Name: Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Öğrenin, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi ile makromoleküler komplekslerin yapı tayini için uzaktan ızgara tarama ve veri toplama yöntemlerini. Bu teknik, yapısal biyologlara yüksek çözünürlüklü analiz imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu'nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen iNEXT-Discovery (Grant 871037) tarafından desteklendi. J B. R. White, Wellcome Trust (215064/Z/18/Z) tarafından finanse edilir. FEI Titan Krios mikroskopları Leeds Üniversitesi (UoL ABSL ödülü) ve Wellcome Trust (108466/Z/15/Z) tarafından finanse edildi. M Iadanza'ya mikrografi analiz senaryosunu kullandığı için teşekkür ederiz. Wellcome Trust, MRC ve BBRSC tarafından finanse edilen İngiltere'nin ulusal Elektron Biyo görüntüleme Merkezi'ndeki (eBIC) kriyo-EM tesislerine erişim ve destek için Diamond Light Source'u kabul ediyoruz.

Çıkar çatışması bildirilmiyor.

Bu protokolde, rutin SPA'ya uygun numuneler için geçerli temel bir boru hattı tanımladık. İnce film oluşumu ve vitrifikasyonunun bu filtre kağıdı şişirme yöntemi, bugüne kadar SPA projelerinin büyük çoğunluğunda kullanımı göz önüne alındığında şüphesiz başarılı olsa da, bir dizi dezavantajla birlikte gelir. Bunlar arasında numune wastage, ince filmi oluşturmak ve numuneyi dondurmak için gereken yavaş zaman ölçekleri (saniye), geri alınamazlık27 ve fazla sıvıyı lekelendirmek için filtre kağıdı kullanmanın olumsuz etkileri bildirilmiştir50. Son zamanlarda, ince film üretiminin tekrarlanabilirliğini artırmak için yeni teknolojiler geliştirildi51,52. Örnek uygulama ve vitrifikasyon arasındaki süreyi azaltan başka teknolojiler geliştirilmiştir53,54,55. İnce film oluşumu için filtre kağıdı tabanlı yöntemler, yazma sırasında SPA cryoEM numune hazırlamanın en yaygın yöntemi olmaya devam ederken, bu yeni teknolojiler ızgara vitrifikasyonunun verimliliği ve tekrarlanabilirliği açısından bir dizi fayda sağlamanın yanı sıra, vitrifikasyondan önce zaman çözünürlüğü ve hızlı karıştırma gibi ek deneysel boyutlar getirmek için yeni fırsatlar yaratabilir.
Çoğu kullanıcı için ızgara tarama süreci şu anda, parçacık dağılımını değerlendirmek için ızgara boyunca yüksek büyütme görüntülerinin alınmasıyla düşük büyütme atlaslarının edinilmesini içeren nitel bir süreçtir. Bu, bazı numune türleri için yeterince sağlam bir yaklaşım olsa da, örneğin küçük (<200 kDa) örneklerle veya düşük çözünürlüklü morfolojinin bir dizi parçacık dağılımı olup olmadığını gözle tanımlamayı zorlaştırdığı durumlarda, örneğin araştırmacının görüntülemeyi umduğu şey olup olmadığını veya tercih edilen bir yönelime sahip olup olmadığını göz göre göre değerlendirmek zor olabilir. Bazı projeler için, örneğin bir ligand'ın nereye bağlı olduğu veya örneğin küçük (örneğin, 10 kDa) bir kompleksle ilişkili olarak hala mevcut olup olmadığını değerlendirmek için numunenin nerede tarandığını belirlemek imkansızdır. Bu projeler için, veri analizi için tam otomatik işlem hatları, görüntü işleme adımlarından 2D sınıflandırmaya veya hatta 3D sınıflandırmaya ve iyileştirmeye kadar ilerleyebilen 'kısa' 0,5 - 1-h koleksiyonlarıyla birleştiğinde, daha uzun bir koleksiyonun garanti edilip edilmeyeceğini verimli bir şekilde belirlemeye yardımcı olacaktır. Bu boru hatları hala geliştirilmektedir ve şu anda yaygın olarak uygulanmamaktadır, ancak özellikle zorlu numuneler için cryoEM ızgara taramasının verimliliğini artırma potansiyeline sahiptir.
Doğrudan elektron dedektörlerindeki iyileştirmelerin yanı sıra mikroskopideki değişiklikler, görüntü kaydırma veri toplama gibi görüntü işlemedeki gelişmelerle birlikte, veri toplama sırasında üretilen görüntülerin verimini ve kalitesini artırmıştır. Toplanan veri oranındaki bu artış, elde edilen birçok TB veri öncesinde cryoEM ızgaralarının kapsamlı bir şekilde taranmesi gereğini vurgulamaktadır.
CryoEM SPA gerçekten yaygın bir yapısal biyoloji tekniği haline gelmiştir ve çoğu durumda heterojen ve labile makromoleküler kompleksler gibi bazı örnek sınıfları için 'git' yaklaşımıdır. Buradaki protokol SPA boru hattına temel bir genel bakış açıklarken, burada kapsanan her bölüm (ızgara vitrifikasyonu ve taraması, kriyoEM ve görüntü işleme) bir SPA projesinin geliştirilmesi sırasında kendi başına ve keşfedilmeye değer bir konudur. Örnek hazırlama ve mikroskopi teknolojileri ilerledikçe ve yeni görüntü işleme algoritmaları ve yaklaşımları çevrimiçi oldukça, SPA bir boru hattı olarak gelişmeye devam edecek ve araştırmacıların karmaşık biyolojik sistemler hakkında fikir edinmelerine yardımcı olacaktır.

