Name: Bakteriyel Dış Zar Vezikül Heterojenliğini Analiz Etmek için Boyut Dışlama Kromatografisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Keşfedin, boyut dışlama kromatografisi ile Aggregatibacter actinomycetemcomitans bakteri dış zar veziküllerini heterojen popülasyonlara ayırma yöntemini. Bu teknik, süpernatantlardan nükleik asit ve proteinleri uzaklaştırarak tekrarlanabilir analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (1554417) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (DE027769) tarafından finanse edildi.

1. Tamponların hazırlanması
<ol><li>ELISA yıkama tamponunu hazırlamak için 3,94 g Tris bazlı, 8,77 g NaCl ve 1 g sığır serum albümin (BSA) ile 1 L deiyonize (DI) su ekleyin. 500 μL polisorbat-20 ekleyin. HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.</li>
	<li>Engelleme tamponu hazırlamak için 3,94 g Tris tabanlı, 8,77 g NaCl ve 10 g BSA ekleyin. 500 μL polisorbat-20 ila 1 L DI su ekleyin. HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.</li>
	<li>Elution tamponu (PBS) hazırlamak için 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4ve 0,24 g KH2PO 4 ila1 L DI su ekleyin. HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın. NOT: Bu tamponun 10x'lik bir çözeltisi yapılabilir ve gerektiğinde DI suyu ile seyreltilebilir.</li>
</ol>2. OMV numunesinin hazırlanması
<ol><li>A. actinomycetemcomitans hücrelerini geç üstel faza (0.7'nin 600 nm'sinde optik yoğunluk) büyütün. Hücreleri 10 dakika boyunca 4 °C'de 10.000 x g'da iki kez santrifüjleyarak pelet. Süpernatantı 0,45 μm filtreden geçirin.</li>
	<li>50 kDa-moleküler ağırlık kesme filtreleri kullanarak bakteri içermeyen süpernatantı konsantre edin. Konsantre çözeltiyi 30 dakika boyunca 4 °C'de 105.000 x g'da ultracentrifuge edin.</li>
	<li>Peleti PBS ve ultracentrifuge'da tekrar sakla (30 dakika boyunca 4 °C'de 105.000 x g).) Peleti 2 mL PBS'de yeniden dirildirin.</li>
</ol>3. S-1000 sütununun paketlenerek
<ol><li>Jel filtrasyon ortamının stok şişesini bir cam karıştırma çubuğuyla karıştırın ve bir cam şişeye sütunu doldurmak için gereken hacmi, ayrıca yaklaşık% 50 fazlalığı (yaklaşık 135 mL) dökün. Bu boncukların yerleşene kadar oturmasına izin verin ve daha sonra fazla sıvıyı boşaltın. Boncukları elüsyon tamponunda yeniden depolar, böylece nihai çözelti yaklaşık% 70 (hacme göre) jel, % 30 tampon olur. Çözümü vakum altında gazdan arındırın.</li>
	<li>Cam sütunu bir halka standı kullanarak dikey olarak monte edin ve sütunun duvarlarını ıslatmak için elution tamponu ile doldurun. Sütunda yalnızca yaklaşık 1 cm arabellek kalana kadar arabelleği boşaltın.</li>
	<li>Kabarcıklar oluşturmadan, sütunun içine dikkatlice pipet boncukları, sütunu en üste doldurun. Bu işlem boyunca fazla arabelleği boşaltmaya devam edin. Sütunun üstüne ek boncuk eklemeden önce boncukların tamamen yerleşmesine izin vermeyin. Sütun, sütun rezervuarının altında yaklaşık 2 cm yüksekliğe paketlenmelidir.</li>
</ol>4. Numunenin yüklenmesi ve kesirlerin toplanması
<ol><li>Elution tamponu vakum altında gazdan arındırın. Sütunu iki sütun hacmi (180 mL) elution arabelleği ile yıkayın.</li>
	<li>Kalan arabelleğin sütunu tam olarak girmesine izin verin. Tampon jel tabakasının tepesine ulaştıktan sonra, omv içeren 2 mL'lik bir örneği (yaklaşık 100 - 200 nmol / L lipit konsantrasyonda) boncukların yüzeyine dikkatlice pipetleyin, sütunun üstündeki boncuklardan hiçbirini rahatsız etmemeye dikkat edin. Numunenin jel tabakasının üzerinde hiçbir sıvı kalmadığında jelin tam olarak girmesine izin verin.</li>
	<li>Jel sütununun üzerine dikkatlice ve yavaşça elution tamponu ekleyin. Numune seyreltmesine neden olacağından, jelin üst tabakasını rahatsız etmeyin.</li>
