Aort Kapak In Vitro Kalsifikasyonu Çalışmak için Fare Interstisyel Kapak Hücrelerinin İzolasyonu
10 Mayıs 2021
Bu makalede, fare aort kapak hücrelerinin iki adımlı bir kollajenaz prosedürü ile izolasyonu açıklanmaktadır. İzole fare valf hücreleri, bu in vitro kireçlenme tahlilleri gibi farklı tahlillerin yapılması ve aort kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler yolların araştırılması için önemlidir.
Transgenik farelerden genetiği değiştirilmiş hücrelerin kullanımında valf kireçlenmesine yol açan sinyal yolunu araştırmak için izole fare valf hücrelerinin kullanımı esastır. İki aşamalı sindirim hızlı ve verimli bir yöntemdir. Bu protokolün en zorlu kısmı, aort kapakçığının sekiz haftalık farelerden izole olmasıdır.
Aort kapakçığını daha iyi görselleştirmek için yaşlı fareler üzerinde pratik yapmak daha iyidir. Deneye başlamadan önce tüm cerrahi aletleri ve çalışma alanını %70 etanol ile temizleyip sterilize edin ve cerrahi aletleri 30 dakika boyunca otoklavlayın. İlk kurulum hazır olduğunda, etanol kullanarak sekiz haftalık ötenazili bir farenin göğsünü ve karın bölgesini temizlemekle başlayın.
Makas kullanarak, farenin karnını ve göğsünü açın, ardından küçük cerrahi makasla sol atriyum ve sol ventrikül arasında kesin. 10 mililitre soğuk PBS perfüzyon yaparak kalpten kan alın ve yükselen aortu üç milimetre tutarak kalbi kesin. Stereomikroskop altında, kalbi ventriküllerin ortasında yatay olarak keserek ve sol ventrikülü aorta doğru keserek aort kapağını parçalara ayırın, ardından aort kapağını dikkatlice parçalara ayırın.
Vanaları 35 milimetrelik küçük bir doku kültürü çanağını bir araya getir. İzole vanaları 75 mililitrelik hücre kültürü çanağını antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre taze hazırlanmış 10 milimolar soğuk HEPES ile yıkayın ve beş mililitre kollajenaz tip birde 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca sürekli sallanarak kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, tüpü beş dakika boyunca, 150 kat G'de santrifüjleyin ve peletin iki mililitre 10 milimolar HEPES ile bir kez 30 saniye boyunca yüksek hızda girdapla yıkayın.
Sonuçta elde edilen süspansiyonu tüpten 35 milimetrelik bir kültür kabına toplayın ve doku parçalarını dikkatlice taze bir tüpe aktarmak için ince cımbız kullanın. Daha sonra peleti 35 dakika boyunca sürekli ajitasyon altında 37 santigrat derecede beş mililitre kollajenaz tip bir ile 15 mililitrelik bir tüpte kuluçkaya yatırın. Hücreleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 150 kez G'de bir mililitre pipet ve santrifüj ile yeniden direrek ayırın.
Ayrılmış peletin iki mililitrelik tam DMEM'de yeniden süngüle edilmesi ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 150 kez G'de santrifüjlenerek hücreleri iki kez temizleyin. Kaplama için, peletin bir mililitrelik tam orta dereceli olarak yeniden ıslatır ve minimum miktarda orta miktarda altı kuyu hücreli kültür çanağının bir kuyusuna ekleyin. Plakaları % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bozulmadan tutun.
Üç günlük kuluçkadan sonra, mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyerek doku kalıntılarına yakın büyümeyi onaylayın. 1.000 hücre görünür olduğunda, doku kalıntılarını otomatik kapatılmış cımbızla dikkatlice çıkarın ve ortamı değiştirin. %70 izdiah ettikten sonra hücreleri deneyin ve 75 mililitrelik doku kültürü çanağını aktarın.
Teste başlamadan önce, biyogüvenlik davlumbazını% 70 etanol ile temizleyin ve DMEM ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra, tohum 100,000 hücre başına altı kuyu plakasına tam DMEM ve kültür 37 santigrat derecede. 24 saat sonra, süpernatant ortamı kireçleme ortamıyla değiştirin ve hücreleri üçüncü gün ortamın yerini alarak 37 santigrat derecede yedi gün kuluçkaya yatırın.
