Diamond Light Source'taki XChem Tesisinde Verimli Parça Taramasının Gerçekleştirilmesi
29 Mayıs 2021
Bu belge, erişim başvurusundan ve veri dağıtımına kadar sonraki tüm adımlardan başlayarak kristal tabanlı parça taraması için tüm XChem sürecini açıklamaktadır.
Diamond Light Source'taki XChem Tesisi, rutin, büyük ölçekli kristal grafik parça taraması sağlayarak tüm kristalin biriktirme sürecini destekler. X-ışını kristalografisi, FBDD araç setinin önemli bir parçasıdır. Zayıf bağlayıcıları tanımlayacak kadar hassastır ve moleküler düzeyde etkileşimler hakkında doğrudan yapısal bilgi verir.
Parça tabanlı ilaç keşfi, kurşun keşfi için yaygın olarak kullanılan bir stratejidir. Klinik kullanım için altı ilaç verdi ve 50'den fazla molekül klinik deneylere ilerletildi. XChem platformunun geleneksel ıslatma yöntemleri, veri toplama ve analiz yöntemleri üzerindeki ilerlemelerinin ve verimliliğinin etkisi en iyi görsel olarak gösterilmiştir.
Kristalleri ve bileşik konumu seçerek başlayın. Bir PC'den TextRank'i açın ve sağ alttaki listeden veya sol üstteki kutuya barkodu yazarak kristal tepsiyi seçin. Doğru görüntü formatını ve tek kuyucuklu görünümü seçin.
Kristale çarpmadan bir damlaya çözücü veya bileşikler eklemek için, damla görüntüleri arasında hareket ederken bir deney için uygun bir kristal bulunduğunda damlanın içine sağ tıklayın, ancak kristalden uzağa tıklayın. Echo yazılımını açın ve akustik dağıtıcıyı kullanarak çözümleri dağıtmak için yenisini seçin. Doğru kaynak kuyu plakasını ve sıvı sınıfını seçin.
Hedef plaka olarak doğru plaka tipinin seçildiğinden emin olun. Ardından özel kutuyu işaretleyin ve devam edin. İçeri aktar'ı seçin ve ilgili toplu iş dosyasını seçin.
Ardından, yazılım tarafından istendiği gibi içe aktarma adımlarını tamamlayın. Dağıtılacak çözeltiyi ve varış yerlerini kontrol etmek için plaka haritalarını kullanın. Ardından, ortaya çıkan istemleri izleyerek protokolü çalıştırın.
Kaynak plakasından gelen çözeltiler, seçilen kristal damlalara dağıtılacaktır. Plakayı inkübatörde gerekli süre saklayın. Yarı otomatik kristal toplama cihazını kullanarak kristalleri toplamak için, seçilen ilk kuyu konumuna geçmek için iş akışını başlat düğmesine basın.
Kristal hayatta kaldıysa, onu ilmeke monte edin ve listedeki ilk diskte birinci konuma yerleştirerek sıvı nitrojenin içine daldırın. Arayüzden kristal için uygun açıklamayı seçin. Damla bir bileşik ıslatma ise, bileşik durumun açıklamasını kaydedin.
Kristal başarıyla monte edilmişse, monte edildi'yi seçin, aksi takdirde başarısız'ı seçin. Kristaller toplandıktan sonra, diskleri barkod tarayıcıya götürün ve diski taramak ve barkodları sabitlemek için teker teker tutucuya yerleştirin. Tarama tamamlandıktan sonra, kapakları disklerin üzerine yerleştirin ve bunları bir sıvı nitrojen depolama deposunda saklayın.
Yanlış ortalanmış örnekleri hatırlamak için, ISPyB'deki örnek değiştirici görünümüne bakın ve örnekleri yeşilden kırmızıya bir renk derecelendirmesinde otomatik olarak işlenmiş çözünürlüğe göre derecelendirmek için AP çözünürlüğüne göre sırala'yı seçin. Kırmızı veya sarı numune olup olmadığını kontrol etmek için numunelere tıklayın. Ardından, kristalin ortalanıp ortalanmadığını görmek için kristal anlık görüntülerini kontrol edin.
Diamond'ın otomatik işleme sonuçlarını XChem Explorer veya XCE aracılığıyla almak ve analiz etmek için, bir terminalde alt klasör işlemeye gidin ve XChem Explorer'ı açmak için XCE takma adını kullanın. Deneysel verilerin özetini yenilemek için genel bakış sekmesindeki tabloları veri kaynağından güncelleştir düğmesini seçin. Ayarlar sekmesi altında veri toplama dizinini seçin, veri kümeleri sekmesini açın.
Hedef seç açılır menüsünden hedefi seçin, veri kümeleri açılır menüsünden otomatik işlemeden yeni sonuçlar al'ı seçin ve çalıştır'a tıklayın. Dimple kullanarak ilk haritaları hesaplamak için haritalar sekmesini açın, açılır menüden referans modeli seçin ve istediğiniz veri kümelerini seçin ve ardından seçilen MTZ dosyalarında Dimple'ı çalıştırın. Ligand kısıtlamaları oluşturmak için, istenen veri kümelerini seçin ve ardından haritalardan seçilen bileşiklerin SCF veya PDB veya PNG dosyasını oluşturun ve kısıtlamalar açılır menüsü.
