Name: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden retinoik asit kullanmadan 3D retinal organoid üretim protokolünü. EB boyutu ve plakalama yoğunluğunun nicelendirilmesi, retinal indüksiyon verimliliğini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2016YFC110103, 2017YFA0104101), Guangzhou Bilim ve Teknoloji Proje Fonu (201803010078), Guangdong Eyaleti Bilim ve Teknoloji Projesi (2017B02020230003), Çin Doğa Bilimleri Vakfı (NSF) (81570874, 81970842), Sun Yat-sen Üniversitesi'nin (PT1001010) Yüz yetenek programı ve Oftalmoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı Temel Araştırma Fonları.

1. HPSC'lerin kültürü ve genişlemesi
<ol><li>HPSC kültürü
	<ol>
<li>Hücre dışı matris (ECM, hESC nitelikli matris) ile 6 kuyulu bir plakanın iki kuyusunu kapleyin. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) 8-12 μg/mL ECM içeren bir ECM çözümünün 50 mL'sini hazırlayın. 49 mL DMEM'de, çözülmüş ECM stok çözeltisinin 1 mL'si (50x) ekleyin. 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 1 mL ECM çözeltisi ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'debir inkübatörde 1 saat kuluçkaya yatır.</li>
		<li>HPSC bakım ortamını (MM) üreticinin talimatına göre hazırlayın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca önceden ılık MM.</li>
		<li>30 sn boyunca 37 °C'de bir su banyosunda inkübasyon yaparak sıvı nitrojen tankından kriyojenik bir hPSC şişesi (hiPSC veya hESC) (yaklaşık 1 x 106)çözün.</li>
		<li>Şişeyi çıkar ve% 75 dezenfeksiyon alkol spreyi kullanarak dikkatlice dezenfekte edin. Biyogüvenlik dolabına koy.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu şişeden 15 mL'lik bir tüpe aktarın, 5 mL pipet kullanarak tüpe damla damla 5 mL önceden ısıtılmış MM ekleyin. Bu arada, hPSC'leri karıştırmak için tüpü hafifçe sallayın.</li>
		<li>Tüpü 5 dakika boyunca 170 x g'da santrifüj edin. 1 mL pipet kullanarak süpernatantların çoğunu dikkatlice çıkarın ve hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 50 μL süpernatant bırakın.</li>
		<li>Tüpe 1 mL MM ekleyin ve peleti 1 mL pipetle bir veya iki kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetle yeniden ıslatın. NOT: Tek hücreli hPSC'lerin sağkalım oranı düşüktür. HPSC'lerin kolonilerde büyümesini sağlamak için 3-5 hücreli küçük hücre kümeleri tercih edilir.</li>
		<li>ECM'yi önceden kaplanmış kuyulardan çıkarın (adım 1.1.1), her kuyuya 1,5 mL MM ekleyin ve ardından kuyu başına 0,5 mL hücre süspansiyonu dağıtın.</li>
		<li>HPSC'leri düzgün bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın ve plakayı 37 °C ve% 5 CO2'debir inkübatöre koyun. Hücre yapışmasını teşvik etmek için plakayı en az 24 saat hareket ettirmeyin.</li>
		<li>mm'yi her gün değiştirin ve izdiham yaklaşık% 80'e ulaştığında HPSC'leri geçiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>HPSC'lerin geçişi NOT: HPSC'lerde farklılaşmamış halin sürdürülmesi, diğer uygulamalar için oldukça önemlidir. Uygun koşullar altında, hPSC'ler iyi tanımlanmış bir sınıra sahip kolonilerde büyür. HPSC'lerin birleşmesi yaklaşık% 80'e ulaştığında hücreler geçilmelidir.<ol>
<li>Mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Açıkça görülebilen farklılaştırılmış hücreleri (%<5) geçirmeden önce işaretleyin ve mekanik olarak çıkarın.</li>
		<li>ECM kaplı plakayı 1.1.1 adımında açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
		<li>RT'de Ca 2+ ve Mg2+ olmadan önceden ılık MM ve1x fosfat tampon salin (PBS).</li>
		<li>0,5 mM EDTA (1x PBS olarak) çözeltisini 37 °C'de bir su banyosunda önceden ısıtın.</li>
		<li>Bir vakum aspirasyon sistemi kullanarak ortamı kültür plakasından çıkarın, hücreleri 1 mL pipet kullanarak yıkamak için her kuyuya 1 mL 1x PBS ekleyin ve iki kez tekrarlayın.</li>
		<li>HPSC'leri 37 °C'de bir hücre kültürü inkübatöründe ayrıştırmak için kuyu başına 1 mL EDTA çözeltisi ve 5 dakika boyunca% 5 CO2 ekleyin. Tek hücrelere dağılmayı önlemek için önerilen kuluçka süresini aşmayın.</li>
		<li>Plakayı çıkar ve mikroskop altında hücrelerin müfrezesini kontrol et. Birleşen hPSC'ler gevşer ve her hücre kenarlığı görülebilir, ancak hücreler hücre plakasını hafifçe sallayarak kolayca çıkarılamaz.</li>
		<li>EDTA çözeltisini 1 mL pipetle çıkarın ve ayrışmayı durdurmak için 1 mL MM ekleyin. Hücreleri yeniden çıkarmak için hPSC'leri 1 mL pipetle bir veya iki kez hafifçe pipetlayın. Hücreleri toplamak için santrifüje gerek yoktur. NOT: Hücrelerin çoğu EDTA ile inkübasyondan sonra plakadan çıkarsa, hücreler santrifüj ile toplanabilir.</li>
		<li>ECM'yi önceden kaplanmış kuyulardan çıkarın (adım 1.2.2) ve kuyu başına 1,5 mL MM ekleyin.</li>