	<li>Sütunun altına tek bir 50 mL tüp yerleştirin ve sütunu açın. Eluent'in ilk 20 mL'sini toplayın. Sütunun asla kurumasını sağlamak için gerektiğinde, sütunun üstüne dikkatlice ek elution arabelleği ekleyin.</li>
	<li>Sütunun altına bir dizi 1,5 mL tüp yerleştirin. Sütunu başlatın ve her tüpte bir dizi 1 mL numune toplayın. Örnekler toplanırken, gerektiğinde sütunun üstüne elution arabelleği eklemeye devam edin. 96 kesir toplanana kadar tekrarlayın. Sütunu durdurun. NOT: Numuneler uzun süreli depolama için -20 °C'de veya bir sonraki analize kadar kısa süreli depolama için 4 °C'de saklanmalıdır.</li>
	<li>Sütunu temizlemek için, sütun boyunca 0,1 M NaOH'luk bir sütun birimi (90 mL) çalıştırın. Sütun boyunca iki sütun birimi (180 mL) elution arabelleği çalıştırın.</li>
</ol>5. Örnek analizi
<ol><li>Lipid konsantrasyonunu her fraksiyonda ölçmek için, her fraksiyonun pipet 50 μL'si 96 kuyulu bir plakanın tek bir kuyusuna. Her kuyuya 2,5 μL lipofilik boya ekleyin. 15 sn kuluçkaya yatır. 515 nm'lik bir heyecan dalga boyu ve 640 nm emisyon dalga boyu ile bir plaka okuyucusunda floresan yoğunluğunu ölçün. Her örnekteki tüm lipitlerin fraksiyonunu hesaplamak için, tüm emisyon yoğunluklarını toplayın ve her bir yoğunluğu toplamla bölün.</li>
	<li>Belirli bir proteinin konsantrasyonunu ölçmek için, her fraksiyonun 100 μL pipetini elisa immün plakanın tek bir kuyusuna koyun. 25 °C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>Örnekleri dene. Her kuyuya 200 μL ELISA yıkama tamponu ekleyin ve dekant ekleyin. Toplam beş yıkama için dört kez tekrarlayın.</li>
		<li>Her kuyuya 200 μL blokaj tamponu ekleyin ve 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Decant.</li>
		<li>4 °C'de bir gecede 100 μL bloke tampon artı birincil antikor (saflaştırılmış antikor için 1:10.000; saflaştırılmış antikor için 1:10) ile inkübte plakalar. Decant.</li>
		<li>Her kuyuya 200 μL ELISA yıkama tamponu ekleyin ve dekant ekleyin. Toplam beş yıkama için dört kez tekrarlayın.</li>
		<li>Her kuyuya 100 μL ELISA yıkama tamponu ve ikincil antikor (1:30.000) ekleyin. 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Her kuyuya 200 μL ELISA yıkama tamponu ekleyin ve dekant ekleyin. Toplam beş yıkama için dört kez tekrarlayın.</li>
		<li>3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) tek adımlı çözeltinin 100 μL'sini ekleyin ve 15-30 dakika boyunca veya mavi bir renk gelişene kadar kuluçkaya yatırın. TMB reaksiyonu 50 μL durdurma çözümü ile durdurun.</li>
		<li>Bir plaka okuyucuda, her bir kuyunun emiciliğini 450 nm dalga boyunda okuyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplam protein konsantrasyonunu ölçmek için, emiciliği bir UV-vis spektrofotometre kullanarak her kesirde280 nm (A 280)dalga boyunda kaydedin.</li>
</ol>İletişim kuralının şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62429/62429fig01.jpg"> Şekil 1: SEC yordamının şeması. Sütun, kabarcıkları ve süreksizlikleri önlemek için gazdan arındırılmış jel filtrasyon ortamı ile doludur, daha sonra iki sütun hacimli elution tamponu ile yıkanır. Daha sonra, numune jel ambalajını bozmadan jelin üstüne dikkatlice pipetlendirilir. Sütun açılır ve numune jel tamamen girene kadar çalıştırılır. Bu noktada, sütunun üstüne tampon yerleştirilir ve ilk 20 mL elüat toplanır. Daha sonra, bir dizi 1-mL fraksiyon toplanır. Bu fraksiyonlar daha sonra lipit ve protein içeriğinin analizi için 96 kuyulu bir plakaya veya 96 kuyulu bir immün plakaya yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62429/62429fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).</li>
<li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414(2018).</li>
<li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).</li>
