Name: Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin, sıçan iskelet kas dokusunda nitrat ve nitrit ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemini karşılaştırarak. Bu protokol, küçük örneklerde NO metabolitlerinin doğru kantifikasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Alan N Schechter, MD'ye intramural NIH / NIDDK hibe ZIA DK 0251041-14 tarafından desteklenmiştir.

Hayvan protokolü NIDDK Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ASP K049-MMB-20) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, AAALAC web sitesinde ücretsiz olarak bulunan mevcut Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna göre ele alınmış ve tedavi edilmiştir.
1. Sıçan iskelet kası toplama
<ol><li>Bir sıçan derin anestezi altındayken (% 5 izofluran, kuyruk / bacak sıkışmasına reaksiyon olmadan doğrulanır), sol ventrikülün tepesine 19 G'lik bir iğne yerleştirerek ve sağ atriyumda bir çentik yaparak heparin içeren salin ile perfüzyona başlayın. Heparinli salinin, dokudan en az 1,5 litre / kg akıncaya kadar iç organlardan nüfuz etmesine izin verin. Bu noktada, hayvanlar ekssanguinasyondan ölmüştür ve karkaslar numune toplama için işlenmeye hazırdır. NOT: İyi perfüzyon elde etmek, özellikle nitritin doğru ölçümleri için kritik öneme sahiptir, çünkü nitrit, kalan herhangi bir hemoglobin tarafından nitrata oksitlenir.</li>
	<li>Hedef kas dokularını tanımlayın ve temiz cerrahi aletler kullanarak bunları arka bacaklardan22 çıkarın. Kas dokularından mümkün olduğunca fazla yağ ve bağ dokusu çıkarın.</li>
	<li>İstenilen miktarda kası bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından kuru buz üzerine yerleştirin. Doku ile doldurulmuş tüpleri -80 °C dondurucuda saklayın. NOT: İnsan biyopsi örnekleri durumunda, fazla kanı gidermek için temiz gazlı bezle toplandıktan hemen sonra iyice lekeleyin.</li>
</ol>2. Homojenizasyon için hazırlık
<ol><li>Nitrit koruyucu çözeltinin hazırlanması (durdurma çözeltisi)<ol><li>Damıtılmış suda 890 mM potasyum ferrisiyanür (K3Fe (CN)6) ve 118 mM NEM (N-etilmaleimid) içeren berrak sarı bir çözelti hazırlayın ve kristal olmadığından emin olun. İyonik olmayan yüzey aktif maddeyi (deterjan) 1:9 oranında (v/v, Malzeme Tablosu) ekleyin ve köpüklenmeyi önlemek için hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Durdurma çözeltisini damıtılmış su ile 1:9 oranında seyreltin. Seyreltilmiş durdurma çözeltisini (kas dokusunun seyreltilmiş durdurma çözeltisine 1:5 oranı) homojenizasyon tüpüne yerleştirin. NOT: Yirmi miligram doku 100 μL durdurma çözeltisi gerektirecek ve 200 mg doku tüpte 1000 μL durdurma çözeltisi gerektirecektir. Ek çözeltide deterjan varlığı, hücre zarlarının bozulması için kritik öneme sahiptir. İyonik olmayan herhangi bir deterjan kullanılabilir, ancak kemilüminesans yöntemine müdahale etmediğini doğrulamak için dikkatli olunmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku hazırlama<ol><li>Dokuyu -80 °C dondurucudan çıkarın ve yavaşça buzda çözün. Kalan yağ ve bağ dokusunu iskelet kasından çıkarın. İskelet kası parçalarını kesin ve kuruması için gazlı bez üzerinde lekeleyin.</li>
		<li>Doku miktarını (20, 50 ve 200 mg) tartın. Önceden tartılmış iskelet kasını homojenizasyon tüplerindeki durdurma çözeltisine yerleştirin veya önceden tartılmış dokuyu daha sonra kullanmak üzere temiz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Homojenizasyon
<ol><li>Döner homojenizatör (Şekil 1)<ol><li>Önceden tartılmış iskelet kasını ve önceden ölçülmüş durdurma çözeltisini içeren M tipi tüpü makineye yerleştirin. Her numuneyi iki kez homojenize edin (en yıkıcı homojenizasyon döngüsüne göre ayarlayın) ve tüpü her homojenizasyondan hemen sonra soğuması için 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 2.000 × g ve 4 °C'de kısaca santrifüj yapın. Tam tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve uygun miktarda metanol ekleyin (≥% 99.9, doku ağırlığının 10x'i). 15 s için iyice vorteks. NOT: 20 mg doku için 200 μL metanol kullanın. Metanol, proteinleri doku homojenatından çökeltmek için kullanılır ve kemilüminesans yöntemine müdahale etmez. Başka bir protein çökeltme yöntemi kullanılıyorsa, kemilüminesans ile uyumluluğunu test edin.</li>
