetlerini kurşun benzeri küçük moleküller halinde birleştirmek, bağlamak veya büyütmek için bir temel sağlar 1,3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig01.jpg"> Şekil 1: XChem işlem hattı. Platform, proje teklifinden numune hazırlama, veri toplama ve isabet tanımlamaya kadar şematik olarak temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig02.jpg"> Şekil 2: Tarama stratejisi. İş akışı, her kilometre taşının amacını, denemenin gereksinimlerini ve karar noktalarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig03.jpg"> Şekil 3: Numune hazırlama iş akışı. Numune hazırlama için kritik adımlar, her adımdan elde edilen bilgilerin bir SQLite veritabanına kaydedilmesiyle temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig04.jpg"> Şekil 4: XCE kullanarak veri analizi. Veri analizindeki kritik adımlar, ilgili yazılım paketleriyle birlikte bir iş akışı şeması ile temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig05.jpg"> Şekil 5: XChem kullanıcı programının evrimi: Grafik, 2019'da BAG'lerin oluşturulmasıyla 2015'ten 2019'a kadar kullanıcı programının alımını ve konsolidasyonunu ve 2020'de COVID-19 salgını boyunca platformun dayanıklılığını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig06.jpg"> Şekil 6: XChem parça ekranının temsili sonuçları. SARS-CoV2 ana proteaz (Mpro) dimer, yüzeyde sarı renkle gösterilen aktif bölge isabetleri, macenta ile gösterilen varsayılan allosterik isabetler ve yeşil renkle gösterilen yüzey/kristal paketleme artefaktları ile temsil edilir. Şekil, G_1002156 grup ifadesinden Chimera ve Mpro PDB girişleri kullanılarak yapılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu belge, erişim başvurusundan ve veri dağıtımına kadar sonraki tüm adımlardan başlayarak kristal tabanlı parça taraması için tüm XChem sürecini açıklamaktadır.

Diamond Light Source'taki XChem Tesisinde Verimli Parça Taramasının Gerçekleştirilmesi