Tek parçacıklı CryoEM Yaşamı moleküler düzeyde araştırmak için yapıyı anlamalıyız. Protein yapısını araştırmak için NMR, X-ışını kristalografisi, kütle spektrometresi ve elektron mikroskopisi (EM) gibi birçok teknik mevcuttur. Bugüne kadar Protein Databank'a (PDB) yatırılan yapıların büyük çoğunluğu X-ışını kristalografisi kullanılarak çözülmüştür. Bununla birlikte, ~2012'den itibaren kriyo-elektron mikroskopisi (cryoEM) protein yapısının belirlenmesi için yaygın bir teknik haline geldi ve kullanımı önemli ölçüde arttı. Elektron Mikroskopi Veri Bankası'na (EMDB) yatırılan toplam EM haritası sayısı (Aralık 2020 itibarıyla) 2012 yılında 1.566 iken 13.421'dir (Şekil 1, www.ebi.co.uk). 2012 yılında cryoEM yoğunluk haritalarında modellenen atomik koordinatların sayısı sadece 67 idi, ancak Aralık 2020 itibarıyla 2.309 yapı birikti, 35 kat artış. Üretilen cryoEM yoğunluk haritalarının kalitesi ve miktarındaki bu temel büyüme, bazen 'çözünürlük devrimi' 1 olarak da adlandırılır, birden fazla alandaki ilerlemelerin bir birleşmesine neden oldu: doğrudan elektron dedektörleri olarak bilinen görüntüleme için yeni kameraların geliştirilmesi; yeni yazılım; ve daha kararlı mikroskoplar2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> Şekil 1: 2012'den Aralık 2020'ye kadar EMDB'ye toplu gönderimler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank"></a>
Tek parçacık analizi (SPA), virüsler7,8, membran proteinleri9,10, sarmal derlemeler11 ve boyutları büyüklük sıralarına göre değişen diğer dinamik ve heterojen makromoleküler kompleksler12,13 dahil olmak üzere izole komplekslerin5,6 yüksek çözünürlüklü yapılarını aydınlatarak çok çeşitli örnek türlerinde biyolojik içgörü oluşturmak için güçlü bir araçtır (39 kDa'dan itibaren 14,15 ila onlarca megadalton). Burada, örnekten yapıya cryoEM SPA için standart bir işlem hattı protokolü açıklanmıştır.
Bu boru hattına başlamadan önce, arıtılmış bir numune, aşağı akış başarısı şansını değerlendirmek için biyokimyasal analize tabi tutulmalıdır. Uygun bir numunenin hazırlanması, özellikle geçici ve heterojen (hem bileşimsel hem de konformasyonsal) kompleksler için SPA'nın önündeki en büyük engeldir. Makromoleküler karmaşık preparat, her kriyoEM mikrografında birçok parçacık elde etmek için yeterli konsantrasyonda ve cryoEM analizine çok uygun bir tampon bileşiminde mümkün olduğunca az kirletici içermelidir. Sakkaroz, gliserol ve yüksek (~&gt; numune boyutuna, özelliklerine ve diğer tampon bileşenlerine bağlı olarak 350 mM tuz konsantrasyonları) dahil olmak üzere bazı tampon bileşenleri vitrifikasyon sürecine müdahale edebilir veya görüntülerdeki sinyal-gürültü oranını azaltabilir, yapı belirlemesini engelleyebilir16.
Tipik olarak, örnek saflığı değerlendirmek için minimum boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve SDS- PAGE jel analizi kullanılmalıdır17,18, ancak dairesel dikroizm, fonksiyonel tahliller, SEC çok açılı ışık saçılımı ve termal stabilite testleri kriyoEM analizinden önce makromoleküler karmaşık preparatların nitel analizi için yararlı araçlardır. Bununla birlikte, bu biyokimyasal analizlerden elde edilen sonuçlar, numunenin yapısal heterojenliği ve kriyoEM ızgarası üzerindeki davranışı hakkında çok az fikir verebilir. Bu nedenle, negatif leke EM rutin olarak kompozisyonel ve konformasyonel heterojenliği değerlendirmek için hızlı, ucuz ve güçlü bir araç olarak kullanılır ve bu nedenle bir arıtmadan hangi elution fraksiyonunun en umut verici olduğunu veya farklı tampon bileşimlerini taramanın iyi bir yoludur19,20. Umut verici bir örnek belirlendikten sonra SPA cryoEM boru hattına geçebiliriz. Negatif leke her zaman cryoEM'de görülen sonraki sonuçlarla hizalamaz; bazen bir örnek negatif leke ile zayıf görünür, ancak cryoEM'de vitreus buzda görüldüğünde iyileşir. Buna karşılık, bazen numuneler negatif leke adımları sırasında mükemmel görünür, ancak cryoEM'e ilerlerken önemli ölçüde daha fazla optimizasyon gerektirir. Bununla birlikte, vakaların çoğunda negatif leke yararlı bir kalite kontrol adımı sağlar.
Vitrifikasyon Elektron mikroskopunun vakum sistemi içindeki zorlu ortam, düzeltilmemiş biyolojik numunelerde hem dehidrasyona hem de radyasyon hasarına neden olur21. Bu nedenle, numuneyi doğal bir durumda görüntülemek için, biyolojik numune görüntülemeden önce korunmalıdır. Makromoleküler komplekslerin saf preparatları için vitrifikasyon, kompleksin atomik ayrıntılarını korurken cryoEM ile görselleştirilmesini sağlamak için tercih edilen yöntemdir. Vitrifikasyonun bir örnek hazırlama yöntemi olarak keşfedilmesi, Dubochet'in 2017 Nobel Kimya Ödülü'nde tanındığı biyolojik örneklerin elektron mikroskopisinde temel bir ilerlemeydi. Örnek vitrifikasyon, kriyoEM ızgara desteğinde askıya alınmış, genellikle onlarca nm kalınlığında, ilgi çekici örneği içeren ince bir çözelti tabakası oluşturmayı içerir. İnce film daha sonra ~-175 °C'de sıvı etan gibi bir kriyojende son derece hızlı bir şekilde dondurulur. Donma oranı ~106 °C/s'dir, amorf veya vitreus buz formları kadar hızlıdır ve numuneyi ince, sağlam bir filmle askıya alır22.