		<li>Her kuyuya 150-200 μL hücre topaklarını aktarın. Genellikle, hPSC'ler 1:6 oranında geçiş yapılabilir. Örneğin, 6 kuyulu bir plakanın bir kuyusundan hücreler altı yeni kuyuya dağıtılabilir.</li>
		<li>HPSC'leri düzgün bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın ve hPSC'leri 37 °C'de inkübatörde ve% 5 CO2'de plakaya dokunmadan en az 24 saat boyunca kültüre edin.</li>
		<li>1.1. adımda açıklandığı gibi MM'i her gün değiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HPSC'lerden retinal farklılaşma
NOT: Koloniler ~% 80 izdihama ulaştığında (Şekil 1B), Şekil 1A'daşematize edilen protokolü takiben retina organoidlerine farklılaşmak için yönlendirilebilirler. HPSC'lerin yüksek kaliteye ve iyi verime sahip olmasını sağlamak için, PLURIPOTENCY'yi IFC veya QPCR kullanarak OCT4 veya NANOG gibi moleküler belirteçlerle düzenli olarak değerlendirin. Farklılaştırılmış hücreler toplam hücrelerin %5'inden fazlasını oluşturuyorsa HPSC'ler atılmalıdır. Üreticinin talimatlarına göre mikoplazma tespit kiti ile mikoplazma kontaminasyon olup olmadığını kontrol edin. Mikoplazma hPSC'lerin farklılaşma yeteneğini değiştirebileceğinden, yalnızca mikoplazma içermeyen hPSC'leri kullanın.
<ol><li>Ortam ve reaktifleri hazırlama
	<ol>
<li>Aşağıdakileri karıştırarak sinirsel indüksiyon ortamı (NIM) hazırlayın: 500 mL Dulbecco Modifiye Kartal Orta/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F-12, 1:1), %1 N2 takviyesinin 5 mL'si, %0,1 heparinin 0,5 mL'si (1x PBS'de 2 mg/mL) ve %1 MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitlerin (NEAA) 5 mL'si.</li>
		<li>300 mL DMEM/F-12, 200 mL DMEM basic, 10 mL %2 B27 takviyesi, 5 mL %1 Antibiyotik Antimycotic ve %1 MEM NEAA'nın 5 mL'sini içeren retina farklılaşma ortamını (RDM) hazırlayın. NOT: Hem NIM hem de RDM filtrelendirilmez, ancak sterilite testi yapılır. 1 mL orta alın ve 35 mm'lik bir yemeğe ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'debir inkübatörde 3-7 gün boyunca kültür ekleyin. Ortam 4 °C'de saklanabilir ve bileşenlerin aktivitesini sağlamak için 2 hafta içinde kullanılmalıdır.</li>
		<li>DMSO'da 10 mM Blebbistatin (1.000x) hazırlayın. 10 mM stok çözeltisi (1.000x), 10 μL / tüpte aliquot elde etmek için 5 mg Blebbistatin'i çözmek için 1.710 μL DMSO ekleyin ve -20 ° C'de saklayın. NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm ortamlar ve reaktifler kullanımdan önce 30 dakika boyunca RT'de ısıtılmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyoid vücut (EB) oluşumu
	<ol>
<li>0.günde (D0), farklılaşmayı başlatın. ~%80 izdihama kadar büyüyen 6 kuyulu bir plakadan bir kuyu hPSC alın. 1.2.1 ile 1.2.6 arasında açıklanan adımlarda açıklandığı gibi EDTA ayrışma çözümüne sahip hücreleri toplayın.</li>
		<li>EDTA çözeltisini çıkarın, hücre ayrışmasını durdurmak için 10 μM Blebbistatin içeren 1 mL MM ekleyin ve hücreleri 1 mL pipetle toplayın. Hücre kümelerinin büyüklüğü, EBs verimini etkileyen temel faktörlerden biridir. D5 ila D7'de doğru boyutta EBs üretmek için yaklaşık olarak, küme başına beş hücre tercih edilir. NOT: Bu önemli bir adımdır. EB benzeri agregaların tek bir hPSC hücresinden oluşması zor olduğundan, hücreleri çok fazla boruya bindirmeyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu (yaklaşık 2 x 106 hücre) 100 mm ultra düşük ek Petri kabına aktarın ve yemeğe 10 μM Blebbistatin içeren 9 mL MM ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri düzgün bir şekilde dağıtmak için yemeği iki kez hafifçe sallayın ve kabı 37 °C ve% 5 CO2'deinkübatöre koyun.</li>
		<li>D1'de, hücreler en az 24 saat kültüre edildikten sonra, yemeği çıkar ve mikroskop altında gözlemleyin. Küçük hücre agregalarının büyük bir kısmı bu zamana kadar kendiliğinden oluşacaktır (Şekil 1C).</li>
		<li>15 mL'lik bir tüpte 3:1 oranında (9 mL MM ve 3 mL NIM) MM ve NIM ile 12 mL karışım hazırlayın.</li>
		<li>Hücre kültürlerini dik olarak 10 mL pipetli 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve önceden ısıtılmış karışımın 10 mL'lik kısmını yemeğe ekleyin.</li>
		<li>Agregaları toplamak için tüpü 3 dakika boyunca 60 x g'da santrifüjlayın, 5 mL pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 500 μL bırakın.</li>
		<li>Karışımın 2 mL'yi tüpe ekleyin ve süspansiyonu aynı yemeğe aktarın (adım 2.2.7).</li>
		<li>Hücre agregalarını düzgün bir şekilde dağıtmak için yemeği hafifçe sallayın ve tabağı inkübatöre geri koyun.</li>
		<li>D2'de, 15 mL'lik bir tüpte 1:1 oranında (6 mL MM ve 6 mL NIM) MM ve NIM ile 12 mL yeni bir karışım hazırlayın. 2.2.5'ten 2.2.10'a kadar olan adımları tekrarlayarak taze hazırlanmış karışımla hücre ortamını değiştirin.</li>
