Magnaporthe oryzae'de Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Bu yöntem, bitki patolojisinde mantar patogenezinde epigenetik değişikliklerle aday hedef genlerin düzenlenmesinin altında bulunan moleküler mekanizmaların aydınlatıcı yapılmasına yardımcı olabilir. Kromatin immünorektasyon dizileme teknolojisi, tüm genomdaki histonlar ve transkripsiyon faktörleriyle etkileşime giren DNA segmentlerini verimli bir şekilde tespit edebilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, verimliliği ve çözünürlüğü artırabilir.

100 mikrolitre pipet kullanarak yulaf ezmesi domates Agger plakalarına 100 mikrolitre sıvı tam orta ekleyerek başlayın. Bir aşılama döngüsü kullanarak, vahşi tip suşunun ve nakavt suşunun miselini kazıyın. Misel kalıntılarını toplayın ve 250 mililitre sıvı tam ortasına aktarın.

Mantar hyphae'yi 500 mililitre 0,7 molar sodyum klorür çözeltisi ile yıkayın. Sonra mantar miselUM'ını toplayın ve tartın. Mantar miselyumunun bir gramı başına yaklaşık bir mililitre lizis enzim geçirgenliği çözeltisi ekleyin.

28 santigrat derecede dilimleme için hyphae'yi 150 RPM'de sallanarak üç ila dört saat boyunca yerleştirin. Bit hyphae'yi 50 mililitre 0.7 molar sodyum klorür çözeltisi ile yıkayın. Örneği santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice atın.

Protoplast'ı 20 mililitre 0,7 molar sodyum klorür çözeltisinde yeniden askıya alın. Son konsantrasyon% 1 olana kadar çapraz bağlantı için protoplastlar içeren iki mililitre sodyum klorür tamponuna damla damla 37% formaldehitin 55 mikrolitresini ekleyin, reaktif olmayan formaldehiti söndürmek için, her tüpe 10 kat glisin 20 mikrolitre ekleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı dikkatlice atın.

Peleti 0,7 molar sodyum klorür çözeltisinin bir mililitresinde yeniden askıya alın. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı dikkatlice atın ve peletin 750 mikrolitre RIPA tamponunda yeniden askıya alın. 20 kat proteaz inhibitörünün 37,5 mikrolitresini ekleyin.

Ultrasonik homojenizatör kullanarak kromatin sekiz dakika boyunca sonication ile yamum. Örnek ultrasonik olarak kırıldıktan sonra, numune sonicated sonra serbest tüm DNA ve protein içeren giriş olarak numunenin bir kısmını dışarı alın. DNA parçalarının uzunluğunu analiz etmek için sonikasyondan sonra %1 agarose jel elektroforezi çalıştırın.

Santrifüjlemeden sonra, santrifüjlü süpernatantı 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın ve daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. IP denemesini gerçekleştirmeden önce, her kromatin örneğini bir kez RIPA arabelleği ile bir ila 10 arasında bir orana seyreltin. Pipet 50 mikrolitre süper paramanyetik protein boncukları iki mililitre santrifüj tüpüne.

Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin ve manyetik boncukların çökeltilmesine izin verin. Sonra üsttekini çıkarın. Tüpe bir mililitre önceden soğutulmuş ripa tamponu ekleyin ve süper paramanyetik protein boncuklarını üç kez yıkayın.

Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin ve üst standı çıkarın. Her tüpe bir kez RIPA tamponunun 100 mikrolitresini ekleyin. Kromatin örneğinin 30 mikrolitresini, 100 mikrolitre süper paramanyetik protein boncukunu ve tüpe dört mikrolitre H3K4me3 antikoru ekleyin, iyice karıştırın.

Örnekleri bir döner çalkalayıcıya yerleştirin ve dört santigrat derecede 30 kez kuluçkaya yatırın.Boncukları bir mililitre ripa tamponunda yeniden yağlayarak süper paramanyetik protein boncuk antikorunu ve kromatin kompleksini yıkayın. Numuneyi bir mililitre düşük tuz immün kompleks yıkama tamponu ile, ardından bir mililitre yüksek tuz immün kompleks yıkama tamponu ile yıkayın. Boncukları bir mililitre lityum klorür tamponu ile durulayın ve süpernatant çıkarın.