Dikkate alınması gereken ilk değişken, seçilen cryoEM ızgara desteğidir23. EM ızgarası genellikle bir destek yapısı üzerinde perforasyonlu (normal veya düzensiz) amorf bir karbon filmden oluşur. Destek yapısı tipik olarak genellikle bakırdan yapılmış 3,05 mm çapında dairesel bir metal ızgaradır, ancak altın veya molibden (tercih edilen termal genleşme özelliklerine sahip24) gibi diğer metaller kullanılabilir. Bazen, grafen, grafen oksit veya ince (~1-2 nm) amorf karbon tabakası gibi ızgara boyunca ek bir ince, sürekli destek uygulanır. Standart kriyoEM ızgaraları (en yaygın olarak delikli 400-200 örgü bakır (1,3 μm ile ayrılmış 1,2 μm yuvarlak delikler (r1,2 /1.3) veya 2 μm ile ayrılmış 2 μm karbon desteği - birçok farklı desen mevcut olmasına rağmen) bugüne kadar bildirilen yapıların büyük çoğunluğunda kullanılmıştır, gelişmiş iletkenliğe ve azaltılmış numune hareketine sahip yeni ızgara teknolojileri bildirilmiştir25 . Seçilen ızgaralar hidrofilik ve numune uygulamasına uygun hale getirmek için bir kızdırma deşarjı / plazma temizleme tedavisine tabi tutulur26.
Işıltı deşarjını takiben, bir sonraki aşama ince film oluşumudur. Bu ince film en yaygın olarak ızgaradaki fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdı kullanılarak oluşturulur. Bu manuel olarak gerçekleştirilebilirken, Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) ve CP3 (Gatan) dahil olmak üzere bir dizi dalma dondurma cihazı ticari olarak mevcuttur. Bu cihazlarla, çözeltideki ~3-5 μL numune EM ızgarasına uygulanır ve ardından filtre kağıdı kullanılarak fazla çözelti şişirilir. Üzerinde ince bir film asılı olan ızgara, daha sonra sıvı nitrojen (LN2) ile ~-175 °C'ye soğutulan sıvı etan içine daldırilir. Dondurulduktan sonra, ızgara görüntülemeden önce ve görüntüleme sırasında sapma noktasının (-137 °C) altında bir sıcaklıkta tutulur.
Numune taraması ve veri toplama Bir cryoEM ızgarasının vitrifikasyonunu takiben, bir sonraki aşama, ızgaranın kalitesini değerlendirmek ve ızgaranın yüksek çözünürlüklü veri toplamaya devam etmek için uygun olup olmadığını belirlemek için ızgarayı taramaktır. İdeal bir cryoEM ızgarası, numunenin en uzun boyutunu barındırmak için yeterli olan buz kalınlığına sahip vitreus buza (kristal buzun aksine) sahiptir ve çevredeki buzun ortaya çıkan görüntüye mümkün olduğunca az gürültü katmasını sağlar. Buz içindeki parçacıklar biyokimya ile tutarlı bir boyuta ve (biliniyorsa) şekle sahip olmalı ve ideal olarak parçacık yönelimlerinin rastgele dağılımı ile monodisperz olmalıdır. Son olarak, ızgara istenen veri toplama uzunluğunu karşılamak için yeterli kalitede alanlara sahip olmalıdır. Numuneye bağlı olarak, bu, optimum ızgaralar üretilene kadar birçok vitrifikasyon ve tarama yinelemesi alabilir. Hem neyse ki hem de ne yazık ki, cryoEM ızgaralarındaki parçacık dağılımını değiştirmek için ampirik olarak test edilebilen çok çeşitli değişkenler vardır (16,27'de incelenmiştir). Bu yazıda membran protein projesi10 için temsili sonuçlar gösterilmiştir.
Uygun bir kılavuz belirlendikten sonra veri toplama işlemine devam edilebilir. Biyolojik numuneler için kriyo-iletimli elektron mikroskoplarının çeşitli modelleri, yüksek çözünürlüklü verileri otomatik bir şekilde toplamak için optimize edilmiştir. Genellikle, veriler 300 kV veya 200 kV sistemlerinde toplanır. EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 ve SerialEM31,32 gibi yazılımlar kullanılarak otomatik veri toplama elde edilebilir. Modern dedektörlerle otomatik veri toplama genellikle 24 saat içinde terabayt (TB) ham veri ile sonuçlanır (ortalama veri kümeleri ~ 4 TB boyutundadır).
Dünyanın büyük bir kısmında uygulanan COVID-19 kısıtlamaları nedeniyle (Aralık 2020'de yazma zamanı), birçok mikroskopi tesisi uzaktan erişim sunmaya geçti. Izgaralar bir mikroskobun otomatik yükleyicisine yüklendikten sonra, veri toplama uzaktan gerçekleştirilebilir.