Yedi gün sonra, Arsenazo III reaktifini kullanarak ve emiciyi 650 nanometrede kaydederek 96 kuyu plakasındaki kalsiyum konsantrasyonu ölçün. Temsili analizde, üç ila beş günlük kültürden sonra immünofluoresan lekeleme ile çeşitli kapak hücresi fenotipleri tespit edildi. Fare VIC'leri vimentin ve alfa SMA'sını ifade etti, valf hücrelerinin önemli belirteçleri.
Ek olarak, CD31 immünofluoresan boyama VIC kültüründeki endotel hücrelerinden bulaşma olmadığını doğruladı. Fosfat bakımından zengin kalsilme ortamı ile VIC'leri kültleme, hücrelerde bir kireçlenmeyi uyarır, kalsiyum düğümleri için kırmızı pozitif lekelenme ile daha da doğrulanmıştır. Protokol, farklı farelerden üç ila beş valflik bir havuza dayanmaktadır.
Bulguları doğrulamak için çöp eşi ve üç farklı biyolojik kopyanın kullanılması önemlidir. Fare valf hücrelerinin kullanımı, hücreleri transgenik farelerden izole ederek aort darlığı ile giden moleküler yolu anlamak için hayati öneme sahiptir. Bu protokol daha önce kireçlenmiş aort kapakçığının mineral gerilemesinde reseptöre giden yolun imasını araştırmak için kullanılmıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, aortik kapak kalsifikasyonunda rol oynayan moleküler yolları incelemek için fare aortik kapak hücrelerini izole etmek üzere iki aşamalı bir kolagenaz prosedürünü açıklamaktadır. İzolasyon yöntemi, hücre mineralizasyonunu değerlendirmek için sonraki analizlere olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre biyolojisi
- Sinyal yolları
- Aortik kapak kalsifikasyonu
Arka Plan
- Kalsifikasyon mekanizmalarını anlamada izole kapak hücrelerinin önemi.
- Sekiz haftalık farelerden aortik kapakların izole edilmesiyle ilgili zorluklar.
- Moleküler yolları ortaya çıkarmada transgenik fare modellerinin önemi.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre izolasyonu için iki aşamalı kolagenaz sindirimi.
- Transgenik farelerden aortik kapakların kullanıldığı fare modeli.
- Arsenazo III reaktifi ile kalsiyum konsantrasyon ölçümü de dahil olmak üzere in vitro analizler.
Ana Bulgular
- Kapak hücrelerinin başarılı şekilde izole edilmesi ve kültürü.
- İmmünofloresan boyama ile kapak hücre fenotiplerinin belirlenmesi.
- Birden fazla biyolojik tekrarlama ile bulguların doğrulanması.
Sonuçlar
- Bu çalışma, aortik stenozdaki moleküler mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunan aortik kapak hücrelerini izole etmek için etkili bir yöntem sunmaktadır.
- Bulgular, kalp kapak kalsifikasyonu üzerine daha geniş biyolojik araştırmalara katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of mouse valve interstitial cells (VICs) enables mechanistic interrogation of aortic valve calcification, a key driver of aortic stenosis. This workflow supports early discovery and target validation by providing a disease-relevant in vitro system for pathway analysis and pharmacological testing. The method enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by isolating VICs for pathway interrogation in calcification.
- Supports functional target validation using genetically modified mouse models.
- Facilitates hypothesis-driven testing of molecular drivers and inhibitors of mineralization.
- Provides a platform for evaluating new pharmacological targets in a controlled system.
Screening & Assay Development
- Delivers validated primary cell cultures for reproducible in vitro calcification assays.
- Standardizes cell phenotype confirmation via immunofluorescence for assay reliability.
- Enables quantitative measurement of calcification using calcium reagent and alizarin red staining.
- Prepares scalable systems for compound screening and comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant mechanisms observed in aortic stenosis.
- Supports continuity from genetic models to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Provides a platform for biomarker discovery and mechanistic studies in valve pathology.
- Reduces translational risk by modeling human disease processes in primary mouse cells.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in cardiovascular research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in valve calcification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of calcification across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights to in vivo disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse genetic backgrounds and pharmacological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and assay protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in early-stage cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and compounds for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and primary cell culture techniques.
- Needs access to sterile surgical instruments, biosafety hoods, and analytical reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell isolation and phenotype validation.
- Adaptable to various transgenic mouse models for pathway-specific studies.
- Dependent on careful dissection and pooling of valves to ensure sufficient cell yield and reproducibility.
