Mısır Planthopper Mikroenjeksiyonu, Peregrinus maidis, CRISPR / Cas9 Genom Düzenleme için Embriyolar

Bugüne kadar, CRISPR sadece bir avuç Hemipteran'da kullanılmıştır. Burada özetlenen protokol, araştırmacıların diğer Hemipteran türlerinde CRISPR ve germline dönüşümünü uygulamalarına yardımcı olabilir. Bu protokol özellikle kurumaya duyarlı böcek embriyoları için geliştirilmiştir.

Protokoldeki birçok adım, diğer böcek türlerinde sonuçları potansiyel olarak iyileştirebilir. Transgenik planthoppers üretme yeteneği, artık virüsleri iletemeyen böcekler oluşturmak gibi yeni kontrol yöntemlerinin kapısını açar. Bu teknik, batı çiçek tırtılları gibi diğer zararlılardaki gen fonksiyonunu incelemek için devrim niteliğinde olacaktır.

Bu CRISPR tekniğini umut verici sonuçlarla thrips embriyoları için uyarladık. Bu sistemdeki uygulamanın başarı için gerekli olduğunu görüyoruz. Burada gösterilen yöntemler, rutin olarak uygulandığında, çeşitli ayarlarda esnek kullanıma izin vermelidir.

Yetişkin Peregrinus maidis böceklerini tutacak bir oda yapmak için, bir onsluk bir bardağın dibinde bir delik açın ve hava değişimi için deliğin üzerine bir ekran yapıştırın. Bir haftalık yetişkin dişi böceklerin seçimi için, böcekleri buz üzerinde kısaca soğutmadan önce, koloniyi bir saat boyunca 15 mililitrelik bir konik tüpe aspire edin. Dişileri, karnın ventral tarafında, tipik olarak karın geri kalanından daha koyu olan ovipozitörün varlığıyla tanımlayın.

Dişileri toplandıkça bardağa aktarın. 15 dişi seçildiğinde, bardağı beş x beş santimetrelik bir parafin balmumu filmi ile kapatın. Filmin üstüne 400 mikrolitre% 10'luk bir sakkaroz çözeltisi uygulayın ve çözeltinin üzerine ikinci bir beş x beş santimetre film parçası yerleştirin.

Yetişkin odasını, yumurtlama ortamı ile doğrudan temas halinde plastik parafin balmumu film tarafı olan bir yumurta toplama kabına yerleştirin ve tüm yumurtlama odasını hava deliklerini kapatmadan plastik sargı ile sarın. Ardından, odayı% 70 nem ve 14 saat ışık, 10 saat karanlık döngü ile 25 santigrat dereceye yerleştirin. Embriyo toplama için, istenen yumurtlama süresinden sonra, 22 x 30 milimetrelik bir kapak kayması üzerine bir x 15 milimetrelik çift taraflı bant şeridi uygulayın ve kapak kaymasını yumurtlama odasının yumurtlama ortamına yerleştirin.

İnce bir fırça ve diseksiyon mikroskobu kullanarak, bireysel yarı saydam embriyoları agar yüzeyinden çift taraflı banda taşıyın. Yaklaşık 25 embriyo seçildiğinde, muz şeklindeki embriyoları yanlarına, daha büyük uçları banda yapıştırılmış şekilde yerleştirin. Embriyoların mikroenjeksiyonu için, ilk olarak, kapak kaymasını, nemlendirilmiş bir başlık içinde diseksiyon mikroskobu altında% 1 agar ile 100 x 15 mililitrelik bir Petri kabı üzerine yerleştirin.

Enjeksiyon basıncını kontrol etmek için, bir kuvars enjeksiyon iğnesinin ucunu bir damla suya yerleştirin ve enjeksiyon döngüsünü başlatın. Basınç ayarını onayladıktan sonra, kapak kaymasının sol tarafından yaklaşarak, iğneyi bir embriyonun daha büyük ucuna yerleştirin. Enjeksiyon solüsyonunu yumurtaya verin ve iğneyi hızla çekin.