		<li>D3'te, yukarıda açıklandığı gibi 15 mL NIM ile hücre ortamını değiştirin. Askıya alma koşulları altında hücreleri en az 5 gün kültüre edin. NOT: D1 ila D3 sırasında, ortam her gün değiştirilerek yeterli beslenme sağlanmalıdır. D3'ten bu yana, NIM her gün değiştirilebilir. Ayrıca, EBs bol beslenme sağlamak için çeşitli yemeklere ayrılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>EB'leri tohumla NOT: D5 ila D7'de, ECM kaplı tabaklardaki EB'leri EB'lerin boyutuna göre kaplamak için uygun bir zaman noktası seçin. Yaklaşık çapı 200 μm olan EBs retina farklılaşması için uygundur. Genel olarak, 6 kuyulu bir plakadaki bir kuyu hPSC yaklaşık 300 ila 1.000 EBs üretebilir. EB veriminin varyasyonu hPSC hatları ile değişir.<ol>
<li>D4'te, EBs yapışmış kültürü için ECM kaplı yemekler hazırlayın. Her 100 mm doku kültürü kabına (yüzey işlem görmüş) 5 mL ECM ekleyin ve bir gecede inkübatöre koyun.</li>
		<li>D5'te ECM'yi önceden kaplanmış tabaklardan çıkarın ve her yemeğe önceden ısıtılmış 10 mL NIM ekleyin.</li>
		<li>EBs içeren tabağı çıkar. Mikroskop altında EBs kalitesini kontrol edin ve oldukça parlak ve yuvarlak olduklarından emin olun. EBs'nin büyüklüğü yaklaşık 200 μm çapındadır. Tüm EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın. EB'leri bulaşıklardan 5 mL pipetli 15 mL'lik bir tüpe aktarın. ED'lerin 5 dakika yerleşmesine izin verin. Yaklaşık 2 mL orta bırakarak süpernatant çoğunu çıkarın.</li>
		<li>10 mL NIM içeren kaplamalı yemeklere 1 mL pipet ile damla damla ES dağıtın. EB'leri cm başına yaklaşık 2-3 EB yoğunluğunda tohumla2. Örneğin, 100 mm'lik bir tabağa yaklaşık 120-180 EBs ekleyin. EB sayısını kabaca değerlendirmek için, bir kapak parçasına bir damla EB süspansiyonu yerleştirin ve mikroskop altındaki EB sayısını sayın. NOT: EBs'nin kaplama yoğunluğu retina indüksiyonunun verimliliğini etkileyen önemli faktörlerden biridir. Yoğunluk her hPSC hattı tarafından da ayarlanabilir.</li>
		<li>EBs'yi düzgün bir şekilde dağıtmak için bulaşıkları hafifçe sallayın. Bunları 37 °C ve%5 CO2'deinkübatöre koyun. NOT: EBs'nin yapışmasını artırmak için bulaşıkları en az 24 saat hareket ettirmeyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Optik veziklinlerin (OV' ler) ve retina pigment epitelinin (RPE) yapışma koşullarında indüksiyonu NOT: EB'ler ECM kaplı yüzeye tohumlandıktan sonra, hPSC'ler farklılaşmadan sonra D20 kadar erken gözlemlenebilen OV benzeri yapılar geliştirebilir. Bu protokolde, medyada N2 ve B27 takviyelerinin eklenmesi dışında hPSC'leri retina kaderine yönlendirmek için spesifik büyüme faktörleri veya sinyal molekülleri gerekli değildir.<ol>
<li>D8-D9'da bulaşıkları çıkarın ve EB'leri mikroskop altında gözlemleyin. Tüm ED'ler eklenecek ve yemeklere yayılacaktır (Şekil 1D). 10 mL eski ortam içeren her 100 mm'lik yemeğe 10 mL taze NIM ekleyin. Onları inkübatöre geri koy. NOT: Eski ortamı çıkarmayın.</li>
		<li>D12'de, 10 mL pipet kullanarak NIM ile ortamın yarısını değiştirin. Kültürü inkübatörde tut.</li>
		<li>D16'da, vakum aspirasyon sistemi kullanarak tüm NIM'leri bulaşıklardan çıkarın. Her yemeğe 20 mL RDM ekleyin. RDM'de kültlük yapmaya devam edin ve ortamın yarısını her gün değiştirin.</li>
		<li>D10-D30 sırasında, mikroskop altında haftada iki kez hücrelerin morfolojik değişikliklerini gözlemleyin ve retina farklılaşmanın verimliliğini değerlendirin. NOT: D10'dan bu yana, göz alanı (EF) etki alanları, bağlı EB'lerin çevre bölgelerinde kendi kendine organize edilir. OV benzeri yapılar D20 ila D25 arasında görünür, yavaş yavaş tabaktan çıkıntılanır ve pigmentli RPE (Şekil 1E)ile çevrili bir optik bardak oluşturur. TV'ler parlak, kırılma ve kalın NR halkası ile kolayca tanınabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Retinal organoidler (ROs) elde etmek için süspansiyonda RPE ve RPE'leri ayır ve kültür edin
	<ol>
<li>D28-D35'te, TV'lerin çoğu yemeklerde görünür. Morfolojik olarak tanımlanabilir TV'leri bitişik RPE ile birlikte mekanik olarak ayırmak için bir Tungsten iğnesi veya 1 mL şırıngalı bir iğne kullanın. Askıya almada kültür edin. NOT: OV'lerin ve RPE'lerin görünümü ve verimi farklı hPSC çizgilerinde büyük ölçüde değişir. Böylece, OV ve RPE'yi ayırmanın zaman noktası esnektir. Bitişik RPE'ye sahip bariz TV'ler ayrılabilir ve daha sonra RDM içeren düşük bir bağlantı kültür çanağından taşınabilir. Tüm RP'ler ve RP'ler kaldırılana kadar hücrelerin geri kalanını kültlemeye devam edin.</li>
		<li>ROs oluşumu için 15 mL RDM içeren her 100 mm düşük ek kültür kabına 50-60 TV koyun (Şekil 1F).</li>
		<li>RMO'lar iyi yuvarlak şekilli olduğunda, D42'ye kadar RDM'yi her 2-3 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Retina gelişimi ve olgunlaşması
NOT: Bu protokolde, uzun vadeli kültür için RO'ların büyümesini ve olgunlaşmasını sağlamak için serum gereklidir.
<ol><li>