Görüntü işleme ve model oluşturma Veri toplama oturumunun genellikle 0,5-4 gün olabileceği durumlarda, sonraki görüntü işleme, bilgi işlem kaynaklarının kullanılabilirliğine bağlı olarak haftalar ve aylar sürebilir. İlk görüntü işleme adımları için standarttır, yani hareket düzeltme ve kontrast aktarma işlevi (CTF) tahmini 'anında' 33,34 gerçekleşir. Aşağı akış işleme için, çok sayıda yazılım paketi vardır. Parçacıklar 'toplanır' ve mikrografilerden çıkarılır35,36. Parçacıklar çıkarıldıktan sonra, standart bir protokol, parçacıkların homojen bir alt grubuna ulaşmak için birkaç sınıflandırma turu (hem iki boyutlu (2B) hem de üç boyutlu (3D) ve / veya belirli ilgi alanlarına odaklanmış) işlemek olacaktır. Parçacıkların bu homojen alt kümesi daha sonra 3D rekonstrüksiyon üretmek için birlikte ortalamalanır. Bu noktada veriler, örneğin CTF arıtma, bozulma düzeltmeleri37 ve Bayes parlatma38 aracılığıyla mümkün olan en yüksek kalite haritasını üretmek için genellikle daha fazla düzeltilir. Bu görüntü işlemenin sonucu, ilgi çekici biyolojik örneğin 3D cryoEM haritasıdır. 300 kV mikroskop sisteminde toplanan verilerle yeterli kalitede bir ızgaradan 'standart' otomatik tek parçacık deneyinde ulaşılan çözünürlük aralığı, protein kompleksinin boyutuna ve esnekliğine bağlı olarak tipik olarak 10 şile 2 şarasındadır. İdeal bir örnekle, SPA iş akışları kullanılarak ~1,2 şçözünürlüklerine ulaşıldı5. Bu protokol bir EM yoğunluk haritası elde etme adımlarını detaylandırırken, bu elde olduğunda, bir protein modelinin takılması ve rafine edilmesi (çözünürlük 3,5 Å'&lt;) veya de novo39 inşa edilmesi yoluyla daha fazla yorumlanabilir. Yapı belirleme deneyleri ile ilişkili veriler, EM yoğunluk haritaları (Elektron Mikroskopi Veri Bankası)40, elde edilen atom koordinatları (Protein Veri Bankası)41 ve ham veri kümeleri (Elektron MikroskopiSi Kamu İmaj Arşivi)42 dahil olmak üzere çevrimiçi kamu depolarına yatırılabilir.
Bu protokolde , Porphyromonas gingivalis'ten dış zar protein kompleksi RagAB (~340 kDa) örnek bir makromoleküler kompleks10 (EMPIAR-10543) olarak kullanılır. CryoEM'e yeni gelenler için, iNEXT Discovery ve Instruct gibi finanse edilen erişim şemaları aracılığıyla eş incelemesine tabi olarak, örnekten yapıya bu işlem hattı aracılığıyla örnekler için destek mevcuttur.

<table><tbody><tr><td>Künt cımbız</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5022</td><td></td></tr><tr><td>Cryo EM yuvarlak saklama kutusu</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3736</td><td></td></tr><tr><td>CryoEM otomatik ızgara kutuları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1084591</td><td></td></tr><tr><td>CryoEM ızgaraları</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>Etan gazı</td><td>Boc</td><td>270595-F</td><td></td></tr><tr><td>LN2&nbsp; köpük dewar</td><td>Agar Scientific</td><td>AG81760-500</td><td></td></tr><tr><td>LN2&nbsp; depolama dewar</td><td>Worthington industries</td><td>HC 34</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Gilson</td><td>10082012</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>Star labs</td><td>s1111-1706</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>BD</td><td>BD 300869</td><td></td></tr><tr><td>Tip II laboratuvar suyu</td><td>Süveyş</td><td>füzyon Vitrobot seçin</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot styrophome konteyner montajı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot araları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72882-D</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2.8.1.10REL</td><td></td></tr><tr><td>TEM sunucusu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6.15.3.22415REL</td><td></td></tr><tr><td>Tia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5.0.0.2896REL</td><td></td></tr><tr><td>Titan krios mikroskobu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Titan Krios G2</td><td></td></tr></tbody></table>

tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi: numuneden yapıya

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Kriyo-elektron mikroskopisi (cryoEM), tek parçacık analizi (SPA) ile makromoleküler komplekslerin yapı tespiti için güçlü bir tekniktir. Genel süreç, i) numunenin kriyoEM ızgarasında desteklenen ince bir filmde vitrifiye edilmesini içerir; ii) parçacık dağılımını ve buz kalitesini değerlendirmek için numunenin taranmasını; iii) ızgara uygunsa, analiz için tek bir parçacık veri kümesi toplamak; ve iv) EM yoğunluk haritası elde etmek için görüntü işleme. Bu protokolde, bir kullanıcının iş akışı sırasında değiştirebileceği değişkenlere ve sık karşılaşılan sorunların giderilmesine odaklanarak, bu adımların her biri için bir genel bakış sağlanır. Uzaktan mikroskop çalışmasının birçok tesiste standart hale gelmesiyle, mikroskoplara fiziksel erişim sınırlı olduğunda kullanıcıların verimli çalışma ve görüntülemede yardımcı olacak görüntüleme protokollerindeki varyasyonlar açıklanacaktır.