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

Diamond Light Source'taki XChem Tesisi, rutin, büyük ölçekli kristal grafik parça taraması sağlayarak tüm kristalin biriktirme sürecini destekler. X-ışını kristalografisi, FBDD araç setinin önemli bir parçasıdır. Zayıf bağlayıcıları tanımlayacak kadar hassastır ve moleküler düzeyde etkileşimler hakkında doğrudan yapısal bilgi verir.Parça tabanlı ilaç keşfi, kurşun keşfi için yaygın olarak kullanılan bir stratejidir. Klinik kullanım için altı ilaç verdi ve 50'den fazla molekül klinik deneylere ilerletildi. XChem platformunun geleneksel ıslatma yöntemleri, veri toplama ve analiz yöntemleri üzerindeki ilerlemelerinin ve verimliliğinin etkisi en iyi görsel olarak gösterilmiştir.Kristalleri ve bileşik konumu seçerek başlayın. Bir PC'den TextRank'i açın ve sağ alttaki listeden veya sol üstteki kutuya barkodu yazarak kristal tepsiyi seçin. Doğru görüntü formatını ve tek kuyucuklu görünümü seçin.Kristale çarpmadan bir damlaya çözücü veya bileşikler eklemek için, damla görüntüleri arasında hareket ederken bir deney için uygun bir kristal bulunduğunda damlanın içine sağ tıklayın, ancak kristalden uzağa tıklayın. Echo yazılımını açın ve akustik dağıtıcıyı kullanarak çözümleri dağıtmak için yenisini seçin. Doğru kaynak kuyu plakasını ve sıvı sınıfını seçin.Hedef plaka olarak doğru plaka tipinin seçildiğinden emin olun. Ardından özel kutuyu işaretleyin ve devam edin. İçeri aktar'ı seçin ve ilgili toplu iş dosyasını seçin.Ardından, yazılım tarafından istendiği gibi içe aktarma adımlarını tamamlayın. Dağıtılacak çözeltiyi ve varış yerlerini kontrol etmek için plaka haritalarını kullanın. Ardından, ortaya çıkan istemleri izleyerek protokolü çalıştırın.Kaynak plakasından gelen çözeltiler, seçilen kristal damlalara dağıtılacaktır. Plakayı inkübatörde gerekli süre saklayın. Yarı otomatik kristal toplama cihazını kullanarak kristalleri toplamak için, seçilen ilk kuyu konumuna geçmek için iş akışını başlat düğmesine basın.Kristal hayatta kaldıysa, onu ilmeke monte edin ve listedeki ilk diskte birinci konuma yerleştirerek sıvı nitrojenin içine daldırın. Arayüzden kristal için uygun açıklamayı seçin. Damla bir bileşik ıslatma ise, bileşik durumun açıklamasını kaydedin.Kristal başarıyla monte edilmişse, monte edildi'yi seçin, aksi takdirde başarısız'ı seçin. Kristaller toplandıktan sonra, diskleri barkod tarayıcıya götürün ve diski taramak ve barkodları sabitlemek için teker teker tutucuya yerleştirin. Tarama tamamlandıktan sonra, kapakları disklerin üzerine yerleştirin ve bunları bir sıvı nitrojen depolama deposunda saklayın.Yanlış ortalanmış örnekleri hatırlamak için, ISPyB'deki örnek değiştirici görünümüne bakın ve örnekleri yeşilden kırmızıya bir renk derecelendirmesinde otomatik olarak işlenmiş çözünürlüğe göre derecelendirmek için AP çözünürlüğüne göre sırala'yı seçin. Kırmızı veya sarı numune olup olmadığını kontrol etmek için numunelere tıklayın. Ardından, kristalin ortalanıp ortalanmadığını görmek için kristal anlık görüntülerini kontrol edin.Diamond'ın otomatik işleme sonuçlarını XChem Explorer veya XCE aracılığıyla almak ve analiz etmek için, bir terminalde alt klasör işlemeye gidin ve XChem Explorer'ı açmak için XCE takma adını kullanın. Deneysel verilerin özetini yenilemek için genel bakış sekmesindeki tabloları veri kaynağından güncelleştir düğmesini seçin. Ayarlar sekmesi altında veri toplama dizinini seçin, veri kümeleri sekmesini açın.Hedef seç açılır menüsünden hedefi seçin, veri kümeleri açılır menüsünden otomatik işlemeden yeni sonuçlar al'ı seçin ve çalıştır'a tıklayın. Dimple kullanarak ilk haritaları hesaplamak için haritalar sekmesini açın, açılır menüden referans modeli seçin ve istediğiniz veri kümelerini seçin ve ardından seçilen MTZ dosyalarında Dimple'ı çalıştırın. Ligand kısıtlamaları oluşturmak için, istenen veri kümelerini seçin ve ardından haritalardan seçilen bileşiklerin SCF veya PDB veya PNG dosyasını oluşturun ve kısıtlamalar açılır menüsü.Panda kullanarak isabetleri belirlemek için Pandalar sekmesini seçin, çıkış dizininin doğru tanımlandığından emin olun ve panda'yı çalıştırın. İsabet tanımlama açılır menüsünden analiz edin. Panda tarafından belirlenen isabetleri analiz etmek için panda'yı çalıştırın.İsabet tanımlama açılır menüsünden inceleyin. Coot'u Panda kontrol paneliyle açmak için. Olay haritası ve modeliyle karşılaştırmak için Dimple'dan yük ortalaması ve 2mFo-DFc haritaları.Bir ligand takıldıktan sonra, bağlı durum modelinde herhangi bir değişikliği kaybetmemek için başka bir olaya gitmeden önce ligandı modelle birleştir ve modeli kaydet'e tıklayın. Olay açıklama alanını kullanarak bağlama olayına açıklama ekleyin ve kayıt sitesi bilgilerini kullanarak bağlama sitelerine açıklama ekleyin. Tüm uygulanabilir ligandlar etkinlik haritasına göre modellendikten, birleştirildikten ve kaydedildikten sonra panda.inspect dosyasını kapatın.Panda inceleme modellerini proje dizinine geri aktarın ve seçilen veri kümeleri için ilk iyileştirme turunu başlatın ve iyileştirme artık iyileştirme sekmesinde görünecektir. X-ışını kristalografisi ile parça taraması için XChem boru hattı, bilim camiası tarafından benimsenmesini sağlayacak şekilde kapsamlı bir şekilde modernize edildi. Bu grafik, 2019'da blok tahsis gruplarının oluşturulmasıyla 2015'ten 2019'a kadar kullanıcı programının alımını ve konsolidasyonunu ve 2020'de COVID-19 salgını boyunca platformun dayanıklılığını göstermektedir.Başarılı kampanyalar, hedef protein üzerindeki potansiyel etkileşim bölgelerinin üç boyutlu bir haritasını verir. Tipik bir sonuç, SARS-CoV-2'nin ana proteazının XChem ekranıdır. Enzim aktif bölgeler ve alt cepler gibi bilinen ilgi alanları sarı renkle gösterilmiştir.Protein-protein etkileşimlerinde yer alanlar gibi varsayılan allosterik bölgeler macenta ile gösterilir ve genellikle yanlış pozitifler olarak kabul edilen kristal paketleme arayüzleri yeşil renkle gösterilir. Tarihsel olarak, kristalografiyi birincil parça ekranı olarak kullanmak zor olmuştur. Bu çalışma, numune hazırlamadan nihai yapılara kadar XChem boru hattı protokollerini belgelemiştir.Kristalografik fragman taraması, diğer biyofiziksel teknikleri tamamlar ve genellikle fragman isabetlerini kurşun bileşiklere ilerletmek için gereklidir. Herhangi bir ilaç keşfi hedef sınıfına uygulanabilir.