RO'larda retina laminasyonu ve spesifikasyonu
	<ol>
<li>1x PBS'de 10 mL 100 mM taurin (1.000x) hazırlayın. 125 mg taurin tartın ve 1x PBS'nin 10 mL'sinde çözün. Çözeltiyi 0,22 μm şırındıcı filtre ile filtreleyin. 500 μL/ tüpte aliquot ve -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Retina kültürü orta 1 (RC1) hazırlayın. Aşağıdaki bileşenleri karıştırın: 250 mL DMEM/F-12, 175 mL DMEM temel, 50 mL fetal sığır serumu, 10 mL%2 B27 takviyesi, 5 mL %1 Antibiyotik Antimycotic, 5 mL %1 MEM NEAA, 0,5 mL 100 μM taurin ve 5 mL 2 mM L-alanil-L-glutamin.</li>
		<li>450 mL DMEM/F-12 içeren retina kültürü ortamı 2 (RC2) hazırlayın, 50 mL fetal sığır serumu, 5 mL%1 N2 takviyesi, 5 mL %1 Antibiyotik Antimycotic, 0,5 mL 100 μM taurin, 5 mL %1 MEM NEAA ve 5 mL 2 mM L-alnyl-L-glutamin. NOT: RC1 ve RC2 filtrelendirilmez, ancak sterilite testinden geçirilmez. 1 mL orta alın, 35 mm'lik bir yemeğe ekleyin ve kullanmadan önce steriliteyi sağlamak için 37 °C ve% 5 CO 2'de inkübatörde3-7gün boyunca kültür ekleyin. Ortam 4 °C'de saklanabilir ve bileşenlerin aktivitesini sağlamak için 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Tüm ortamlar ve reaktifler kullanımdan önce 30 dakika boyunca RT'de önceden ısıtılmalıdır.</li>
		<li>D42'de kültür ortamını RDM'den RC1'e geçirin.</li>
		<li>Bulaşıkları yaklaşık 30 ° 'de eğin ve ROs'un 30 sn yerleşmesine izin verin. ESKI RDM'yi, ROS'ları kaybetmemek için yaklaşık 1 mL orta geride bırakan 10 mL pipetle çıkarın. Her yemeğe 15 mL taze RC1 ekleyin.</li>
		<li>ROs'ları düzgün bir şekilde dağıtmak için bulaşıkları hafifçe sallayın. Bulaşıkları inkübatöre geri koy. Bundan sonra tüm ortamı haftada iki kez değiştirin.</li>
		<li>D50-D90 sırasında, kalın ve parlak bir NR ile yuvarlak şekilli uzun vadeli kültür için yüksek kaliteli RO'lar seçin. 30-40 ROs'u 20 mL RC1 ile 100 mm düşük ek kabına yerleştirin ve tüm ortamı haftada iki kez değiştirin.</li>
		<li>ROs'un uzun süreli süspansiyon kültürü için, BIR pipet kullanarak RO-RO'nun yeniden dikimini önlemek için RO'ları pipetle. ROs'ların yemeklerin yüzeyine yapışmasını önlemek için AYDA bir kez yeni kültür yemeklerine AKTARıN. NOT: Süspansiyon kültürü koşullarında, RO'lar yuvarlak şekilli olup, bir tarafta az çok RPE ile tutturulmuş parlak ve kalın bir NR halkası vardır. Lamine nöral retina gelişir ve retina hücre alt tipleri ilk olarak oluşturulan retina ganglion hücreleri, ardından fotoreceptör hücreler, amakrin hücreler ve bipolar hücreler ile ardışık olarak ortaya çıkar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ROs'ta konilerin zenginleştirilmesi ile insan fotoreceptör olgunlaşması
	<ol>
<li>D90'dan sonra, ortamı fotoreceptör olgunlaşması için uygun olan RC1'den RC2'ye geçirin.</li>
		<li>Ortamı 3.1.7-3.1.8 adımlarında açıklandığı gibi değiştirin. NOT: Bu kültür koşulu altında, ROs uzun vadeli büyüyebilir (Şekil 1G), D300'e kadar test edilir. RO'lardaki retina hücreleri olgunlaşır ve muller glial hücreler, çubuklar ve koniler de dahil olmak üzere sinir retinasının tüm hücre alt tipleri de elde edilir. RA ilavesi olmadan, koni fotoreceptörleri de ROs bakımından zengindir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li>
<li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%3A+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li>
<li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047(2014).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li>
<li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+a+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li>
<li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation%2C+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179(2019).</li>
<li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Seminals+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li>
<li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+Ggap%3A+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658(2018).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber%27s+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212(2019).</li>
<li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286(2015).</li>
<li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li>
<li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483(2015).</li>
<li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li>
<li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li>
<li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development%2C+survival%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li>
<li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li>
<li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li>
<li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li>
</ol>