Panda kullanarak isabetleri belirlemek için Pandalar sekmesini seçin, çıkış dizininin doğru tanımlandığından emin olun ve panda'yı çalıştırın. İsabet tanımlama açılır menüsünden analiz edin. Panda tarafından belirlenen isabetleri analiz etmek için panda'yı çalıştırın.
İsabet tanımlama açılır menüsünden inceleyin. Coot'u Panda kontrol paneliyle açmak için. Olay haritası ve modeliyle karşılaştırmak için Dimple'dan yük ortalaması ve 2mFo-DFc haritaları.
Bir ligand takıldıktan sonra, bağlı durum modelinde herhangi bir değişikliği kaybetmemek için başka bir olaya gitmeden önce ligandı modelle birleştir ve modeli kaydet'e tıklayın. Olay açıklama alanını kullanarak bağlama olayına açıklama ekleyin ve kayıt sitesi bilgilerini kullanarak bağlama sitelerine açıklama ekleyin. Tüm uygulanabilir ligandlar etkinlik haritasına göre modellendikten, birleştirildikten ve kaydedildikten sonra panda.inspect dosyasını kapatın.
Panda inceleme modellerini proje dizinine geri aktarın ve seçilen veri kümeleri için ilk iyileştirme turunu başlatın ve iyileştirme artık iyileştirme sekmesinde görünecektir. X-ışını kristalografisi ile parça taraması için XChem boru hattı, bilim camiası tarafından benimsenmesini sağlayacak şekilde kapsamlı bir şekilde modernize edildi. Bu grafik, 2019'da blok tahsis gruplarının oluşturulmasıyla 2015'ten 2019'a kadar kullanıcı programının alımını ve konsolidasyonunu ve 2020'de COVID-19 salgını boyunca platformun dayanıklılığını göstermektedir.
Başarılı kampanyalar, hedef protein üzerindeki potansiyel etkileşim bölgelerinin üç boyutlu bir haritasını verir. Tipik bir sonuç, SARS-CoV-2'nin ana proteazının XChem ekranıdır. Enzim aktif bölgeler ve alt cepler gibi bilinen ilgi alanları sarı renkle gösterilmiştir.
Protein-protein etkileşimlerinde yer alanlar gibi varsayılan allosterik bölgeler macenta ile gösterilir ve genellikle yanlış pozitifler olarak kabul edilen kristal paketleme arayüzleri yeşil renkle gösterilir. Tarihsel olarak, kristalografiyi birincil parça ekranı olarak kullanmak zor olmuştur. Bu çalışma, numune hazırlamadan nihai yapılara kadar XChem boru hattı protokollerini belgelemiştir.
Kristalografik fragman taraması, diğer biyofiziksel teknikleri tamamlar ve genellikle fragman isabetlerini kurşun bileşiklere ilerletmek için gereklidir. Herhangi bir ilaç keşfi hedef sınıfına uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu makale, erişim başvurusundan veri yayımına kadar olan adımları detaylandırarak, kristal tabanlı fragman taraması için kullanılan kapsamlı XChem sürecini açıklamaktadır. Diamond Light Source bünyesindeki XChem Tesisi, verimli X-ışını kristalografisi aracılığıyla fragman tabanlı ilaç keşfini geliştirmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Fragment tabanlı ilaç keşfi (FBDD)
- X-ışını kristalografisi
- Yapısal biyoloji
Arka Plan
- Fragman tabanlı ilaç keşfi, öncü bileşik keşfi için kullanılan bir stratejidir.
- X-ışını kristalografisi, moleküler etkileşimler hakkında yapısal bilgiler sağlar.
- Geleneksel emdirme yöntemlerinin, XChem ile giderilen kısıtlamaları vardır.
- XChem platformu, COVID-19 pandemisi sırasında dayanıklılık göstermiştir.
Çalışmanın Amacı
- Numune hazırlığından nihai yapılara kadar XChem boru hattı protokollerini belgelemek.
- Fragman tarama için XChem platformunun etkinliğini göstermek.
- Kristalografik fragman taramanın ilaç keşfi üzerindeki etkisini vurgulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Tarama için kristallerin ve bileşiklerin seçimi.
- Çözelti dağıtımı için akustik dağıtıcıların kullanımı.
- Yarı otomatik cihazlar kullanılarak kristallerin toplanması.
- XChem Explorer ve Panda yazılımları aracılığıyla veri analizi.
Ana Sonuçlar
- Başarılı kampanyalar, etkileşim bölgelerinin üç boyutlu haritalarını sunar.
- Kullanıcı programının 2015'ten 2019'a kadar olan benimsenme oranları belgelenmiştir.
- Proteinler üzerindeki potansiyel allosterik bölgelerin ve aktif bölgelerin tanımlanması.