achieving-efficient-fragment-screening-at-xchem-facility-at-diamond

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu yazıda Gelişmiş Foton Kaynak at GSECARS 13-BM-C beamline bir elmas örs hücre ile tek kristal X-ışını kırınım deneyleri yürütmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. ATREX ve RSV programları verileri analiz etmek için kullanılır.

Yüksek Basınçlı PX de Tek Kristal Kırınımı ^ 2

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Biz dışarı hızlı iki boyutlu x-ışını floresans ve x-ışını microdiffraction eşleme örnekleri Laue (renkliden radyasyon) ya da (tek renkli radyasyon) toz difraksiyon kullanarak tek kristal veya toz taşımak istedim beamline kurulumunu açıklayan. Elde edilen haritalar zorlanma, yönlendirme, faz dağıtım ve plastik deformasyon hakkında bilgi vermek.

Sinkrotron x-ışını Microdiffraction ve Mineral ve kaya örneklerini floresans görüntüleme

Burada, otomatik tarama ve veri toplama seçenekleri kullanılabilir bazı sinkrotron beamlines nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bilim adamları göndermek cryocooled örnekleri sinkrotron için ve kırınım özellikleri ekranlı, veri kümeleri toplanan ve işlenmiş ve, mümkün olan yerlerde, bir yapı çözüm yürütülen — tüm insan müdahalesi olmadan.

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

Diamond beamline I24'te seri senkrotron kristalografisi için sabit hedef numune hazırlama, veri toplama ve veri işleme için kapsamlı bir kılavuz sunuyoruz.

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Helmholtz-Zentrum Berlin'deki kristalografik parça taraması, özel bileşik kütüphaneler, kristal işleme araçları, hızlı veri toplama tesisleri ve büyük ölçüde otomatik veri analizi içeren bir iş akışı kullanılarak gerçekleştirilir. Sunulan protokol, aşağı akış yapısına dayalı ligand tasarımı için umut verici başlangıç noktaları sağlamak için bu tür deneylerin çıktısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır.

Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar

Verilerin sinyal-gürültü oranı, mikrokristallerden X-ışını kırınım ölçümlerinin yapılmasında en önemli hususlardan biridir. VMXm kiriş çizgisi, bu tür deneyler için düşük gürültülü bir ortam ve mikrobülans sağlar. Burada, VMXm ve diğer mikro odak makromoleküler kristalografi kiriş hatları için mikrokristallerin montajı ve soğutulmasından dolayı örnek hazırlama yöntemlerini açıklıyoruz.

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

Burada, uzun dalga boyu makromoleküler X-ışını kristalografi deneyleri için Diamond Light Source'daki I23 kiriş hattında kriyojenik numune hazırlama ve kristallerin vakum endstationına aktarılması için bir protokol sunuyoruz.

Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü

Hedef proteinin erime sıcaklığındaki değişiklikleri izlemek(yani,termal kayma tahlili, TSA), birkaç yüz bileşik parça kütüphanelerini taramak için etkili bir yöntemdir. İç triptofan floresanını ve parça taraması için hafif geri saçılmaları izlemek için robotik destekli nano-Diferansiyel Tarama Florüreti (nano-DSF) uygulayan bir TSA protokolü sunuyoruz.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Burada, EMBL Grenoble'daki HTX Laboratuvarı'nda KristalDirekt teknolojisine dayalı proteinden yapıya, hızlı ligand-protein kompleksi analizi ve büyük ölçekli parça taraması için otomatik makromoleküler kristalografi boru hatlarının nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

Harwell'deki Araştırma Kompleksi'ndeki kristalizasyon tesisini kullanarak proteinlerin kristalleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz ve ardından Diamond'ın Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ (VMXi) ışın hattındaki plakalar içindeki kristallerden yerinde X-ışını kristalografik veri topluyoruz. Numune gereksinimlerini, kristalizasyon protokollerini ve veri toplama yönergelerini açıklıyoruz.

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

Keşfedin, Diamond Light Source'taki XChem tesisinde kristal tabanlı parça taraması için X-ışını kristalografisi yöntemini. Bu verimli platform, ilaç keşfinde zayıf bağlayıcıları belirleyerek yapısal bilgi sağlar.

Diamond Light Source'taki XChem Tesisinde Verimli Parça Taramasının Gerçekleştirilmesi

Daha fazla video keşfet