		<li>Bir kez daha homojenize edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneleri 4 °C'de 35 dakika ve 3.500 × g santrifüj yapın. Süper nantantı aspire edin ve nitrit / nitrat seviyelerini ölçün veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Boncuk homojenizatörü (Şekil 2)<ol><li>İskelet kası dokusunu boncuk içeren bir tüpe yerleştirin (doku için 1:5 oranı: seyreltilmiş durdurma çözeltisi) ve kullanılan cihazda bulunan en yüksek hızda 45 s için iki kez homojenize edin. Her homojenizasyondan hemen sonra tüpü soğuması için 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>5 saniye boyunca küçük bir masaüstü santrifüj (2.000 x g) kullanarak kısaca santrifüj. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve uygun miktarda metanol ekleyin (saflık ≥% 99.9, doku ağırlığının 10 katı). 15 s için iyice vorteks. NOT 1: 20 mg doku için 200 μL metanol kullanın. NOT 2: Metanol, proteinleri doku homojenatından çökeltmek için kullanılır ve kemilüminesans yöntemine müdahale etmez. Başka bir protein çökeltme yöntemi kullanılıyorsa, kemilüminesans ile uyumluluğunu test edin.</li>
		<li>Kullanılan cihazda bulunan en yüksek hızda 45 sn boyunca bir kez daha homojenize edin. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. 17.000 x g, 4 °C, 30 dk'da santrifüj. Süper nantantı aspire edin ve nitrit / nitrat seviyelerini ölçün veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulverizatör (Şekil 3)<ol><li>Seyreltilmiş durdurma çözeltisi (doku ağırlığının 5 katı) içeren tüpler hazırlayın ve tartın. Ağırlığı kaydedin (tüp + durdurma çözümü).</li>
		<li>Sıvı azot öğütücü aletini kuru buz üzerine yerleştirin ve istenen sıcaklığa ulaşması için yaklaşık 30 dakika bekleyin.</li>
		<li>Sıvı azotla soğutulmuş cımbız kullanarak, bir numuneyi (zaten ölçülen doku ağırlığı) pulverizatöre aktarın. Dokunun sıvı azot sıcaklığında olduğundan emin olmak için küçük bir kaşık sıvı azot ekleyin.</li>
		<li>Sıvı azotun% 95'i buharlaştıktan sonra, kırma aletini dokunun üstüne yerleştirin ve sıkıca bastırın. Örnek ezilmesini hissetmelisiniz. Tokmak kullanarak, kırma aletine 3-5x vurun.</li>
		<li>Sıvı azotla soğutulmuş bir kaşık kullanarak kalan parçalar için numuneyi kontrol edin. Sıvı azotta soğuduktan sonra, mendile dokunmadan önce donmuş suyu silmek için bir parça kağıt mendil kullanın. Bir parça varsa, merkeze taşıyın ve ardından tokmakla 5-6 kez daha vurun.</li>
		<li>Tüm numune toz haline getirildiğinde, ezilmiş dokuyu seyreltilmiş durdurma çözeltisini içeren önceden tartılmış tüpe doğrudan aktarmak için sıvı azot soğutmalı kaşığı kullanın (adım 3.3.1). Bu adımı hızlı bir şekilde uyguladığınızdan emin olun, çünkü ezilmiş iskelet kası ısındığında, yapışkan hale gelir ve aktarılması zorlaşır.</li>
		<li>15 s. için vorteks. Tüpü açarak tüpün üst kısmında hiçbir doku sıkışmadığını kontrol edin. Varsa, yerinden çıkarmayı deneyin ve sonra tekrar vorteks.</li>
		<li>Küçük bir masaüstü santrifüj kullanarak numuneyi 2-3 sn santrifüj ile santrifüj yapın. Tüpü tekrar tartın. Orijinal tüp ağırlığını (adım 3.3.1) bu yeni ağırlıktan düşerek doku ağırlığını hesaplayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. NOT: Tam ağırlıklar, tam doku ağırlığını ve pulverizasyon sırasında ne kadar doku kaybedildiğini belirlemeye yardımcı olacaktır.</li>
		<li>Tüm numuneler adım 3.3.8'e kadar işlendikten sonra, uygun miktarda metanol ekleyin (≥% 99.9, doku ağırlığının 10 katı). 15 saniye boyunca iyice vorteks yapın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. NOT: 20 mg doku için 200 μL metanol kullanın. Metanol, proteinleri doku homojenatından çökeltmek için kullanılır ve kemilüminesans yöntemine müdahale etmez. Başka bir protein çökeltme yöntemi kullanılıyorsa, kemilüminesans ile uyumluluğunu test edin.</li>
		<li>17.000 × g, 4 °C, 30 dk. Süpernatantı aspire edin ve nitrit / nitrat seviyelerini ölçün veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Nitrik oksit analizörü (NOA) ile nitrit/nitrat ölçümü
<ol><li>Tüm numuneleri yukarıda açıklanan üç farklı homojenizasyon yönteminden biriyle hazırlayın ve nitrat ve nitrit ölçümü için bir NOA'ya enjekte edin. NOT: NOA kullanımı için ayrıntılı protokoller daha önceyayınlanmıştır 19.</li>
</ol>

