Erkek Aedes aegypti Sivrisineklerinde Çiftleşme Rekabet Gücünü Incelemek için Floresan Boyası Rhodamine B'yi Kullanmak
7 Mayıs 2021
Burada, erkek Aedes aegypti'nin çiftleşme rekabet gücünün bir işaretleyici olarak floresan boyası kullanılarak incelenmesi için bir protokol sunuyoruz. Dişi sivrisinekler çiftleşme için hem işaretli hem de işaretlenmemiş erkeklere maruz kalır. Çiftleşme sonrası spermathecae'leri çiftleşme partnerlerini belirlemek için floresan mikroskop altında incelenir.
Bu protokol, erkek salınımlı sivrisinek popülasyonu bastırma programları için bir ön koşul olan erkek sivrisinek çiftleşme rekabet gücünü ölçer. Bu fitness kriteri kalite kontrol ve gerinim değerlendirmesinin bir parçası olarak değerlendirilir. Bu yöntem deneysel süreyi% 90 azaltır ve iki steril veya Wolbachia enfekte hat arasında çiftleşme rekabet gücünün doğrudan karşılaştırılmasına izin verir.
Bu işlemi Irene Li ve Keng Wai Mak yapacaktır. Başlamak için, erkek ve dişi sivrisinekleri boyut farklılıklarına göre pupal aşamasında cinsiyete bağlayın. Her sivrisinek seti için, 100 erkek pupayı sakkaroz besleme veya Rhodamine B sakkaroz besleme için önceden etiketlenmiş bir kafese aktarın.
Dişi pupaları kafes başına 40 ila 50 arasında küçük gruplar halinde yerleştirin. Imagos'un ortaya çıkmasından sonra, kafesleri erkek sivrisineklerin varlığı için kontrol edin. % 0.2 Rhodamine B sakkaroz çözeltisini hazırlamak için, her 100 mililitre% 10 sakkaroz çözeltisi için 200 miligram Rhodamine B tozunun çözün.
Tüm tozun çözüldüğüne emin olmak için iyice karıştırın. Fitil ile 20 şeker besleyici şişe hazırlayın. 10 besleyici şişeye 10 mililitre% 10 sakkaroz ve diğer 10 besleyici şişe için 10 mililitre% 0.2 Rhodamine B sakkaroz çözeltisi ekleyin.
Hazırlanan her erkek kafesine beş besleyici şişe yerleştirin ve erkek sivrisineklerin çiftleşme deneyinden önce üç gün boyunca beslenmesine izin verin. Cıva yakıcı lambayı ve stereo mikroskobu açın. Cıva brülörü lambasına giden ışık kaynağının 10 dakika boyunca stabilize olmasını bekleyin.
Daha sonra kırmızı floresan proteini bir için floresan filtrelerini ayarlayın. Oral aspiratör cam tüpüne bir seferde az sayıda sivrisinek aspire edin. Cam tüpten, floresan stereo mikroskop altında erkek sivrisineklerin vücudunu gözlemleyin.
Deney için sadece Rhodamine B ile işaretlenmiş erkek sivrisinekleri kullanın. Transfer seti Ağ ile sabitlenerek 12 kağıt bardak içine bir erkek sivrisinek. Bardak başına 10 sakkarozla beslenen erkek sivrisinekleri altı bardağa yerleştirin ve diğer altı bardağa fincan başına 10 Rhodamine B sakkaroz beslendi.
B kümesi erkek sivrisinekler için bu adımı tekrarlayın. Çiftleşme tahlilleri için 12 kafes kurun. Altı kafesin her birinde, Rhodamine B işaretli 10 set A erkek sivrisinek, 10 işaretsiz B kümesi erkek sivrisinek ve 10 bakir vahşi tip dişi sivrisinek bulunur.
Diğer altı kafeste, 10 işaretsiz set A erkek sivrisinek, 10 Rhodamine B işaretli B seti erkek sivrisinek ve 10 bakir vahşi tip dişi sivrisinek bulunur. İki çiftleşme kombinasyonunu net bir şekilde ayırt etmek için bu kafesleri etiketle. İlgili erkek bardaklarını etiketlere göre çiftleşme kafeslerine yerleştirin.