Tüm yumurtalar enjekte edildikten sonra, kapak kaymasını yeni% 1 agar kabının yüzeyine yerleştirin ve kabı bir nem odasına yerleştirin. Altı gün sonra, hayatta kalan embriyoları suyla nemlendirilmiş filtre kağıdı içeren 35 x 10 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için temiz su ve ince fırça kullanın. Petri kabını plastik parafin balmumu filmi ile kapatın ve kuluçka odasını 25 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.

Altı ila sekiz gün sonra, ortaya çıkan ilk instar nimflerini yaprak kırpıntılarından oluşan bir Petri kabına aktarmak için ince bir fırça kullanın ve tabağı plastik parafin balmumu filmi ile kapatın. 25 santigrat derecede 48 saat sonra, iki günlük nimflerin tümünü mısır bitkileri içeren bir yetiştirme kafesine aktarmak için ince bir fırça kullanın. Görünür fenotipe sahip enjekte edilenler yeterli sayıda geri kazanılırsa, bir sonraki nesilde hedef özelliğin geri kazanılmasını en üst düzeye çıkarmak için bu böcekleri ayrı ayrı kafesleyin.

Böcekleri uygun sıcaklık ve nem koşulları altında, gerektiğinde taze mısır bitkilerine düzenli transferlerle destekleyin ve beklenen fenotipler için dölleri düzenli olarak tarayın, istenen fenotipi sergileyen bireyleri homozigot çizgiler oluşturmak için kendi kafeslerine yerleştirin. Bu temsili analizde, dört haftada toplam 645 dişiden toplam 6.483 yumurta toplandı. Dişiler tipik olarak iki gün sonra yumurta bırakmaya başlar ve yumurtaların çoğunu dört ila altı gün arasında sağlar, yumurtlama aktivitesi dokuzuncu günde yavaşlar.

Cas9 dokuz enjeksiyonu P.maidis gelişimini etkilemez, çünkü enjeksiyon tamponu ile tedavi edilen embriyolar, Cas9 ile takviye edilen enjeksiyon tamponu ve Cas9 ve üç kılavuz RNA ile takviye edilen enjeksiyon tamponu için gelişim oranları benzerdir. Tampon bellek ve Cas9 kontrolleri için tarama hızları da benzerdir. Bununla birlikte, üç kılavuzlu karışımı alan bireylerin tarama oranları tipik olarak nispeten daha düşüktür.

Bu temsili deneyde, geliştirilen 71 rehber enjekte edilen bireyden 23'ü bir dereceye kadar pigment kaybı gösterdi ve dokuzu yumurtadan çıktı, bu da yaklaşık% 30'luk bir nakavt oranıyla sonuçlandıÜç kılavuzlu karışımın, enjekte edilen bireylerden izole edilen genomik DNA'dan çoğaltılan PCR ürünlerinde gözlemlendiği gibi, beyaz lokustan yaklaşık 180 baz çiftini çıkarması bekleniyor. hem de bu ürünlerden oluşturulan ilişkili dizi verilerinde. Enjeksiyon travmasını en aza indirmek için eğimli iğnelerin kullanılmasını öneririz. Embriyolar enjeksiyondan sonra sızıyor gibi görünüyorsa, daha iyi sonuçlar için iğne uçlarınızı inceleyin.

Devam eden uygulama embriyo sağkalımını artıracaktır. Bugüne kadar, Hemipterans'ta germline dönüşümünü tanımlayan herhangi bir yayın bulunmamaktadır. Bununla birlikte, Cas9 eksprese eden planthoppers yapmak için bu protokolü kullandık.

Genel olarak, Hemipterans'ta germline dönüşümünü gerçekleştirme yeteneği, çok çeşitli genetik haşere yönetimi stratejilerine kapı açar ve böylece insektisit kullanımını azaltır.