Ardından tüpe bir mililitre TE arabelleği ekleyin. Tüpü bir mililitre TE arabelleği ile tekrar yerleştirin ve bir pipetle üstnatant çıkarın. Her santrifüj tüpüne 100 mikrolitre elüjör tamponu ekleyin.

15 dakika boyunca 65 santigrat derecede elution gerçekleştirin. Dört santigrat derecede 10.000 kez G'de bir dakika santrifüj ve süpernatantı yeni santrifüj tüplerine toplayın. Tüm tüplere beş azı dişi sodyum klorürün sekiz mikrolitresini ekleyin ve DNA proteini çapraz bağlantılarını tersine çevirmek için dört ila beş saat veya bir gecede 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Bir mikroliter Rnase A ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Her tüpe dört mikrolitre protein K ekleyin ve bir ila iki saat boyunca 45 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Santrifüj tüpüne fenal kloroform ve izoamil alkol karışımından 550 mikrolitre ekleyin.

10.000 kez G'de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin. Tüpe 1/10 hacimli üç azı dişi sodyum asetat çözeltisi, 2,5 cilt mutlak etanol ve üç mikrolitre glikojen ekleyin. Numuneyi yağış için gece boyunca eksi 20 santigrat derecede bir buzdolabına yerleştirin.

Ertesi gün, tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı atın. Pelezi üç kez bir mililitre taze hazırlanmış% 75 etanol ile 10.000 kez yıkayın G.Çökeltmeyi yeterince çözmek için 50 mikrolitre steril deiyonize su ekleyin. DNA uçlarını onararak DNA ucu onarım kiti ve metin el yazmasında belirtilen talimatlar kullanarak kör uçlu DNA oluşturmak için.

Üç asal uca adenin temeli eklemek için, 0,2 mikrolitre PCR santrifüj tüpüne 30 mikrolitre DNA, iki mikrolitre su, 10 kat Taq tamponunun beş mikrolitresi, bir milimolar dATP'nin 10 mikrolitresi ve üç mikrolitre Taq DNA polimeraz ekleyin. Bunları karıştırın ve 10 dakika boyunca 72 santigrat derecede bir PCR makinesinde reaksiyona sokabilirsiniz. 0,2 mikrolitre PCR santrifüj tüpünde 10 mikrolitre DNA, 9,9 mikrolitre su, 2,5 mikrolitre T4 DNA ligaz tamponu, 0,1 mikrolitre adaptör oligo karışımı ve 2,5 mikrolitre T4 DNA ligase karıştırarak bağlayıcı ligasyon gerçekleştirin.

Tüpü 16 santigrat derecede dört saat kuluçkaya yatır. PCR astarlarını kullanarak DNA'yı yükseltmek için 10,5 mikrolitre DNA, iki kat yüksek doğrulukta ana karışımın 12,5 mikrolitresini ekleyin. bir mikroliter PCR astar PE 1.0 ve bir mikroliter PCR astar PE 2.0 ila 0.2 mikroliter PCR santrifüj tüpü ve iyice karıştırın.

Mobre2, mospp1 ve moswd2 silme mutantlarının H3K4me3 sinyalleri fonksiyonel hedef bölgelerinde önemli ölçüde azaldı. P131 vahşi tip suşu ile karşılaştırıldığında, mobre2, mospp1 ve moswd2 silme mutantlarında zenginleştirilmiş H3K4me3 kromatin immünorepipitasyon diziliminin sinyalleri büyük ölçüde azaldı. Bu işlemin ardından çip ve talaş qPCR üzerinde çip işlemi yapılabilir.

Genellikle bir proteinin aşağı akış hedef genini taramak ve bilinen genom bağlama bölgelerindeki protein DNA etkileşimlerini incelemek için kullanılırlar.