Tarama yaparken, ızgaralar atlas aşamasında atılabilir, burada düşük büyütmede çözümlenen özellikler ızgarayı veri toplama için uygun değil olarak işaretler. Örneğin, bir ızgara, ızgara karelerinin çoğunluğu kırılmış olarak önemli mekanik hasara maruz kalmışsa (Şekil 2A) veya ızgaranın vitreus buzsuz 'kuru' göründüğü yerlerde (Şekil 2B). Bu tür ızgaralar genellikle ızgara karelerinin kenarları keskin ve farklı göründüğü için tanımlanabilir. Dalma dondurma cihazı kullanılarak yapılan ızgaraların çoğunda bir buz gradyanı gözlenir (Şekil 2C, D). Parçacık dağılımı, ilgi örneğine bağlı olarak, buz kalınlığına göre önemli ölçüde değişebilir ve bu nedenle parçacık dağılımını değerlendirmek için bir dizi ızgara karesinin taranması önerilir. Araçlar, kullanıcının cryoEM ızgaralarını incelemeye yeni başlayan kullanıcılar için özellikle yararlı olabilecek benzer veya farklı buz kalınlığındaki ızgara karelerini tanımlamasına yardımcı olmak için atlas tarama adımı sırasında EPU yazılımı içinde uygulanmıştır (Şekil 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Şekil 2: Tarama oturumlarından örnek düşük büyütme 'atlas' montajları. A) Izgara karelerinin çoğunluğu kırılarak önemli hasar görmüş bir ızgara - toplama için uygun değil. B) Vitreus buzsuz kuru bir ızgara - toplanmaya uygun değil. C) Izgaranın ~ % 50'si ile bir buz gradyanı gösteren bir ızgara kullanılır. D) Izgaranın ~ % 33'üne sahip bir buz gradyanı kullanılır. Kullanılabilir ızgara kareleri toplama için uygun bir buz kalınlığına sahipse ve bir koleksiyonun minimum süresini karşılamak için yeterli toplama alanı varsa (örneğin, 24 saat) E) Buz kalınlıkları aralığına sahip örnek bir atlas varsa, hem C hem de D veri toplama için uygundur. F) Aynı atlas E'de sunulur, ancak ızgara kareleri buz kalınlığına göre EPU yazılımı tarafından kategorize edilir ve renklendirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Parçacık dağılımını tadırken, beklenen sonuçların doğru bir resmini sağlamak için büyütme ve toplam elektron dozu gibi görüntüleme parametrelerinin veri toplama sırasında kullanılması beklenenlere benzer olduğundan emin olun. Tarama sırasında, ideal bir parçacık dağılımı, bir dizi parçacık yönelimi görülebilen monodispersedir (numuneye ve parçacığın morfolojisinin mevcut bilgisine bağlı olarak, bu tespit edilmesi zor olabilir) (Şekil 3A). Buz, parçacıkların en büyük boyutunu karşılarken mümkün olduğunca ince olmalıdır, eğer buz çok inceyse, elektron ışını ile aydınlatıldığında eriyebilir. Bu, mikrografta aşırı harekete neden olur ve bu özelliği gösteren alanlardan kaçınılmalıdır (Şekil 3B). Kolektif deneyimden, bu etki en sık tamponda deterjan olduğunda gözlenir. Bu, deliğin merkezinde çok ince buzla sonuçlanabilir ve böylece parçacıklar fiziksel olarak dışlanabilir ve kenara doğru zorlanabilir. Bu efekt Şekil 3C'de gözlenir, ancak bu durumda aşırı bir örnek değildir ve bu görüntüler yine de bir veri kümesine yararlı bir şekilde katkıda bulunur. Son olarak, buzun vitreus olması gerekir; gridin (veya ızgaraların) çoğu veya tüm görüntülerin kristal buz (Şekil 3D) gösterdiği alanları veri toplamadan hariç tutun. Genellikle, ızgara karelerinin kenarında vitreus olmayan buz görülür. Okuyucular, daha fazla bilgi için ızgara vitrifikasyonu16 sırasında değiştirilebilen değişkenlerin ayrıntılı incelemelerine ve ince film ortamındaki parçacık davranışının açıklamalarına atıfta bulunulmaktadır46,47.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Şekil 3: Farklı parçacık dağılımlarını gösteren temsili mikrograflar. A) Bir dizi yönelimi benimseyen monodisperse parçacıklarının 'ideal' dağılımı. B) Mikrografiste aşırı harekete neden olan elektron ışınlarına maruz kalınca deforme olduğu deliğin ortasında aşırı ince buz. Bu etki en sık tamponda deterjan bulunduğunda gözlenir C) Buzun deliğin merkezinde daha ince olduğu durumlarda, bu fiziksel olarak parçacıkları merkezden dışlar ve parçacıkların delik kenarına doğru kalabalık olmasına neden olur. Bu durumda, bu görüntülerin yararlı olmasını önlemek için yeterince aşırı değildir, ancak biraz daha kalın alanları taramaya değer olduğunu önerir. D) Buz vitreus değildir, bu örnek mikrografa benzeyen alanlarda veri toplanmamalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Anında görüntü işleme, hataları ve veri toplama ile ilgili sorunları almaya yardımcı olabilir ve bu nedenle mümkün olduğunda her zaman önerilir. Örneğin, mikrografilerdeki aşırı hareket, otomatik doldurucu turbo pompanın aktif olduğunu veya elektron ışını içinde buzun önemli ölçüde hareket ettiği çatlak bir ızgara karesinde veri toplandığını ve ızgara karesinin atlanması gerektiğini gösterebilir. Anında CTF tahmini, pozitif bir odak noktasının (odaklama yerine) uygulandığı durumları (CTF tahmin programlarının ve bu noktaları bulmak için parametrelerin kullanıldığı) ve Volta faz plakasının kullanıldığı faz değişimini belirleyebilir48. Anında görüntü işleme işlem hatları, kullanıcıların mikrografi kalitesini hızlı bir şekilde değerlendirmelerini ve veri toplama değişikliklerinin gerekip gerek olmadığına karar vermelerini kolaylaştırmak için genellikle verilerin grafiksel bir özetini (Şekil 4A) içerir.