<li>Horstman, A. L., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+secretes+active+heat-labile+enterotoxin+via+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).</li>
<li>Wai, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-mediated+export+and+assembly+of+pore-forming+oligomers+of+the+Enterobacterial+ClyA+cytotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin.</a> Cell. 115, 25-35 (2003).</li>
<li>Balsalobre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+the+Type+I+secreted+%CE%B1-haemolysin+via+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).</li>
<li>Donato, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Bordetella+pertussis+adenylate+cyclase+toxin+to+target+cells+via+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles.</a> FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+of+Vibrio+vulnificus+deliver+cytolysin-hemolysin+VvhA+into+epithelial+cells+to+induce+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).</li>
<li>Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+Kingella+kingae+outer+membrane+vesicles+on+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells.</a> Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).</li>
<li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+outer+membrane+vesicle+size+determines+their+mechanisms+of+host+cell+entry+and+protein+content%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1466(2018).</li>
<li>Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+growth+stage+determines+the+size%2C+protein+composition%2C+and+preferential+cargo+packaging+of+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles.</a> Proteomics. 19 (1-2), 1800209(2019).</li>
<li>Rompikuntal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+localization+of+internalized+outer+membrane+vesicles+carrying+active+cytolethal+distending+toxin+from+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).</li>
<li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414(2018).</li>
<li>Stevenson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+outer+membrane+vesicles+displaying+conserved+surface+polysaccharide+antigen+elicits+broadly+antimicrobial+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).</li>
<li>Gujrati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+as+cell-specific+drug-delivery+vehicles+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy.</a> ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+nanoantibiotics+using+an+outer+membrane+vesicle-based+drug+efflux+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism.</a> Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).</li>
<li>Chen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+foreign+antigens+by+engineered+outer+membrane+vesicle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+displaying+engineered+glycotopes+elicit+protective+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).</li>
<li>Singorenko, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+A+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Science Reports. 7 (1), 15297(2017).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+immunological+characterization+of+the+domain+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+leukotoxin+that+determines+its+specificity+for+human+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).</li>
<li>Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigallocatechin+gallate+inhibits+leukotoxin+release+by+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+by+promoting+association+with+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane.</a> Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).</li>
<li>Klimentová, J., Stulík, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+methods%3A+rising+impact+of+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).</li>
</ol>