Ağı çıkarın ve erkekleri fincandan çıkarmak için yavaşça bardağa dokunun. Hiçbir sivrisineğin kafesten kaçmamasını sağlamak için kağıt bardağı ve ağı dikkatlice kafesten çıkarın. Erkek sivrisineklerin çiftleşme kafesine en az bir saat alışmasına izin verin.
Oral bir aspiratör kullanarak, bakire vahşi tip dişi sivrisinekleri, her bardak 10 sivrisinek içeren 12 kağıt bardağa aktarın. Erkek sivrisinekler için alışma döneminden sonra, her çiftleşme kafesine bir bardak dişi aktarın ve ağı çıkarın. Kalan dişi sivrisinekleri fincandan teşvik etmek için fincanı hafifçe itin, ardından hiçbir sivrisineklerin kafesten kaçmamasını sağlamak için kağıt bardağı ve ağı dikkatlice kafesten çıkarın.
Çiftleşmenin üç saat boyunca gerçekleşmesine izin verin ve ardından mekanik bir aspiratör ile her kafesten tüm sivrisinekleri çıkararak çiftleşme deneyini sonlandırın. Sivrisinekleri buz üzerinde en az beş dakika soğuk uyuşturun. Sivrisinekler tamamen uyuşturulduğu zaman, dişi sivrisinekleri hafifçe toplayın ve ağ ile sabitlenmiş ayrı bir kağıt bardağa barındırın.
Kağıt kabı, ilgili etiketi çiftleşme kafesinden bardağa aktararak etiketleyin. Dişi spermathecae puanlamak için, bir stereo mikroskop altında diseksiyondan önce en az beş dakika boyunca buz üzerinde dişi sivrisinekleri soğuk uyuşturun. Dişi sivrisinekleri stereo mikroskop altında parçalara ayrıştırın.
Spermathecae'yi mikroskop altında inceleyin. Dişi döllenmezse, üç spermathecae de boş olur ve döllenirse spermathecae'nin iki veya üçü hareketli spermle doldurulur. Döllenmiş bireyler için, spermathecae'nin Rhodamine B işaretli seminal sıvı içerip içermediğini, RFP1 filtresi ile donatılmış floresan stereo mikroskop altında inceleyerek belirleyin.
Spermathecae, Rhodamine B ile işaretlenmemiş seminal sıvı ile doldurulursa, floresan gözlenmez. Öte yandan, spermatheca Rhodamine B işaretli seminal sıvı içeriyorsa, floresan turuncu olurdu. Bu çiftleşme rekabet tahlilinin amacı, birkaç nesil akraba evliliğinden sonra erkek çiftleşme zindeliğinde bir kayıp olup olmadığını belirlemekti.
Çiftleşme rekabet gücü testinin deneysel triplicates yapıldı ve tohumlama verileri burada gösterilmiştir. Yabani tip dişiler, karşılıklı işaretle, doğuştan veya outcross erkekler tarafından döllendi. Sonuçlar, doğuştan veya dıştan doğmuş erkekler tarafından döllenen kadınların oranının Rhodamine B işaretinden etkilenmediğini göstermektedir.
Kadınların önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesi, her üç kopyadaki doğuştan gelen erkeklere göre outcross erkeklerle çiftleşti, bu da akraba evliliğinin çiftleşme zindeliğinde kayba yol açabileceğini gösteriyor. Dişi sivrisineklerin ekstra kafeslerini hazırlamak önemlidir. Önceden döllenmiş dişiler tüm verileri geçersiz kılacağından, erkek sivrisinekler tarafından kontamine olmuş bir kafesten dişi sivrisinekler kullanmayın.
Laboratuvar tabanlı çiftleşme rekabet gücü tahlilleri dışında, bu prosedür böcek çiftleşme biyolojisini, popülasyon dinamiklerini ve dağılımını incelemek için mark release-recapture deneylerinde kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, erkek Aedes aegypti sivrisineklerinin çiftleşme rekabet gücünü değerlendirmek için bir protokol sunmaktadır, bu da sivrisinek popülasyon kontrol stratejilerinde önemli bir değerlendirmedir. Rhodamine B'yi floresan bir marker olarak kullanarak, araştırmacılar dişi sivrisinek maruziyetinden sonra işaretli ve işaretsiz erkeklerin çiftleşme başarısını doğrudan karşılaştırabilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Sivrisinek çiftleşme rekabet gücü
- Popülasyon baskılama stratejileri
- Böcek davranışı ve biyolojisi
Arka Plan
- Hastalık bulaştırmadaki rolleri nedeniyle etkili sivrisinek popülasyon kontrolüne duyulan ihtiyaç.