Xiufeng Zhong, insan pluripotent kök hücrelerinden retina hücrelerinin üretimi ile ilgili patent mucididir.

Bu çok adımlı retina indüksiyon protokolünde, hPSC'ler retina kaderini kazanmak için adım adım yönlendirildi ve lamine NR ve RPE içeren retina organoidleri halinde kendi kendine organize edildi. Farklılaşma sırasında, hPSC'ler,ef, OV ve RPE'den retina laminasyonuna kadar insan retina gelişiminin tüm önemli adımlarını yeniden bir araya getiren, retina ganglion hücreleri, amakrin hücreleri, bipolar hücreler, çubuk ve koni fotoreceptörleri ve muller glial hücreler de dahil olmak üzere retina hücrelerinin tüm alt ti...

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve retinitis pigmentosa (RP) gibi retina dejeneratif hastalıklar (RD), fotoreceptör hücrelerinin işlev bozukluğu ve ölümü ile karakterizedir ve tipik olarak tedavi etmenin etkili yolları olmadan geri dönüşü olmayan görme kaybına yol açar1. Bu hastalıkların altında kalan mekanizma, insan hastalığı modellerinin eksikliği nedeniyle kısmen bilinmemektedir2. Son on yılda kök hücre teknolojisi ile rejeneratif tıpta önemli ilerlemeler kaydedildi. Biz de dahil olmak üzere birçok araştırmacı, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler), çeşitli farklılaşma yaklaşımları3 , 4 ,5,6,7,8,9,10, 11, hastalık modelleme ve hücre tedavisi büyük potansiyel sağlayan12,13,14.
Bununla birlikte, hPSC'lerden retina hücrelerine kadar indüksiyon süreci, zengin deneyime ve yüksek becerilere sahip araştırmacılar gerektiren düşük tekrarlanabilirlik ile oldukça karmaşık ve zaman alıcıdır. Karmaşık ve dinamik indüksiyon işlemi sırasında, bir dizi faktör retina dokularının verimini etkileyecektir15,16,17. Ayrıca, farklı indüksiyon yöntemleri genellikle retina işaretleyicilerinin zamanlaması ve sağlam ifadesi açısından önemli ölçüde değişir, bu da örnek toplama ve veri yorumlamayı şaşırtabilir3. Bu nedenle, adım adım rehberlik ile hPSC'lerden retina farklılaşması için basit bir protokol talep edilecektir.
Burada, yayınlanan çalışmalarımıza dayanarak18,19,20,21 , hPSC'lerden zengin koni fotoreseptörleri ile retinal organoidler (ROs) oluşturmak için optimize edilmiş bir retina indüksiyon protokolü tanımlanmıştır, bu da retinoik asit (RA) takviyesi gerektirmez. Bu protokol, nöral retina ve RPE oluşturmak için çok adımlı yöntemin açıklamasına odaklanır. EB oluşumu erken indüksiyon aşamasının önemli bir parçasıdır. EBs'nin hem boyutu hem de kaplama yoğunluğu, retina dokularının verimini bilimsel olarak artıran ve tekrarlanabilirliği teşvik eden nicel olarak optimize edilmiştir. İndüksiyonun ikinci bölümünde, optik veziklinler (OV'ler) yapışma kültüründe kendi kendine organize olur ve süspansiyon kültüründe ROs formu; bu kısmın zaman kursları ve verimlilikleri farklı hPSC hatlarında önemli ölçüde farklılık gösterir. RO'lardaki retina hücrelerinin olgunlaşması ve spesifikasyonu esas olarak indüksiyonun orta ve geç aşamasında ortaya çıkar. RA ilavesi olmadan, hem zengin konilere hem de çubuklara sahip olgun fotoreceptörler üretilebilir.
Bu protokolün amacı, deneyimsiz araştırmacıların tekrar etmesi için her adımı nicel olarak tanımlamak ve detaylandırmaktır. Koni bakımından zengin retina dokularının sağlam verimi ve yüksek tekrarlanabilirlik ile çeşitli hPSC hatları bu protokol ile ROs'a başarıyla indüklenmiştir. Bu protokole sahip HPSC'lerden türetilmiş RO'lar, retinagelişiminin ana adımlarını in vivo olarak yeniden özetleyebilir ve hastalık modelleme, ilaç taraması ve hücre tedavisi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştıran uzun süreli hayatta kalabilir.