<ol><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system%3A+a+historical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).</li>
<li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-arginine-nitric+oxide+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li>
<li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li>
<li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li>
<li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomach+NO+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502(1994).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans%3A+measurements+in+expelled+air%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li>
<li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li>
<li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans%3A+role+for+nitrite-derived+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li>
<li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).</li>
<li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li>
<li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+nitrate+store%3A+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li>
<li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Nitrite+and+Nitrate%2C+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway%2C+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879(2016).</li>
<li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li>
<li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li>
<li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li>
<li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA%28y%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Alan N. Schechter, kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde nitrit tuzlarının kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri'ne verilen çeşitli patentlerde ortak mucit olarak listelenmiştir. Klinik gelişim için bu patentlerin NIH lisansına dayanan telif hakları alır, ancak başka bir tazminat almaz. Bu düzenlemeler JoVE dergi politikalarına bağlılığını etkilemez.

NO metabolitleri, nitrat ve nitritteki değişiklikleri izlemek için, fizyolojik müdahalelerin bir fonksiyonu olarak, bu iyonların metabolizmalarında kritik olan farklı organlardaki seviyelerini ölçmek zorunludur. Kandaki hemoglobin NO ve metabolitleri ile reaksiyona gireceğinden, kanı doku örneklerinden mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çıkarmak da önemlidir. Böylece iskelet kas dokuları (gluteus, TA, EDL, gastroknemius kası) toplanmadan önce hayvanlar salin ile perfüze edildi ve hedef kas etrafındaki bağ dokusu ve yağ d...