- Steril böcek tekniği programlarındaki kalite kontrol için erkek çiftleşme uygunluğunu değerlendirmenin önemi.
- Deneysel doğruluk ve verimliliği artırmak için floresan marker kullanımı.
Kullanılan Yöntemler
- İşaretli ve işaretsiz erkek sivrisinekleri kullanarak kontrollü çiftleşme deneyleri.
- Model organizma olarak Aedes aegypti.
- Çiftleşme sonuçlarını ve sperm varlığını analiz etmek için floresan mikroskobu.
Ana Bulgular
- İç çiftleşme erkek çiftleşme uygunluğunu azaltır, bu da çiftleşmemiş erkeklere kıyasla iç çiftleşmiş erkeklerde daha düşük tohumlama oranları ile kanıtlanmıştır.
- Floresan işaretleme, dişilerin tohumlanma oranını etkilemedi.
- Verimli yöntem, çiftleşme rekabet gücünün hızlı değerlendirilmesine izin verir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, genetik faktörlerin Aedes aegypti'de çiftleşme başarısı üzerindeki etkisini vurgulamaktadır.
- Bulgular, sivrisinek kontrolü ve popülasyon dinamiği konusunda gelecekteki araştırmalar için önemlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Assessing male mating competitiveness is critical for evaluating strain fitness in sterile insect technique programs, directly impacting the success of vector control strategies. This fluorescent dye-based method enables rapid, quantitative comparison of mating fitness between strains, reducing experimental time by 90% and supporting data-driven go/no-go decisions in pipeline advancement. By providing a scalable, reproducible assay for target validation in vector-borne disease intervention, it enhances predictive confidence in preclinical strain selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mating fitness as a phenotypic endpoint for strain fitness evaluation.
- Operational Value: Reduces assay duration from days to hours by eliminating blood-feeding and egg-hatching steps.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying competitive mating success between sterile or Wolbachia-infected lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for mating partner identification in spermathecae.
- Operational Value: Uses sucrose feeding for non-invasive male marking, enabling high-throughput preparation of labeled cohorts.
- Reproducibility: Standardized Rhodamine B concentration (0.2% in 10% sucrose) ensures consistent labeling across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges laboratory strain evaluation to field release readiness by assessing a key fitness criterion for population suppression.
- Mechanistic De-risking: Detects fitness costs of inbreeding through reduced insemination rates, informing strain maintenance strategies.
- Disease-Relevant System: Uses Aedes aegypti, a vector for dengue, Zika, and chikungunya, aligning with global health priorities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting strain selection after genetic modification and before field trial planning, by providing a quantitative mating competitiveness metric.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that genetic background influences mating success through competitive male-female interactions.
- Screening: Produces standardized, fluorescent sperm labeling enabling blind scoring of mating outcomes across experimental groups.
- Analytics: Generates proportional insemination data per male strain, facilitating statistical comparison of mating fitness.
- Translational Research: Connects laboratory competitiveness to field efficacy by validating a prerequisite for sterile male release success.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing any two male strains, applicable across vector control programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mating fitness determinants, reducing ambiguity in strain selection.
- Operational Value: Eliminates dependency on blood feeding and embryology, simplifying workflow and increasing throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying fitness defects early, reducing investment in non-competitive strains.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated mating competitiveness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, sex separation at pupal stage, and fluorescence microscopy.
- Necessitates stereo microscope with RFP1 filter set and mercury burner lamp for standardized fluorescence detection.
- Demands cross-team standardization of male marking protocols and female dissection procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to different mosquito species or strains with varying feeding behaviors.
- Includes practical limitations such as the need to avoid pre-inseminated females and ensure proper cage labeling to prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Male and Female Mosquitoes
1:11
Preparation of 0.2% RhB Sucrose Solution and Feeding of Male Mosquitoes
1:52
Checking for RhB Fluorescence in Male Mosquitoes
2:46
Mating Competitiveness Assay
5:36
Results: Assessment of Mating Competitiveness in Male Mosquitoes
6:27
Conclusion