Yazarların rapor etmek için herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada, bakteriyel OMV alt nüfuslarının basit, hızlı ve tekrarlanabilir ayrımı için bir protokol sağladık. Teknik nispeten düz olsa da, sütunda verimli ayırmanın gerçekleşmesini sağlamak için son derece dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken bazı adımlar vardır. İlk olarak, hava kabarcıklarını önlemek için jelin sütuna dikkatlice ve yavaşça yüklenmesi esastır. Kolonu yüklemeden önce jeli oda sıcaklığında birkaç saat bırakmanın jelin dengelenmesine izin verdiğini ve kolon içindeki kabarcık oluşumunu en aza indird...

Gram negatif bakteriler, dış zarlarından elde edilen veziklikleri, dış zar vezikliklerini (OMV' ler) büyüme boyunca serbest bırakır. Bu OMV'ler, DNA / RNA, proteinler, lipitler ve peptidoglikanlar1,2dahil olmak üzere bir dizi önemli biyomolekül taşıyarak hem bakteriler ve konak hem de bakteri hücreleri arasında hücreden hücreye iletişimde önemli roller oynar. Özellikle, OMV'lerin bakteriyel patogenezdeki rolü, bazı virülans faktörleri ve toksinler3, 4 , 5 , 6 , 7,8,9,10,11'dekizenginleşmeleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.
OMV'lerin, ana bakterilere ve büyüme aşamasına bağlı olarak 20 ila 450 nm arasında değiştiği bildirilmiştir, çeşitli bakteri türleri heterojen boyutlu OMV'leri serbest bırakır8, 12,13,14, ayrıca protein bileşimlerinde ve konak hücre giriş mekanizmalarında farklılık gösterir12. H. pylori, çapı 20 ila 450 nm arasında değişen OMV'leri serbest bıraktı ve daha küçük OMV'ler daha büyük OMV'lerden daha homojen bir protein bileşimi içeriyordu. Daha da önemlisi, OMV'lerin iki popülasyonunun konak hücreler tarafından farklı mekanizmalar aracılığıyla içselleştirildiği gözlenmiştir12. Buna ek olarak, Aggregatibacter actinomycetemcomitans'ın büyük (>350 nm) OMV'lerden oluşan bir popülasyonla birlikte küçük (<150 nm) OMV'lerden oluşan bir popülasyon saldığını ve OMV'lerin önemli miktarda salgılanan protein toksini içerdiğini gösterdik, lökotoxin (LtxA)15. OMV heterojenitesinin hücresel süreçlerdeki rolü açıkça önemli olmakla birlikte, farklı vezikül popülasyonlarının ayrılması ve analizinde teknik zorluklar bu çalışmaları sınırlamıştır.
Bakteriyel patogenezdeki önemine ek olarak, OMV'ler aşı ve ilaç dağıtım araçları 16 , 17,18,19,20dahil olmak üzere bir dizi biyoteknolojik uygulamada kullanılmak üzere önerilmiştir. Bu tür yaklaşımlarda çevirisel kullanımları için vesicles'in temiz ve monodisperse bir şekilde hazırlanması gerekir. Bu nedenle, etkili ve verimli ayırma yöntemleri gereklidir.
En yaygın olarak, yoğunluk gradyan santrifüjleme (DGC), heterojen boyutlu vezikül popülasyonlarını flagellae ve salgılanan proteinler de dahil olmak üzere hücresel döküntülerden ayırmak için kullanılır21; yöntem ayrıca heterojen boyutlu OMV alt nüfuslarını ayırmak için bir yaklaşım olarak bildirilmiştir12,13,14. Ancak, DGC zaman alıcı, verimsiz ve kullanıcıdan kullanıcıya son derece değişken22'dir ve bu nedenle ölçek büyütme için ideal değildir. Buna karşılık, boyut dışlama kromatografisi (SEC), OMV'leri 21 ,23,24arındırmak için ölçeklenebilir, verimli ve tutarlı bir yaklaşımı temsil eder. Jel filtrasyon ortamı ile dolu uzun (50 cm), yerçekimi akışı, SEC sütununun OMV'lerin alt nüfuslarını verimli bir şekilde arındırmak ve ayırmak için yeterli olduğunu bulduk. Özellikle, bu yaklaşımı A. actinomycetemcomitans OMV'leri "büyük" ve "küçük" alt nüfuslara ayırmak ve protein ve DNA kontaminasyonlarını gidermek için kullandık. Saflaştırma 4 saatten daha kısa bir sürede tamamlandı ve OMV alt nüfuslarının tamamen ayrılması ve enkazın kaldırılması gerçekleştirildi.

<table><tbody><tr><td>1 Adımlı Ultra TMB-ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 50 kDa filtreler</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>ELISA İmmüno Plakaları</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Thermo Scientific</td><td>T13320</td><td>1,5 x 50 cm</td></tr><tr><td>Cam Econo-Column</td><td>BioRad</td><td>7371552</td><td></td></tr><tr><td>Infinite 200 Pro Plaka Okuyucu</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0395-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik Susuz (KH2PO4)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-1000 Süper İnce</td><td>GE Sağlık</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td> <td>Fisher</td><td>Kimyasal S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik Susuz (Na2HPO4)</td> <td>Amresco (VWR)</td> <td>0404-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Tabanı</td><td>VWR</td><td>0497-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ara (R) 20</td><td>Acros Organics</td><td>23336-2500</td><td></td></tr></tbody></table>

bakteriyel dış zar vezikül heterojenliğini analiz etmek için boyut dışlama kromatografisi

Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity

Gram-negatif bakterilerin hücre duvarı, ince bir peptidoglikan tabakası ile ayrılmış bir iç (sitoplazmik) ve dış zardan (OM) oluşur. Büyüme boyunca, dış zar küresel dış membran vezikülleri (OMV' ler) oluşturmak için bleb yapabilir. Bu OMV'ler, konak hücrelere kargo teslimatı ve bakteri hücreleriyle iletişim dahil olmak üzere çok sayıda hücresel işlevde yer almaktadır. Son zamanlarda, aşı ve ilaç dağıtım aracı olarak kullanımları da dahil olmak üzere OMV'lerin terapötik potansiyeli araştırılmaya başlandı. OMV'ler OM'den türetilmiş olsa da, OMV'nin lipit ve protein yükünün genellikle OM'den önemli ölçüde farklı olduğu uzun zamandır takdir edilmektedir. Daha yakın zamanda, bakterilerin birden fazla OMV türünü serbest bırakabileceğine dair kanıtlar keşfedilmiştir ve boyutun konak hücreler tarafından alım mekanizmasını etkileyebileceğine dair kanıtlar mevcuttur. Bununla birlikte, bu alandaki çalışmalar heterojen boyutlu OMV'lerin verimli bir şekilde ayrılmasındaki zorluklarla sınırlıdır. Yoğunluk gradyan santrifüjleme (DGC) geleneksel olarak bu amaç için kullanılmıştır; ancak, bu teknik zaman alıcıdır ve ölçeklendirmek zordur. Öte yandan, boyut dışlama kromatografisi (SEC), daha az hantaldır ve OMV'lerin terapötik kullanımı için gelecekteki gerekli ölçek büyütmeye kendini ödünç verir. Burada, heterojen boyutlu veziküllerin tekrarlanabilir bir şekilde ayrılmasını sağlayan bir SEC yaklaşımını açıklıyoruz, bir test çalışması olarak kullanarak, Aggregatibacter aktinosetemcomitanstarafından üretilen OMV'ler Çapı 150 nm'den 350 nm'den daha büyük. Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile doğrulanan "büyük" (350 nm) OMV'ler ve "küçük" (<150 nm) OMV'lerin ayrıştırılmasını gösteriyoruz. Kullanım kolaylığı, tekrarlanabilirliği (kullanıcıdan kullanıcıya dahil) ve ölçek büyütme olasılığı nedeniyle heterojen boyutlu veziküllerin ayrılması için DGC tabanlı teknikler üzerinde SEC tabanlı teknikler öneriyoruz.

Şekil 2 bu yöntemden elde edilen temsili sonuçları gösterir. A. actinomycetemcomitans strain JP2 tarafından üretilen OMV'ler ilk olarak ultrasantrifüjasyon15kullanılarak kültür üstnatantından arındırıldı. Daha önce bu türün biri yaklaşık 300 nm ve biri yaklaşık 100 nm15çapında olmak üzere iki OMV popülasyonu ürettiğini bulduk. Bu OMV popülasyonlarını ayırmak için, yukarıda açıklanan SEC protokolünü kullanarak örneği arındırdık. Her fra...

Bakteriyel veziküller patogenezde önemli roller oynar ve umut verici biyoteknolojik uygulamalara sahiptir. Veziküllerin heterojenliği analiz ve kullanımı zorlaştırır; bu nedenle, değişen boyutlarda vesikleleri ayırmak için basit, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Burada, Aggregatibacter actinomycetemcomitanstarafından üretilen heterojen vezikülleri ayırmak için boyut dışlama kromatografisinin kullanımını gösteriyoruz.

Bakteriyel Dış Zar Vezikül Heterojenliğini Analiz Etmek için Boyut Dışlama Kromatografisi

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout ...