Küçük bir gaz halindeki sinyal molekülü olan nitrik oksit (NO), fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerde kritik bir rol oynar1. NO, nitrik oksit sentaz (NOS) ailesinin endojen enzimleri tarafından L-arginin'den, nitrata (NO 3-) ve muhtemelen kandaki ve dokulardaki nitrite (NO 2-) hızlı oksidasyona uğramadan önce üretilebilir 2,3. Son zamanlarda, bu anyonların memeli sistemlerinde NO'ya geri indirgendiği gösterilmiştir4. Nitrat, esas olarak tükürük bezleri tarafından salgılanan ve doğrudan yutulan iyonlara etki eden ağız boşluğundaki kommensal bakteriyel nitrat redüktazları tarafından nitrite dönüştürülür 5 ve bir dereceye kadar ksantin oksidoredüktaz 6,7 gibi memeli enzimleri tarafından. Nitrit, deoksihemoglobin8, deoksimiyoglobin9, molibden içeren enzimler10 ve proton 11,12 varlığında enzimatik olmayan indirgeme dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla NO'ya daha da indirgenebilir.
Bu nitrat-nitrit-NO yolu, NOS aktivitesinin azaldığı hipoksik koşullar altında geliştirilir, çünkü NOS NO nesil4 için oksijen gerektirir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, diyet nitratının kan basıncı regülasyonu ve egzersiz performansı üzerindeki yararlı etkilerini bildirmiştir, bu da nitrat azaltma yollarının NO sinyalinin 13,14,15'in artmasına katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Önceki çalışmalar, bazı iskelet kaslarının muhtemelen vücuttaki başlıca nitrat depolama yerleri olduğunu göstermiştir16. Kan veya karaciğer gibi diğer iç organlarla karşılaştırıldığında, iskelet kası (gluteus maximus) önemli ölçüde daha yüksek nitrat seviyeleri içerir ve memeli vücudunda önemli bir kütleye sahiptir. Koşu bandı egzersizinin, bir sıçan modeli7'de nitrite ve gluteustaki NO'ya nitrat indirgemesini arttırdığı gösterilmiştir. Bu sonuçlar, bazı iskelet kaslarının fizyolojik durumlarda nitrat indirgeme yolları yoluyla NO için önemli kaynaklar olabileceğini düşündürmektedir. Daha yeni çalışmalar, egzersiz sırasında kas nitrat seviyelerindeki değişiklikler de dahil olmak üzere bu bulguların insanlarda da meydana geldiğini göstermektedir17.
Mevcut yazarlardan ikisi daha önce kan ve diğer sıvı numunelerdeki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için bir yöntem oluşturmuştu18. Bununla birlikte, bu anyonların doku homojenatlarındaki seviyeleri başlangıçta analiz edildiğinde, ayrıntılı protokoller mevcut değildi. Birkaç farklı organdaki nitrat-nitrit-NO dinamiklerini anlamak için amacımız, iskelet kası da dahil olmak üzere memeli dokularındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için doğru ve verimli bir yöntem geliştirmekti. Daha önceki çalışmalarda, güvenilir homojenizasyon prosesleri geliştirmek ve daha sonra bu homojenatlardaki nitrat ve nitrit içeriğini analiz etmek için kemirgen dokuları kullanıldı 7,16,19. Bu homojenizasyon yönteminin kullanımı, değerlerin doğrulandığı insan iskelet kası biyopsi örneklerine genişletildi ve daha da önemlisi, kas için kan / plazmaya kıyasla gözlemlenen değerler, kemirgenlerde gözlenenlere benzer aralıklarda ve oranlarda idi17. Son yıllarda, diğer gruplar da iskelet kası homojenatlarındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmeye başladı ve grubumuz20,21 tarafından bildirilenlerle karşılaştırılabilir değerler bildirdi.
Bu protokol belgesinin amacı, nitrat ve nitrit seviyelerinin daha sonraki ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası homojenatlarının hazırlanmasını ayrıntılı olarak tanımlamaktır. Ayrıca homojenizasyon için kullanılan doku ağırlığının iskelet kası örneklerinde nitrat ve nitrit değerleri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu yöntemlerin diğer memeli dokularına da rahatlıkla uygulanabileceğine inanıyoruz. Son yıllarda özellikle egzersiz fizyolojisi alanında kas gruplarına göre nitrat/nitrit/NO fizyolojisindeki olası farklılıklara dikkat çekilmiştir. Ayrıca dört farklı kemirgen kasındaki nitrat ve nitrit miktarlarını rapor ediyoruz ve her iki iyonun da bu farklı kaslar arasında eşit olmayan bir dağılımını buluyoruz; daha fazla çalışma gerektiren bir gözlem.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS ayrıştırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>nazik MACS M tüpü</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td>Uzunluk: 87 mm; Çap: 30 mm</td></tr><tr><td>Heparin Sodyum</td><td>Hospira</td><td>NDC-0409-7620-13</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Baxter</td><td>NDC-10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>646377</td><td></td></tr><tr><td>Minilys boncuk homojenizatör</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-etilmaleimid</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>Nitrik Oksit analizörü</td><td>GE</td><td>Elekler NOA 280i</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonilfenilpolietilen glikol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum ferrisiyanür; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>Precellys parçalama kiti</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td>, homojenizasyon için 2,8 mm seramik (zirkonyum oksit) boncuklu 2 mL tüp içerir</td></tr><tr><td>Pulverizatör kiti</td><td>Hücre kırıcı Hücre</td> kırıcı <td>kiti</td><td></td></tr></tbody></table>