Mikrografilerden partikül seçimi, kontaminasyon veya ızgara destek filmi gibi 'yanlış pozitiflerden' kaçınmak optimizasyon gerektirebilir. Bununla birlikte, crYOLO gibi parçacık seçiciler genellikle verilerin 'ilk geçişi' için varsayılan parametreleri kullanarak yeterince iyi çalışır (Şekil 4B), verilerin kalitesini ve aşağı akış başarı olasılığını değerlendirmenin daha kolay olabileceği 2B sınıf ortalamasına ilerlemeyi sağlar. Çoğu proje için, ~&gt; 10k parçacıklarının 2D sınıflandırılması ikincil yapı ayrıntısına sahip sınıfları ortaya çıkarmaya başlamalıdır. 3D'ye ilerlemek için, 2D sınıflandırma aşaması genellikle bir parçacık yönelim aralığını temsil eden sınıfları göstermelidir. Tercih edilen bir yönlendirme ortaya çıkarsa, örnek hazırlama16 veya örnek eğik olarak daha fazla veri toplama işlemi gerekebilir49. İkincil yapı detayını gösteren tüm sınıflar 3D analize ileriye doğru seçilmelidir, 'önemsiz' parçacıklar atılırken (Şekil 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Şekil 4: İlk görüntü işleme adımları. A) 'Anında' görüntü işleme komut dosyasından çıktı. B) CrYOLO genel modeli kullanılarak tanımlanan uygun şekilde otomatik olarak seçilmiş parçacıklara sahip örnek mikrografi (solda) (sağda, kırmızı karelerle sınırlanmış parçacıklarla) Ölçek çubukları (beyaz) 50 nm'dir. C) Kırmızı karede atılan sınıfları ve yeşilde daha fazla işlem için parçacıkların seçildiği sınıfları gösteren 2D sınıflandırmadan elde edilen sonuçlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
İlk modeli oluşturmak için küçük bir parçacık alt kümesi kullanılabilir (Şekil 5A). Bu başlangıç modeli daha sonra 3B sınıflandırma ve iyileştirmede başlangıç modeli olarak kullanılabilir. RagAB durumunda, veri kümesi 3D sınıflandırma sırasında ayrılabilen üç ayrı konformatör içeriyordu (Şekil 5B). Bu sınıfların her birine katkıda bulunan parçacıklar daha sonra bağımsız olarak tedavi edilebilir ve daha sonra daha fazla yorum ve model oluşturmaya tabi olabilecek bir EM yoğunluk haritasını iyileştirmek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Şekil 5: 3D EM yoğunluk haritası oluşturma. A) RELION kullanılarak oluşturulan tipik başlangıç modeli. B) Parçacıkların üç ayrı konformasyon durumlarına ayrıldığını gösteren 5 sınıf üzerinde 3D sınıflandırma: açık-açık (yeşil), açık-kapalı (mavi), kapalı-kapalı (mor). C) Maske oluşturma işlemi. 3D arıtmadan (solda) harita kimera ile görselleştirilmelidir. Birim görüntüleyici daha sonra haritanın ayrık, gürültülü yoğunluktan (ortada) arındırılmış olduğu en düşük eşiği tanımlamak için kullanılabilir. Bu eşik değeri, RELION Maske oluşturma işinde ilk ikilileştirme eşiği olarak girilir. Örnek bir maske çıkışı gri (sağda) olarak gösterilir. D) RagAB'ın açık-kapalı durumunun (EMD-10245) yüksek çözünürlüklü EM yoğunluk haritası, yerel çözünürlük (Å) ile filtrelenmiş ve renklendirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Tek parçacıklı kriyo-EM analizi, yapısal biyoloğun alet kutusunda membran proteinleri, amiloid fibriller, nükleik asit bağlayıcı proteinler ve virüsler dahil olmak üzere çok çeşitli örnekler için geçerli rutin bir teknik haline gelmiştir. Numune hazırlığı tamamlandıktan ve ızgaralar mikroskop içine yüklendikten sonra, Astbury Biyoyapı Laboratuvarı ve eBIC gibi birçok kriyo-EM tesisinde veri toplama uzaktan gerçekleştirilebilir. Başarılı yapı belirlemenin önündeki büyük engeller genellikle bu işlem boyunca bazen gerekli olan birden fazla yineleme ile numune hazırlama ve ızgara tarama aşamalarında yatmaktadır.Burada, uzaktan ızgara tarama ve tek parçacıklı veri toplamayı göstereceğiz. Mikroskop kullanıcı arabiriminin otomatik yükleyici sekmesinde, oku kullanarak seçenekler iletişim kutusunu sekmeyin ve envanter düğmesine basın. Bu, bir kartuş olup olmadığını belirlemek için kasetteki her konumu sırayla kontrol eder.Envanter her yuvada sırayla çalışacaktır. Tüm dolu yuvalar eşlendiğinde, envanter durur. Mikroskop sütununa aktarılacak ızgarayı vurgulayın ve yükle'yi tıklatın.Yuva etiketi, ızgara sahne alanına başarıyla yüklendikten sonra maviden sarıya döner. Izgaraları taramak için EPU yazılımını açın. Hazırlık sayfasında, alım optiklerini ve ayarlarını seçin, ardından açılır menüden atlas hazır ayarını seçin.Uygun ışın ayarı hazır ayarlarını seçin ve parametreleri mikroskopa itmek için sete basın. Kolon vanalarını açmak ve grip ekranını takmak için basın. Bir ışının görünür ve yeterince yayılmış ve dedektörü kaplayacak şekilde ortalanmış olup olmadığını kontrol edin.Gerekirse, X ve Y'deki sahne hareketlerini kontrol etmek için joystick veya sanal el panellerini kullanarak ızgaranın daha ince bir bölgesine gidin.Grip ekranını kaldırın ve EPU'daki önizleme düğmesini kullanarak görüntü alın. EPU'da atlas sayfasına gidin ve yeni oturuma basın. MRC görüntü biçimini seçin ve tarama oturumunu kaydetmek için uygun bir klasör adı ve konumu girin, ardından Uygula'yı tıklatın.Soldaki menüden taramayı seçin. Atlas montajının alınması için her ızgaranın yanındaki onay kutularını işaretleyin, ardından EPU'da tarama oturumunu başlatın. İşaretli her ızgara için bir atlas elde edilir ve tamamlandığında kullanılabilir ızgara kareleri listelenir.Her atlas, tarama sayfasında vurgulanarak görüntülenebilir. İşiniz