Boyut dışlama kromatografisi, heterojen boyuttaki bakteri veziküllerinin alt stoklamalarını ayırmak ve bakteriyel süpernatantlardan nükleik asitleri ve proteinleri çıkarmak için yararlı bir yaklaşımdır. Boyut dışlama kromatografisi, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme de dahil olmak üzere diğer ayırma tekniklerine göre daha ucuz, daha hızlı ve daha tekrarlanabilir. Bu yaklaşımın potansiyelini A.actinomycetemcomitans vezikülleri kullanarak gösterdik, ancak diğer heterojen boyutlu bakteriyel vezikül popülasyonlarına da uygulanabileceğini umuyoruz.Tüm tampon ve boncuk çözeltilerini düzgün bir şekilde gazdan arındırdığınızdan ve çözeltiyi kabarcıklar sokmadan yavaşça, ancak boncukların kurumadan homojen bir şekilde paketleyip paketleyip paketlemediğinizden emin olun. Başlamak için, bir şişe jel filtrasyon ortamını karıştırmak için bir cam çubuk kullanın ve sütunu doldurmak için gereken hacmi artı yaklaşık% 50 fazlalığı bir cam şişeye dökün. Boncukların yerleşmesine ve fazla sıvıyı dekante etmesine izin verin.Yağ tamponundaki boncukları yaklaşık% 70 jel ve% 30 tampon nihai bir çözeltiye yeniden depolayın ve çözeltiyi vakum altında gazdan arındırın. Sütunu dikey konumda bir halka standına monte edin ve tamponu sadece bir santimetre kalana kadar boşaltmadan önce duvarları ıslatmak için sütunu elution tamponu ile doldurun. Daha sonra, boncukların sütun rezervuarının altında yaklaşık iki santimetre yüksekliğe kadar paketleninceye kadar çökeltilmesini önlemek için fazla tamponu boşaltırken jel boncukları sütuna dikkatlice pipetleyin.Numuneyi yüklemeden önce, elution tamponu vakum altında gazdan arındırın. Sütunu, elution arabellek sütun hacminin yaklaşık iki katıyla yıkayın. Tampon jel tabakasının tepesine ulaştığında, yüzeyi bozmadan jel tabakasının üzerine litre başına 100 ila 200 nanomoler membranlı numunenin iki mililitresini dikkatlice ekleyin ve numunenin jel içine girmesine izin verin.Jel tabakasını bozmadan yağ tamponunu yavaşça sütuna ekleyin ve sütunun altına 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Sütunun kurumasını önlemek için, aynı anda sütunun üstüne elution arabelleği ekleyin. 20 mililitre elüat topladıktan sonra, sütunun altına 1,5 mililitrelik bir tüp rafı yerleştirin.Her tüpte toplam 96 bir mililitre fraksiyon toplayın. Örnekleri toplarken, sütuna sürekli olarak elution arabelleği ekleyin. Sütunu temizlemek için, sütun boyunca 0,1 molar sodyum hidroksitten oluşan bir sütun hacmi ve ardından iki sütun birimi elution arabelleği çalıştırın.Lipit konsantrasyonlarını ölçmek için pipet her fraksiyonun 50 mikrolitresini 96 kuyu plakasına koyun. Her kuyuya 2,5 mikrolitre lipofilik boya ekleyin. 15 saniye sonra floresan yoğunluğunu ölçün.İlgi çekici bir proteinin konsantrasyonunu ölçmek için, elisa immün plakanın bireysel kuyularına her fraksiyondan 100 mikrolitre ekleyin. 25 santigrat derecede üç saat sonra plaka içeriğini dekante edin. Her yıkamadan sonra plakayı dekante eden yıkama başına 200 mikrolitre ELISA yıkama tamponu ile plakayı beş kez yıkayın.25 santigrat derecede bir saatlik inkübasyon için her kuyuya 200 mikrolitre bloklama tamponu ekleyin. Kuluçkanın sonunda, plakayı dekantasyona koyun ve dört santigrat derecede bir gecelik inkübasyon için bloke tampona 100 mikrolitre birincil antikor ekleyin. Ertesi gün, plakayı dekantlayın ve gösterildiği gibi ELISA yıkama tamponu ile plakayı beş kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, ELISA yıkama tamponunda 100 mikrolitre ikincil antikoru her kuyuya 25 santigrat derecede bir saatlik inkübasyon için ekleyin. Kuluçkanın sonunda, plakayı gösterildiği gibi yıkayın ve oda sıcaklığında 15 ila 30 dakikalık bir inkübasyon için her kuyuya 100 mikrolitre TMB çözeltisi ekleyin. Mavi bir renk geliştiğinde, her kuyuya 50 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin ve emiciliği 450 nanometrede ölçün.Bir A.actinomycetemcomitans kültür süpernatantının boyut dışlama sütun saflaştırmasından sonra, bu suş tarafından üretilen büyük ve küçük dış zar veziklinlere karşılık gelen iki farklı lipid zirvesi gözlenmiştir. Örnek fraksiyonların ELISA analizi, toksinin öncelikle büyük dış zar veziklinlerin subpopülasyonu ile ilişkili olduğunu ortaya koydu. İmmün blot analizi benzer ama daha gürültülü sonuçlar verdi ve bu yaklaşımın ELISA'dan daha az hassas olduğunu gösterdi.Gözlemlendiği gibi, bu kromatografi tekniği dış zar veziklin preparatlarından önemli miktarda serbest proteini uzaklaştırabilir. Bununla birlikte, toplam protein konsantrasyonunun belirli proteinlerin konsantrasyonu ile mutlaka ilişkili olmadığını belirtmek önemlidir. Kabarcıkları önlemek ve sütunun kurumasını önlemek için sütunun paketlenme ve çalıştırılması sırasında çok dikkatli olmak önemlidir.Ayrılan dış zar veziklinlerin boyutunu ve diğer özelliklerini belirlemek için dinamik ışık saçılımı, partikül takibi ve bikroskopi, boyut dışlama kromatografisini takiben yapılabilir.