nitrat ve nitrit Ölçümleri için sıçan İskelet kas homojenatlarının hazırlanması

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrat iyonlarının (NO3-) bir zamanlar nitrik oksit (NO) metabolizmasının inert son ürünleri olduğu düşünülüyordu. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, nitrat iyonlarının memelilerde iki aşamalı bir indirgeme mekanizması ile NO'ya geri dönüştürülebileceğini göstermiştir: nitrat, çoğunlukla oral kommensal bakteriler tarafından nitrite (NO2-) indirgenir, daha sonra nitrit, heme veya molibden içeren proteinler de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar tarafından NO'ya indirgenir. Bu indirgeyici nitrat yolu, özellikle kardiyovasküler sistemde ve kas egzersizi sırasında NO-aracılı sinyal yolaklarının geliştirilmesine katkıda bulunur. Bu tür bir kullanımdan önce vücuttaki nitrat seviyeleri iki farklı kaynak tarafından belirlenir: endojen NO oksidasyonu ve diyet nitrat alımı, esas olarak bitkilerden. Fizyolojik koşullarda karmaşık NO döngüsünü aydınlatmak için, NO'ya kıyasla nispeten kararlı olan metabolitlerinin, nitrat ve nitrit iyonlarının dinamiklerini daha fazla inceledik. Önceki çalışmalarda iskelet kası, memelilerde nitrat iyonları için önemli bir depolama organı ve egzersiz sırasında doğrudan bir NO kaynağı olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, iskelet kasındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için güvenilir bir metodoloji oluşturmak önemlidir ve uygulamasının diğer doku örneklerine genişletilmesinde yardımcı olmalıdır. Bu yazıda, nitrat ve nitrit ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası numunelerinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanmakta ve numunelerin büyüklüğü de dahil olmak üzere homojenizasyon prosesleri ile ilgili önemli konular tartışılmaktadır. Nitrat ve nitrit konsantrasyonları da dört farklı kas grubunda karşılaştırılmıştır.

Temsili sonuçlar elde etmek için, 8 Wistar sıçanından (erkek ve dişiler, ağırlık 250 ± 50 g) iskelet kası dokuları kullanılmıştır. Sıçan iskelet kası homojenatları (her yöntem için 50 mg gluteus maximus kası) üç farklı homojenizasyon aracı (döner homojenizatör, boncuk homojenizatörü ve pulverizatör) ile hazırlanmıştır. Bu homojenatların nitrat ve nitrit içerikleri daha sonra bir nitrik oksit analizörü (NOA) kullanılarak belirlendi (Şekil 4). Bu üç homojenat numunesindeki nitrat seviyeleri (<...

Nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek ve karşılaştırmak için sıçan iskelet kası dokusunun dört farklı kas grubunun homojenizasyonu için üç farklı yöntem için protokoller sunuyoruz. Ayrıca, doku numune büyüklüğünün homojenizasyon sonuçlarını etkileyip etkilemediğini araştırmak için farklı numune ağırlıklarını karşılaştırıyoruz.

Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

İskelet kası, nitrite dönüştürülmesinden sonra, egzersiz sırasında bir NO kaynağı olarak hizmet eden önemli bir nitrat rezervuarı görevi görür. Burada kas ve diğer dokulardaki bu iyonları ölçmek için metodoloji sunuyoruz. Başlamak için, 890 milimolar potasyum ferrisiyanür ve 118 milimolar n-metilmaleimid damıtılmış suda birleştirerek nitrat koruyucu veya durdurma çözeltisini hazırlayın, çözelti içinde kristal kalmamasını sağlayın, ardından 1-9 oranında iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ekleyin ve köpüklenmeyi önlemek için hafifçe karıştırın.Durdurma çözeltisini damıtılmış su ile 1'e 9 oranında seyreltin ve seyreltilmiş durdurma çözeltisini homojenizasyon tüpüne ekleyin. Daha sonra, önceki izole edilmiş ve donmuş sıçan kas dokusunu buz üzerinde çözün. Doku çözüldükten sonra, kalan yağ ve bağ dokusunu iskelet kasından çıkarın.İskelet kasının parçalarını kesin ve kuruması için bir gazlı bez üzerinde lekeleyin. Uygun miktarda iskelet kası dokusunu tartın, ardından ağırlık öncesi dokuyu durdurma çözeltisini içeren homojenizasyon tüplerine yerleştirin. Döner homojenizatörde homojenizasyon için, önceden tartılmış iskelet kasını ve önceden ölçülmüş durdurma çözeltisini içeren M tipi tüpü makineye yerleştirin.Her numuneyi iki kez homojenize edin ve her homojenizasyondan sonra, soğuması için tüpü hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Homojenizasyondan sonra, tüpü kısaca santrifüj edin. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve 15 saniye boyunca vortekslemeden önce uygun miktarda metanol ekleyin.Numuneyi tekrar homojenize edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, ardından numuneyi santrifüj edin, süpernatanı aspire edin ve nitrit ve nitrat seviyelerini ölçmeye devam edin. Boncuk homojenizasyonu için, iskelet kası dokusunu boncuk içeren bir tüpe yerleştirin ve cihazda bulunan en yüksek hızda 45 saniye boyunca iki kez homojenize edin. Her homojenizasyondan sonra, tüpü soğuması için hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin, ardından tüpü santrifüj edin, tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve vorteksten önce 15 saniye boyunca uygun miktarda metanol ekleyin.Numuneyi 45 saniye boyunca bir kez daha homojenize edin, ardından 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneyi santrifüj edin, süpernatanı aspire edin ve nitrit ve nitrat seviyelerini ölçmeye devam edin. Pulverizatör bazlı homojenizasyon için, seyreltilmiş durdurma çözeltisini içeren tüpler hazırlayın, ardından tüplerin ağırlığını tartın ve kaydedin.Öğütücü aletini kuru buz üzerinde 30 dakika soğuttuktan sonra, sıvı azotla soğutulmuş cımbız kullanarak, önceden tartılmış doku örneğini pulverizatöre aktarın, ardından dokunun sıvı azot sıcaklığında olmasını sağlamak için az miktarda sıvı azot ekleyin. Sıvı azotun% 95'i buharlaştıktan sonra, kırma aletini dokunun üstüne yerleştirin ve numunenin ezildiğini hissetmek için sıkıca bastırın, ardından bir tokmak kullanarak kırma aletine 3 ila 5 kez vurun. Tüm numune toz haline getirildiğinde, sıvı azot soğutmalı bir kaşık ve cımbız kullanarak, ezilmiş dokuyu doğrudan seyreltilmiş durdurma çözeltisini içeren önceden tartılmış tüpe aktarın.Ardından, tüpü 15 saniye boyunca vorteksleyin, ardından kapağa sıkışmış herhangi bir doku olup olmadığını kontrol etmek için tüpü açın. Varsa, yerinden çıkarmayı deneyin, sonra tekrar vorteks. Numuneyi 2 ila 3 saniye boyunca kısaca santrifüj edin.Tüpü tekrar tartın ve orijinal tüp ağırlığını bu yeni ağırlıktan düşerek doku ağırlığını hesaplayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Tüpe uygun miktarda metanol ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe etmeden önce tüpü 15 saniye boyunca iyice vorteksleyin, ardından numuneyi santrifüj edin, süpernatanı aspire edin ve nitrit ve nitrat seviyelerini ölçmeye devam edin.Döner homojenizatör, boncuk homojenizatörü ve öğütücü kullanılarak hazırlanan nitrat seviyeleri ve sıçan iskelet kası homojenatları benzerdi. İlginç bir şekilde, nitrit seviyeleri için, bir öğütücü tarafından hazırlanan homojenat numunesi, diğer iki numune değerinden istatistiksel olarak farklı olan en yüksek değeri gösterdi. Bir boncuk homojenizatörü kullanılarak 20, 50 ve 200 miligram dokudan hazırlanan gluteus homojenatlarındaki nitrit ve nitrat seviyelerinin karşılaştırılması, ne nitrat ne de nitrit seviyelerinin kas numune boyutları arasında anlamlı derecede farklı olmadığını göstermiştir.Farklı kemirgen bacak iskelet kas dokularındaki nitrat seviyelerinin karşılaştırılması, gluteus kasının diğer üç kas dokusundan yaklaşık iki kat daha yüksek nitrat seviyelerine sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bu farklılıklar istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır. Nitrat seviyelerine benzer şekilde, gluteus kasındaki nitrat konsantrasyonu da diğer üç kas dokusundakinden daha yüksekti ve gastroknemius örneğindekinden anlamlı derecede yüksekti.Yöntemimiz nispeten basittir ve numune hazırlama sırasında nitrat ve nitriti korurken küçük numuneler için çok uygundur.