bittiğinde, toplanan atlasları gözden geçirin ve numune kalitesini daha yüksek büyütmelerde değerlendirmeye uygun ızgaraları tanımlayın. EPU tarama menüsünde seçilen ızgarayı vurgulayın ve yükleme örneğini tıklatın.Atlas tarama menüsünden, şu anda yüklü olan ızgarayı seçin ve ızgara görüntüsünde istenen konumu sağ tıklatıp burada taşıma aşamasını seçerek sahneyi doldurulmuş delikleri içeren bir ızgara karesine taşıyın. EPU hazırlık sayfasına dönün ve ızgara kare hazır ayarını seçin. EPU otomatik işlevler sayfasını açın ve örneği ösantrik yüksekliğe taşımak için ızgara kare hazır ayarıyla sahne eğimine göre otomatik ötenek çalıştırın.EPU hazırlığında, yeni bir ızgara kare önizleme görüntüsü alın. Farklı buz kalınlıklarını gösteren farklı deliklerdeki gri değerlere dikkat edin. Sağ tıklatıp buraya taşıyarak sahneyi bir deliğin üzerine taşıyın.Delik veya ötenatrik yükseklik hazır ayarını seçin ve önizleme'yi tıklatın. Veri toplama hazır ayarını seçin ve parçacıkların kolayca tanımlanmasını sağlayan bir büyütme ayarlayın. Defokus uzaklığını negatif üç ila beş mikrometreye ayarlayın.Izgara boyunca parçacık dağılımı, yönlendirme ve kirlenme için bir dizi buz kalınlığını yeniden değerlendirmek için adımlarla yineleyin. Mikroskop kullanılabilirliğine bağlı olarak, doğrudan veri toplamaya devam edin veya ızgaralar diğer siteler de dahil olmak üzere gelecekteki koleksiyon için mikroskoptan kaldırılabilir. Atlas ayarlarını ayarlayarak ve atlası almak için ızgarayı seçerek taramadan kullanılamayan bir atlas toplayın.Atlası alın ve çıktıyı görmek için ızgara konumuna tıklayın. Atlas tamamlandıktan sonra, ışın ayarı ön ayarlarının her birini projenin deneysel ihtiyaçlarına göre tanımlayın. Görüntü kaydırma kalibrasyonları gerçekleştirin.EPU sayfa oturumu kurulumunu seçip tercihlerden yeni oturum veya yeni oturum seçerek EPU oturumunu ayarlayın. Yeni oturumu seçtikten sonra, önceki ayarları kullanma seçeneği sunan bir açılır pencere görünecektir. Ayarlar öncekinden geçerli EPU oturumuna otomatik olarak yüklenir.Alternatif olarak, tercihlerden yenisini seçin ve bu bilgileri geçerli EPU'ya önceden yüklemek için kaydedilmiş tercihlere sahip bir dosya seçin. Oturum adını bilgilendirici bir şeyle doldurun. Türde, el ile seçin.Edinme modu için, sapmasız görüntü kaydırma koleksiyonu mevcutsa ve isteniyorsa doğru delik merkezileme veya daha hızlı edinme seçin. İstediğiniz görüntü biçimini seçin, sonra depolama klasörünü seçin ve EPU oturum adıyla bir dizin oluşturacaktır. Hangi ızgara deliği aralığının kullanıldığına göre uygun ızgarayı seçin ve uygula tuşuna basın.İlk kılavuz karesini seçin ve bir edinme şablonu ayarlayın. Kare seçime gidin. Tüm kareler yeşilse, sol üstteki tümünün seçimini kaldır'ı tıklatın.Kutucukları sağ tıklatıp açık kutucuğu seçerek açın. Seç'i tıklatıp, sonra sağ tıklatıp sahneyi kılavuz karesine taşı'yı seçerek kılavuz karesi ekleyin veya seçin. Delik seçimine gidin ve otomatik ötenaziye basın.Izgara kare görüntüsü çekilene kadar bekleyin. Otomatik işlev başarısız olursa, bunun nedeni yüksekliğin önemli ölçüde kapalı olması olabilir. Izgara kare büyütmede grip ekranı kullanılarak manuel olarak ayarlanabilir.Delik boyutunu ölçmek için sarı daireleri hareket ettirip doğru boyut ve aralıkla deliklerin üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Delikleri bul tuşuna basın. Deliklerin doğru bulunarak bulunanın.Değilse, delik boyutunu değiştirin ve delikleri tekrar bulun tuşuna basın. Bu işlem sürekli olarak başarısız olursa, ızgara kare büyütmede daha düşük bir sayıya veya daha parlak nokta boyutuna geçmeyi düşünün. Delik seçimini ayarlamak için sağdaki filtre buz kalitesi histogramını kullanın.Bu, kalın buz ve ince buz içeren alanları dışlamak için yararlı olabilir. Bu, oturum sırasında seçilen gelecekteki ızgara kareleri için hatırlanır. Üstteki seçme menüsündeki araçlarla delik seçimini optimize edin.Örneğin, kılavuz çubuğuna yakın delikleri kaldır'ı tıklatın. Şablon tanımına gidin ve acquire tuşuna basın. Bul'u tıklatın ve deliği ortala.Sahne kaymasından sonraki gecikmeyi ve görüntü kaydırma sürelerinden sonra gecikmeyi bir ila beş saniyeye değiştirin, ardından varsa maksimum görüntü kaydırma değerinin istenildiği gibi olduğunu kontrol edin. Edinme alanı ekle'yi tıklatın ve görüntünün herhangi bir yerine tıklayın. Edinme alanını istediğiniz konuma taşıyın.Sağ üstteki netleme aralığını ekleyin. Bir membran protein projesi için tipik bir defokus listesi negatif 0,8 ila negatif üç mikrometre defokus, daha sonra diğer alım alanlarını ekleyin, satın alma alanlarının ışınla iki kat açığa çıkmasın diye düzenleyin. Otomatik odaklama alanı ekle'yi tıklatın ve görüntünün herhangi bir yerine tıklayın.Otomatik odaklama alanını bir deliği çevreleyen karbona taşıyın. Standart uygulama, AFIS kullanırken veya karedeki Z yüksekliği varyasyonuna bağlı olarak her beş ila 15 mikrometrede bir ortalamadan sonra otomatik odaklamaktır. Sürüklenme ölçüm alanı ekle'yi tıklatın.Standart ayar olarak saniyede 0,05 nanometrelik bir eşik ile ızgara karesi başına bir kez drift ölçümü gerçekleştirilir. Sürüklenme ölçüm alanı doğrudan otomatik odaklama alanıyla çakıtabilir. Ne sürüklenme ne de otomatik odaklama alanının bir alım alanıyla çakışmadığından emin