size-exclusion-chromatography-to-analyze-bacterial-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Kaynak: Watson, D.C., ve diğerleri. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, bakteriyel hücre dışı vezikülleri (EV'ler) bir bakteri kültürü filtratından izole etmek için gözenekli reçine boncukları ile boyut dışlama kromatografisinin kullanımını göstermektedir. Daha büyük EV'ler reçine gözeneklerini atlayarak erken ayrışırken, daha küçük proteinler gözeneklere girer ve daha sonra ayrışır.

Boyut Dışlama Kromatografisi Kullanılarak Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu 

Bu videoda, bakterilerden türetilen heterojen bir dış zar vezikülleri veya OMV popülasyonunu ayırmak için bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini gösteriyoruz. Bu veziküller nano boyutlu küresel yapılardır ve Boyut Dışlama Kromatografisi ile boyutlarına göre büyük ve küçük alt popülasyonlara ayrılır.

Bakteri hücre dışı veziküllerin boyut dışlama kromatografisine dayalı ayrılması: Gram negatif bakteriyel dış zar veziküllerinin heterojen popülasyonunu boyutlarına göre ayırmak için bir teknik

Bu videoda, deterjan çözünmesini takiben Escherichia coli'de yeşil floresan proteini (GFP) ile kaynaşmış membran proteini stabilitesini taramak için bir floresan algılama boyut dışlama kromatografisi tekniği gösteriyoruz. Boyut dışlama profilinde çok az veya hiç serbest GFP ile simetrik bir tepe sergileyen proteinler, daha sonra yapı-fonksiyon analizi için seçilebilen, minimum bozunma ve agregasyon ile saflaştırılmış proteinleri gösterir.

Floresan Algılama Boyut Dışlama Kromatografisi: Deterjan Çözündürmesi Üzerine Floresan Membran Proteinlerinin Bütünlüğünü Belirleme Tekniği

Bu video, Mycobacterium tuberculosis'in (Mtb) kültür süzüntüsünden bakteriyel hücre dışı vezikülleri (EV'ler) saflaştırmak için boyut dışlama kromatografisi (SEC) tekniğini göstermektedir. Teknik, EV'lerin saflaştırılmış fraksiyonlarını elde etmek için gözenekli reçine dolgulu bir kolon kullanır. Gözenekli parçacıklar seçici olarak daha küçük proteinlerin gözeneklere girmesine izin vererek daha yavaş elüsyona neden olur. Aynı zamanda, EV'lerin daha büyük boyutları nedeniyle gözeneklere girmesi...

Mikobakteriyel hücre dışı vezikülleri saflaştırmak için bir boyut dışlama kromatografisi tekniği

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Mevcut protokol, siyanobakteriyel kültürlerden hücre dışı veziküllerin izolasyonu, konsantrasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı açıklamalar sunmaktadır. Vezikülleri farklı ölçeklerdeki kültürlerden arındırmaya yönelik yaklaşımlar, metodolojiler arasındaki ödünleşimler ve saha örnekleriyle çalışmak için dikkat edilmesi gerekenler de tartışılmaktadır.

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküllerini kültür süpernatantlarından zenginleştirmek için kolay ve tekrarlanabilir bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini tanımlar.

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

Hücre dışı veziküller biyomedikal uygulamalar için büyük umut vaat etmektedir, ancak mevcut izolasyon yöntemleri zaman alıcıdır ve klinik kullanım için pratik değildir. Bu çalışmada, hücre dışı veziküllerin büyük hacimli biyoakışkanlardan minimum adımlarla sürekli bir şekilde doğrudan izolasyonunu sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz.

Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

Keşfedin, boyut dışlama kromatografisi ile Aggregatibacter actinomycetemcomitans bakteri dış zar veziküllerini heterojen popülasyonlara ayırma yöntemini. Bu teknik, süpernatantlardan nükleik asit ve proteinleri uzaklaştırarak tekrarlanabilir analiz sağlar.

Bakteriyel Dış Zar Vezikül Heterojenliğini Analiz Etmek için Boyut Dışlama Kromatografisi

Daha fazla video keşfet