- Basitleştirilmiş protokoller, daha geniş bilimsel topluluğun erişimine imkan tanır.
Sonuçlar
- XChem iş akışı, fragman tarama verimliliğini önemli ölçüde artırır.
- Kristalografik fragman tarama, diğer biyofiziksel teknikleri tamamlar.
- XChem platformundaki ilerlemeler, devam eden ilaç keşfi çalışmalarını desteklemektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Fragman tabanlı ilaç keşfi, X-ışını kristalografisinin hem bağlanma afinitesini hem de öncü bileşik optimizasyonu için gerekli olan yapısal detayları sağladığı zayıf moleküler etkileşimlerin hassas tespitine dayanır. Diamond Light Source'daki XChem Tesisi, numune hazırlığından veri gönderimine kadar kristalografik fragman taramasını kolaylaştırarak, zayıf bağlayıcıların yüksek yapısal doğrulukla rutin olarak tanımlanmasını sağlar. Bu yetenek, çeşitli terapötik alanlarda erken hedef doğrulamayı ve hit-to-lead (hit'ten öncü bileşiğe) ilerlemesini destekleyerek keşif süreçlerindeki mekanistik belirsizliği azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Ligand bağlanma modlarının atomik çözünürlükte doğrudan gözlemlenmesi yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kampanya yatırımı öncesinde hedef etkileşimini ve bağlanma bölgesi erişilebilirliğini doğrulayarak biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Öngörücü Değer: Tanımlanmış etkileşim geometrilerine sahip fragmanları belirleyerek medikal kimya için yüksek güvenilirlikli başlangıç noktaları oluşturur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Kampanyalar boyunca güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanıyan standartlaştırılmış, tekrarlanabilir yapısal çıktılar sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: I04-1 demet hattında otomatik numune işleme ve operatörsüz veri toplama yoluyla yüksek kapasiteli taramanın kolaylaştırılmasını sağlar.
- Veri Kalitesi: Hit doğrulamasını ve sonraki rafine etme işlemlerini destekleyen kantitatif elektron yoğunluğu haritaları ve ligand kısıtlamaları üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Fonksiyonla ilgili etkileşim bölgelerini haritalandırarak biyobelirteç geliştirme ile uyumlu yapısal içgörüler sağlar.
- Preklinik Risk Azaltma: SARS-CoV-2 ana proteaz taramasında 3 haftalık bir geri dönüş süresiyle gösterildiği üzere, yeni ortaya çıkan hedeflerden elde edilen hitlerin hızla takip edilmesine olanak tanır.
- Portföy Uygunluğu: Farklı hedef sınıfları genelinde bağlanmaya dair yapısal kanıtlar sunarak riskten arındırılmış ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
XChem platformu, erken hedef doğrulamadan lider bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre olarak, hit seçimi ve optimizasyon stratejilerine temel oluşturan yapısal veriler sunar.
- Keşif Biyolojisi: Bileşik-hedef etkileşimlerine dair doğrudan yapısal kanıtlar sunarak bağlanma mekanizmalarını aydınlatır ve hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tekrarlanabilirliği sağlayan otomatik kristal işleme, solvent dağıtma ve veri işleme iş akışları aracılığıyla analiz hazırlığını mümkün kılar.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırmalı analize olanak tanıyan ligand bağlanma olay haritaları, rafine edilmeye hazır modeller ve bölge açıklama notları dahil olmak üzere ölçülebilir çıktılar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Hedef etkileşimi ve allosterik modülasyon için yapısal bağlam sağlayarak fragment hitlerini preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Hakemli akademik ve tescilli endüstriyel yollarla erişilebilen, yeniden kullanılabilir bir yapısal tarama kapasitesi olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Zayıf bağlayıcı etkileşimlerin doğrudan yapısal görselleştirmesi yoluyla sağlanan öngörülebilir güven, hedef doğrulamadaki belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Optimize edilmiş protokoller, otomatik dağıtım ve XChem Explorer aracılığıyla merkezi veri yönetimi sayesinde standartlaştırma ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Biyofiziksel tarama elemesini tamamlayan yapısal hit onayı sağlayarak geliştirilmiş devam/durdur kararları.
- Portföy Etkisi: Bağlanma bölgesi plastisitesi ve etkileşim sıcak noktaları üzerindeki yapısal verilerle mümkün kılınan riskle uyumlu önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Kristalografi, fragman kütüphanesi yönetimi ve yapısal veri yorumlama konularında uzmanlık gerektirir.
- Sinkrotron ışın hatlarına, akustik dozajlama sistemlerine ve otomatik kristal toplama araçlarına erişime bağlıdır.
- ISPyB ve XChem Explorer aracılığıyla örnek takibi, veri adlandırma ve depolama protokollerinde ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Kristal kalitesi, çözücü uyumluluğu ve hedefe özgü daldırma koşulları için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Pratik sınırlamalar, çalışmada belirtildiği üzere, kristal elde edilebilirliğine ve belirli hedeflerin X-ışını hassasiyetine olan bağımlılığı içerir.