olun.Kare seçime geri dönün ve ızgarada edinme için kareleri seçin. Kaç toplama alanı gerektiğini tahmin etmek için toplama alanlarının sayısını ve beklenen veri toplama oranını kullanın. İstenen tüm kareler seçildiğinde, tüm kareleri hazırla'ya basın.Her kare toplandıktan sonra ızgara kareleri arasında gezinin ve seçim fırçasını kullanarak deliklere ince ayar yapın. Numunenin üzerinde bir sahne yerine geçin ve ötenatrik yüksekliği ayarlamak için otomatik işlevleri kullanın. Daha önce ve metinde açıklandığı gibi mikroskop yazılımını kullanarak mikroskop hizalamaları gerçekleştirin.Objektif diyaframı yeniden takıp ortalamadan ve objektif lens astigmatizmasını EPU ile düzeltmeden önce otomatik işlevler içinde koma serbest hizalama gerçekleştirin. Her iki hizalamanın da uygun değerler üzerinde yakınsamasını sağlayın. Otomatik alım çalıştırmasına başlamadan önce, otomatik yükleyici turbo pompasının kapalı olduğundan ve gerekirse objektif diyaframın takıldığından emin olun.Otomatik toplamada, otomatik veri alımını başlatmak için çalıştırmaya başlayın. Bu protokol kullanılarak, kırık veya kuru ızgaralar atlas aşamasında taranabilir ve atılabilir. Izgaraların çoğunda bir buz gradyanı görülür.Tarama sırasında, ideal bir parçacık dağılımı, bir dizi parçacık yönelimi görülebilen monodispersed edilir. Buz çok inceyse, elektron ışını ile aydınlatıldığında eriyebilir ve mikrografide aşırı harekete neden olabilir. Bu en sık tamponda deterjan olduğunda görülür.Buzun vitreus olması gerekiyor, bu yüzden görüntülerin çoğunun kristal buzun dışlandığı ızgara alanları. Mikrografi kalitesini değerlendirmek ve veri toplama değişikliklerinin gerekip gerek olmadığına karar vermek için verilerin grafiksel özeti dahil edildi. crYOLO gibi parçacık seçiciler, verilerin ilk geçişi için yeterince iyi çalışır ve 2D sınıf ortalamasına ilerlemeyi sağlar.İkincil yapı detayını gösteren sınıflar 3D analiz için seçilmeli, önemsiz parçacıklar ise atılmalıdır. Parçacıkların bir alt kümesi, 3B sınıflandırma ve iyileştirme için bir başlangıç modeli oluşturmak için kullanılabilir. RagAB durumunda, veri kümesi 3D sınıflandırma sırasında ayrılabilen üç farklı konformatör içeriyordu.Veri toplama ve sonraki görüntü analizi adımlarındaki başarının, tarama aşamasında iyi optimize edilmiş ızgaraların elde edilmesine ve tanımlanmasına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bir 3D EM yoğunluk haritası elde edildikten sonra, bir protein modelinin takılması ve rafine edilmesi veya atomik bir model de novo inşa edilmesi yoluyla daha fazla yorumlanabilir. Cryo-EM tek parçacık analizi, daha önce mümkün olmayan birçok hedefin yapılandırılmış olarak belirlenmesini sağlar.Özellikle, bu iş akışları son zamanlarda COVID-19 ile ilgili makromoleküllerin yapılarını çözmek için kullanılmıştır.

single-particle-cryo-electron-microscopy-from-sample-to-structure

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu makale, makromoleküllerin doğala yakın durumlarında yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerini elde etmek için kullanılan kriyo-elektron mikroskobu metodolojisini açıklamaktadır. Yöntem, bir makromolekülün 3D rekonstrüksiyonunu oluşturmak için tasarlanan tek parçacık yaklaşımını kullanarak daha fazla bilgisayarlı işleme için uygun görüntüler verir.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Kriyo-elektron mikroskopisinde tek parçacık analizi, biyolojik toplulukların yapısını yüksek çözünürlükte belirlemek için kullanılan ana tekniklerden biridir. Scipion, mikroskop tarafından elde edilen bilgileri işlemek ve biyolojik numunenin 3D yeniden yapılandırılmasını sağlamak için tüm boru hattını oluşturmak için araçlar sağlar.

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM haritaları da 200 kV TEM mikroskopları kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, 200 kV TEM kullanarak yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin başarılı bir şekilde toplanması için gerekli olan doğru optik hizalamaları, veri toplama şemalarını ve görüntüleme alanlarının seçimini ayarlamak için en iyi uygulamaları gösterir.

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Mevcut protokol, kriyo-EM deneylerinde eğimli tek parçacıklı veri toplama için genelleştirilmiş ve uygulanması kolay bir şemayı açıklamaktadır. Böyle bir prosedür, hava-su arayüzüne bağlılık nedeniyle tercihli oryantasyon yanlılığından muzdarip numuneler için yüksek kaliteli bir EM haritası elde etmek için özellikle yararlıdır.

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Bu protokol, numune hazırlama optimizasyonu yoluyla eşit olmayan parçacık dağılımını ele almak için bir örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) kullanan pratik bir yöntem sunar ve araştırmacılara kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanarak makromoleküler yapıları verimli bir şekilde aydınlatmaları için bir referans sağlar.

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Öğrenin, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi ile makromoleküler komplekslerin yapı tayini için uzaktan ızgara tarama ve veri toplama yöntemlerini. Bu teknik, yapısal biyologlara yüksek çözünürlüklü analiz imkanı sunar.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Daha fazla video keşfet