<table><tbody><tr><td>(&eksi;)-Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560-5mg</td><td>KAYA inhibitörü</td></tr><tr><td>1 ml uçlar</td><td>Kirgen</td><td>KG1313</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>10 ml pipet</td><td>Sorfa</td><td>3141001</td><td>Pipet</td></tr><tr><td>100 mm Doku kültürü</td><td>BIOFIL</td><td>TCD000100</td><td>100 mm Petri kabı</td></tr><tr><td>100 mm Doku kültürü</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm Petri kabı</td></tr><tr><td>15 ml Santrifüj tüpleri</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td>Santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>35 mm Doku kültürü kapları</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 mm Petri kabı</td></tr><tr><td>5 ml pipet</td><td>Sorfa</td><td>313000</td><td>Pipet</td></tr><tr><td>50 ml Santrifüj tüpleri</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td>Santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>6 kuyulu doku kültürü plakaları</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Kültür plakaları</td></tr><tr><td>Anti-AP2 ve alfa; Antikor</td><td>DSHB</td><td>3b5</td><td>Primer&nbsp; antikor</td></tr><tr><td>ANTİBİYOTİK ANTİMYCOTIC 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Antibiyotik-Antimikotik</td></tr><tr><td>Anti-ISL1 Antikor</td><td>Boster</td><td>BM4446</td><td>Birincil&nbsp; antikor</td></tr><tr><td>, Anti-Ki67, Antikor</td>, <td>Abcam</td><td>, ab15580</td>, <td>Primer&nbsp; antikor</td></tr><tr><td>Anti-L/M opsin Dr</td><td>. jeremy</td><td>/</td><td>Primer&nbsp'den antikor hediyesi; antikor</td></tr><tr><td>, Anti-PAX6, Antikor</td>, <td>DSHB</td>, <td>pax6</td>, <td>Birincil&nbsp; antikor</td></tr>: <tr><td>Anti-tavşan 555</td><td>İnvitrojen</td><td>A31572</td><td>Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-Recoverin</td><td>Antikoru Millipore</td><td>ab5585</td><td>Birincil&nbsp; antikor</td></tr><tr><td>, Anti-Rodopsin Antikoru</td>, <td>Abcam</td>, <td>ab5417</td>, <td>Birincil&nbsp; antikor</td></tr>: <tr><td>Anti-koyun 555</td><td>Invitrogen</td>, <td>A21436</td>, <td>Eşek anti-Koyun IgG (H + L), ikincil antikor, Alexa Fluor 555</td></tr>, <tr><td>Anti-SOX9 Antikoru</td>, <td>Abklonal</td><td>A19710</td>, <td>birincil&nbsp; antikor</td></tr><tr><td>, Anti-VSX2, Antikor</td>, <td>Millipore</td><td>ab9016</td>, <td>Birincil&nbsp; antikor</td></tr><tr><td>B-27 takviyesi W/O VIT A (50X)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>Takviyesi</td></tr><tr><td>Kriyotüp şişesi</td><td>Thermo scientific-NUNC</td><td>375418</td><td>1.8 ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>D532</td><td>4 ',6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür; çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO) Hybri-max</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>Birden çok tedarikçi</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco C11995500BT</td><td></td><td>Orta DMEM</td></tr><tr><td>/ F12</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td>Orta EDTA</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>0.5 M PH 8.0</td></tr><tr><td>FBS</td><td>NATOCOR</td><td>SFBE</td><td>Serum</td></tr><tr><td>Filtresi</td><td>Millipore</td><td></td><td>SLGP033RB 0.22&mu; m, steril Millex filtre</td></tr><tr><td>GlutaMax, 100X</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanil-L-glutamin</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>Matrigel kullanmak için PBS'de 2 mg / ml</td></tr><tr><td>, 100x</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Hücre Dışı matris (ECM)</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM NEAA</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>KÖK HÜCRE</td><td>85850</td><td>hPSC'ler bakım ortamı (MM)</td></tr> <tr><td>N2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Takviyesi</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) tamponu</td><td>GNM</td><td>GNM10010</td><td>Ca +, Mg +, PH7.2 ve plusmn olmadan; 0.1 0.1M</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td>Takviyesi</td></tr><tr><td>Ultra düşük ataşman kültürü kapları 100 mm petri kabı, düşük ataşmanlı</td><td>Corning</td><td>CLS3262-20EA</td><td>Petri kabı</td></tr></tbody></table>

İnsan pluripotent kök hücrelerinden 3d retinal dokuların türetilmesi için retinal organoid İndüksiyon sistemi