preparation-rat-skeletal-muscle-homogenates-for-nitrate-nitrite

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, kolajen doku, iskelet matür içeren yapıları imalatı göstermektedir. Bu 3-D mühendislik yapıları dokuların değiştirmek veya onarmak için kullanılan...

MİYOJEN Engineered Doku oluşturur imalatı

Biz а hücresel biyoenerjetik, biyofiziksel ölçümleri, proteomik veya mitokondriyal DNA ve lipidler analizi fonksiyonel veya yapısal çalışmalar mitokondri saf, çok birleştiğinde sıçan kalp izolasyonu için protokol açıklar.

Mitokondri Yüksek Coupled Sıçan Kalp hazırlanması

Bu protokol, iskelet kaslarının izole edilen mitokondri solunum çalışması için bir prosedür açıklanmıştır. Bu yöntem Scorrano...

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Bu video cerrahi hazırlık ve sıçan medial gastroknemius kas hazırlık kasılma cevapları incelemek için gerekli prosedürleri...

Rat Prosedürleri<em&gt; In situ</em&gt; İskelet Kası Kontraktil Özellikleri

Nitrik oksit (NO) endojen üretimi biyolojik fonksiyonları çok çeşitli düzenler. Bu NO dayalı sinyal bozulması veya düzensizliği birçok insan hastalıkları dahil olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Yöntem NO metabolitleri insan hastalığı için yeni tanısal veya prognostik biyolojik sağlayabilir ilgili ölçmek için.

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Nitrik oksit (NO) vasküler homeostazda önemli bir sinyal molekülüdür. NO in vivo üretimi, doğrudan ölçüm için çok düşüktür. Kemilüminesans, öncüllerini ve oksidasyon ürünlerini, nitrit ve nitratı ölçerek NO döngüsü hakkında yararlı bilgiler sağlar. Vücut dokularında ve sıvılarında nitrit/nitrat tayini anlatılmaktadır.

Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolu&#39;ndaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme

Burada, geliştirilmiş boyama kalitesini ve böylece otomatik satın alma ve serbestçe yazılım ImageJ kullanılarak fiber popülasyonları ölçümü sağlar hızlı kas lifi analiz için bir protokol mevcut.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Kas glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, tüm vücut glikoz homeostazını korumak için önemlidir. Bu protokol, çeşitli fizyolojik müdahalelerin tüm vücut glikoz metabolizması üzerindeki etkisini tanımlarken, izole ve inkübe edilmiş olgun iskelet kasında insülin ve kontraksiyonla uyarılmış glikoz alımının değerlendirilmesini sunar.

Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi

Öğrenin, sıçan iskelet kas dokusunda nitrat ve nitrit ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemini karşılaştırarak. Bu protokol, küçük örneklerde NO metabolitlerinin doğru kantifikasyonunu sağlar.

Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması

Daha fazla video keşfet