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retina dejeneratif hastalıklar etkili bir tedavi olmadan geri dönüşü olmayan körlüğün başlıca nedenleridir. Her türlü retina hücresine, hatta mini retina dokularına farklılaşma potansiyeline sahip pluripotent kök hücreler, bu hastalıklara sahip hastalar ve hastalık modelleme ve ilaç taramasında birçok fırsat için büyük vaatlerde bulunmaktadır. Bununla birlikte, hPSC'lerden retina hücrelerine indüksiyon süreci karmaşık ve zaman alıcıdır. Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücreleri için uygun, yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilik ile retina dokuları oluşturmak için optimize edilmiş bir retina indüksiyon protokolünü açıklıyoruz. Bu protokol, koni fotoreceptörlerinin zenginleştirilmesine fayda sağlayan retinoik asit eklenmeden gerçekleştirilir. Bu protokolün avantajı, retina indüksiyonunun verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırmak için EB boyutunun ve kaplama yoğunluğunun ölçülmesidir. Bu yöntemle, tüm ana retina hücreleri ardışık olarak ortaya çıkar ve retina gelişiminin ana adımlarını yeniden oluşturur. Hastalık modellemesi ve hücre tedavisi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştıracaktır.

Bu protokoldeki retina indüksiyon süreci insan fetal retina gelişimini taklit eder. Retina farklılığını başlatmak için, hPSC'ler küçük kümelere ayrıştırıldı ve EBs oluşumunu teşvik etmek için süspansiyonda kültürlendi. D1'de, tekdüze hücre toplamları veya EBs oluştu (Şekil 1C). Kültür ortamı yavaş yavaş NIM'ye geçirildi. D5'te, EBs ECM kaplı kültür yemeklerine kaplandı. Hücreler yavaş yavaş EBs dışına taşındı (Şekil 1D). D10'dan itibaren, göz alanları, bağlı EB'...

Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

HPSC'lerden retina hücrelerine kadar indüksiyon süreci karmaşık ve zaman alıcıdır. Bu optimize edilmiş protokol, yüksek tekrarlanabilirlik ve maliyet olmadan retina dokuları üretebilir. Bu protokolün avantajı, hPSC'lerden retina indüksiyonunun verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırmak için EB boyutunun ve kaplama yoğunluğunun ölçülmesidir.Bu yöntemle, tüm ana retina hücreleri ardışık olarak ortaya çıkar ve retina gelişiminin ana adımlarını yeniden oluşturur. Retina dejeneratif hastalıklar için hastalık modellemesini ve hücre tedavisini kolaylaştıracaktır. Prosedürü gösteren, bir doktora öğrencisi olan Yuanyuan Guan ve laboratuvardan bir teknisyen olan Bingbing Xie ile birlikteyiz.50 mL DMEM'e üçüncü 50 kat stok çözümünün 1 mL'sini ekleyerek 50 mL ECM çözümü hazırlayarak başlayın. Ardından, altı kuyulu bir plakanın her kuyusuna hazırlanan bu ECM çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir saat kuluçkaya yatırın. HPSC bakım ortamını üreticinin talimatına göre hazırlayın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına önceden uzadı.Sıvı nitrojen tankından kriyojenik bir hPSC şişesini 30 saniye boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda kuluçkaya yatırarak dökün. % 75 alkol spreyi kullanarak dikkatlice dezenfekte edin ve bir biyo-güvenlik kabinine koyun. Hücre süspansiyonu şişeden 15 milimetrelik bir tüpe aktarın.Ardından, hPSC'leri karıştırmak için tüpü hafifçe sallarken, 5 mL pipet kullanarak tüpe 5 mL önceden ısıtılmış bakım ortamı damla damla ekleyin. Tüpü beş dakika boyunca 170 kez G'de santrifüjleyin. Hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 50 mikrolitre süpernatant bırakarak, 1 mL pipet kullanarak süpernatantın çoğunu dikkatlice çıkarın.Peletin yukarı ve aşağı borulanarak 1 mL bakım ortamı ile yeniden askıya alın. ECM'yi önceden kaplanmış kuyulardan çıkarın ve her kuyuya 1,5 mililitre bakım ortamı ekleyin. Daha sonra her kuyuya 0,5 mililitre hücre süspansiyonu dağıtın.HPSC'leri düzgün bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın. Hücre yapışmasını teşvik etmek için plakayı en az 24 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre koyun. Her gün ortam değiştirin ve HPSC'leri %80 izdihamda değiştirin.Gün-0'da, altı kuyulu plakanın bir kuyusundan% 80'lik izdiham hücrelerini çıkararak farklılaşmayı başlatın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi EDTA ayrışma çözümü ile hücreleri toplayın. EDTA çözeltisini çıkarın ve hücre ayrışmasını durdurmak için 10 mikromoler fluvastatin içeren 1 mL bakım ortamı ekleyin.Hücreleri 1 mL pipetle toplayın. Hücre süspansiyonunu 100 milimetre ultra düşük takılı petri kabına aktarın ve kabın içine 10 mikromoler fluvastatin içeren 9 mL bakım ortamı ekleyin. Hücreleri düzgün bir şekilde dağıtmak için yemeği iki kez hafifçe sallayın.Daha sonra, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre koyun. Hücreler en az 24 saat kültüre edildikten sonra mikroskop altında gözlemleyin. 15 mL'lik bir boruya 9 mL bakım ortamı ve 3 mL NIM ekleyin.Hücre kültürlerini 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve önceden ısıtılmış NIM karışımından 10 mL'yi yemeğe ekleyin. Agregaları toplamak için tüpü 3 dakika boyunca 60 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra 5 mL pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 500 mikrolitre bırakın.Karışımın 2 mL'lik kısmını tüpe ekleyin ve süspansiyonu aynı Petri kabına geri aktarın. Hücre agregalarını düzgün bir şekilde dağıtmak için tabağı hafifçe sallayın. Sonra, tabağı inkübatöre geri koyun.5. Günde, ECM'yi önceden kaplanmış tabaklardan çıkarın ve her yemeğe önceden ısıtılmış 10 mL NIM ekleyin. Ebs içeren tabağı çıkar ve mikroskop altında ES'lerin kalitesini kontrol ederek parlak ve yuvarlak olduklarından emin olun. Tüm EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika yerleşmelerine izin verin.Ardından, yaklaşık 2 mL orta bırakarak süpernatant çoğunu çıkarın. EB'leri saydıktan sonra, 10 mL NIM içeren kaplamalı yemeklere santimetrekare başına yaklaşık 2-3 EB yoğunluğunda damla damla tohumlayın. EBs'yi düzgün bir şekilde dağıtmak için bulaşıkları hafifçe sallayın ve en az 24 saat boyunca inkübatöre koyun.28 ila 35 gün içinde bitişik retina pigment epitel ile birlikte morfolojik olarak tanımlanabilir optik vezikülleri mekanik olarak ayırmak için bir tungsten iğnesi veya 1 mL şırıngalı bir iğne kullanın. Askıya almada kültür edin. Retinal organoid oluşumu için 15 mL RDM içeren her 100 milimetre düşük bağlanma kültürü kabına 50-60 optik veziklin koyun.Ortamı 42.Güne kadar her 2 ila 3 günde bir değiştirin. Retina farklılığını başlatmak için, hPSC'ler küçük kümelere ayrıştırıldı ve 1. 5. Günde EDB'ler EKM kaplı kültür yemeklerine kaplandı ve hücreler yavaş yavaş EB'lerden göç etti.Gün-16'da, indüksiyon ortamı RDM ile değiştirildi, bu da Nöral retina etki alanlarının oluşmasına ve yavaş yavaş çanaktan çıkıntı yapmasına ve ayrıca RPE hücreleriyle çevrili optik veziklin benzeri yapılar oluşturmasına neden oldu. Günler-28 ila 35 arasında, Nöral retinadan oluşan retina organoidleri, bir RPE küresine bağlanır. Bir tarafta hücreler oluştu.Retina farklılaşması ve spesifikasyonu ilerledikçe, hPSC'ler, yerel bir insan retinasının mimari özelliklerini taklit ederek yavaş yavaş katmanlar halinde sıralanan nöral retina alt tipleri üretti. Retina ganglion hücreleri ilk olarak retina progenitörlerinden üretilmiş ve nöro retinanın bazal tarafında birikmiş. Bu protokolle retinal organoidler hem zengin çubuklar hem de konilerle son derece olgun fotoreceptörlere dönüştü.Fotoreceptör hücreleri apikal tarafta, amakrin hücreler, yatay hücreler, bipolar hücreler ve muller glial hücreler ise nöral retinanın ara tabakasında yer aldı. Bu protokolün temel noktaları, yüksek kalitede Ebs oluşturmak ve bunları doğru yoğunlukta tohumlamaktadır.

retinal-organoid-induction-system-for-derivation-3d-retinal-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Burada, olgun insan retinal organoidleri üretmek ve bunları yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için farmasötik adayları tanımlamak için bir fotoreseptör toksisite testinde kullanmak için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Farmasötik Keşif için İnsan Retinal Organoidlerinde Toksisite Taramaları

Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Mikroglia, retinada bulunan benzersiz yerleşik bağışıklık hücreleridir ve çeşitli retinal dejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Retinal organoidlerin mikroglia ile ko-kültür modelinin oluşturulması, retina hastalıklarının patogenezinin ve gelişim sürecinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir.

Retinal Organoidlerin Mikroglia ile Birleştirilmesi

Bu protokol, tam montajlı retinal organoidlerin tam hacimli konfokal görüntülemesi için optik temizleme ve immün etiketlemeyi birleştirir. 3D yapıyı koruyarak, temel nöronal yolların ayrıntılı görselleştirilmesini sağlar, retina olgunlaşması, mekansal organizasyon ve hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıptaki potansiyel uygulamalarının incelenmesini geliştirir.

Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

Kağıt kadavra donör oküler Dünya'dan retina dokuları içini temizlemek için basitleştirilmiş bir tüketim kornea tekniği ve açıklar. Tekniği oküler dünyanın diğer dokulara zarar vermeden nakli, cerrahi veya araştırma amaçlı kullanılmak üzere özel tüketim kaliteli dokular için yardımcı olacaktır Burada anlatılan.

Için Basitleştirilmiş Tekniği<em&gt; Yerinde</emİnsan Oküler Globe gelen Kornea ve Retina Doku Eviserasyon of&gt; eksizyonu

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu...

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Biz retina dekolmanı bir transkriptomik analizi için retinektomi gelen retina örnekleri kullanılır. Ayrıca, cerrahi blokları ve laboratuar arasında RNA koruma sağlayan bir işlem geliştirilmiştir. Biz saflaştırılmış RNA mikroarray analizi için uygun olduğunu sağlamak için sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol.

Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden retinoik asit kullanmadan 3D retinal organoid üretim protokolünü. EB boyutu ve plakalama yoğunluğunun nicelendirilmesi, retinal indüksiyon verimliliğini artırır.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi

Daha fazla video keşfet