Tüm Mount Optik Olarak Temizlenmiş Fare Akciğerinde Aspergillus fumigatus Conidia Dağılımının Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Tabanlı Nicel Analizi

Yaklaşımımız, tamamen monte edilmiş optik olarak temizlenmiş fare akciğerinde bir Aspergillus fumigatus Conidia dağılımının nicel analizini yapmamızı sağlar. Aspergillus fumigatus Conidia solunum yollarına nüfuz edebilir ve bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda hayatı tehdit eden hastalıklara neden olabilir. Memelilerin solunum yolları farklı nesillerin hava yolları sistemidir.

Her nesil, hava yolu duvarlarının ve bağışıklık hücresi popülasyonlarının farklı yapıları ile karakterizedir. Bronş dallarında, aspergillus fumigatus Conidia mukozal boşluk ile ortadan kaldırılır. Bununla birlikte, mevcut alanda, mukoziyel boşluk çalışmaz ve Conidia, alveoler makrofajlar ve nötrofiller gibi bağışıklık hücreleri tarafından temizlenmelidir.

Hava yollarında Conidia dağılımının mekansal zamansal yönleri gibi önemlidir. Bununla birlikte, hastalık mekanizmalarının anlaşılmasında doğru bir şekilde araştırılmadı. Burada enfekte farelerin hava yollarında Aspergillus fumigatus Conidia dağılımının nicel analizi için deneysel bir kurulum sunuyoruz.

Fareye 50 mikrolitre etiketli Aspergillus fumigatus Conidia uyguluyorum. Altı saat sonra akciğeri topla. Streptavidin konjuge etiketli % 2 formaldehit ve lekede bir gecede düzeltin.

Daha sonra numuneyi optik açıklığa tabi edin. Numuneyi% 50 metanol su çözeltisi ile dolu cam şişeye yerleştirin ve bir saat boyunca oda sıcaklığında numune karıştırıcısına yerleştirin. %50 metanolünü %100 metanol ile değiştirin ve iki saat boyunca numune mikserinin altına koyun.

Bir parça benzil alkol ve iki parça benzil-benzoattan oluşan bir karışım hazırlayın. Numuneyi 24 kuyu plakasına aktarın ve en az 30 dakika benzil-benzoat karışımı ile örtün. Örnek görüntüleme için hazır.

Numuneyi numune tutucusuna yerleştirin. Ve tutucuyu mikroskopa yerleştirin. Mikroskop sistemini açtıktan ve yazılımı açtıktan sonra, iletim ışığını açın ve bir X hedefi seçin.

Örneğinizi iletim ışığında görsel olarak bulun ve edinme sekmesine geçin. Konfokal lazer mikroskopi Lambda modunu seçin. Uygun lazerleri aç.

Dedektörün spektral aralığını ayarlayın ve dikroik aynayı seçin. Dedektör kazancını ayarlayın ve iğne deliğini tek bir alan birimine daraltın. Piksel çözünürlüğünü 512 x 512 olarak ayarlayın.

zed-stack modunu çalıştırın ve canlı görüntülemeyi başlatın. Her iki zarın da görülebildiği odak düzlemini bulun. zed yığını panelini genişletin.

Odaklama tekerleğini kullanarak, numunenin en düşük ve en yüksek düzlemlerini bulun ve seçin. Odak düzlemini numunenin altına yerleştirin. zed yığını modunu kapatın ve arama tarama modunu açın.

Gerekirse, X, Y konumunu ve döşeme sayısını ayarlayın. Zed yığınını ve arama tarama modlarını açın. Zed-sectioning adımlarını beş mikrona ayarlayın.

Tarama hızını ayarlayın. Deneye başlayın. Görüntüleme genellikle arazi boyutuna ve tarama hızına bağlı olarak birkaç saat sürer.

Elde edilen görüntü daha sonra spektral olarak karıştırılır. Spektral karıştırma için doğrusal karıştırma seçeneğini kullanın. Streptavidin ve Conidia ile etiketlenmiş arazi alanlarına karşılık gelen bölgeleri seçin.

Karıştırmaya başlayın. Karıştırmayı bıraktıktan sonra karıştırılmamış dosyayı kaydedin. Elde edilen görüntüden fayansları stich etmek için görüntüyü açın.

Yöntemleri seçin, geometrik dikiş. Giriş penceresinde görüntüyü seçin. Dikiş seçeneklerinde yeni çıkış ve sigorta karoları seçeneğini belirleyin.

Hava yolu floresansına karşılık gelen seçili kanalla referans modunu kullanın. Görüntüyü fazladan 3D görünümde açın. Gerekirse, sunuları için kullanılan renkleri değiştirin.

Burada gri tonlarında hava yolu kanallarını ve mor renkte Conidia kanallarını gösteriyoruz. Hava yolu maskesi oluşturmak için yeni yüzey aracı ekleme'yi kullanın. Hava yolu kanalını seçin ve 10 mikron'un yumuşatma parametresini seçin.

Hava yolu sinyalini dışlamak için çeşitli filtreler kullanılabilir. İlk olarak, yüzeyi görsel olarak inceleyin ve yoğunluk eşiğini ayarlayın. Yüzey alanı gibi ek filtreler de sadece belirli hava yollarına uygulanabilir, ancak plevra veya kan damarları için uygulanamaz.

Ardından, hava yollarına ait olmayan seçili yüzey parçasını manuel olarak silin. Artık oluşturulan yüzeyi gözlemleyebilir ve eksik parçaları daha sonra düzeltmek için araştırabilirsiniz. Tümünü düzenleme ve maskeleme seçeneklerini kullanarak hava yolu yüzeyi için bir maske oluşturun.

Hava yolu kanalını seçin ve yüzey dışındaki çalışma hücrelerini 0,001 olarak ayarlayın. Burada ortaya çıkan maskeyi turuncu renkte gösterdik. Conidia kanalını ve hava yolu maskesini F serisinin T'si olarak iki ayrı klasöre kaydedin.

Dosyayı hava yolu maskesi görüntüsüyle açın. Görüntüyü ikili yapın. İşlem ikili takip, ikili yapmak.

Maske kalınlığına benzemek için birkaç genişlemiş 3D işlevi uygulayın. Eklentileri takip edin, işleyin, 3D'yi genişletin. Bunu yapmak için makrolar işlevini de kullanabilirsiniz.

Birkaç genişleme işlemi döngüsünden sonra, dolgu delikleri işlevini kullanın. İşlemi takip et, ikili, delikleri doldur. Maskedeki artık delikleri manuel olarak doldurmak için, ilgi alanı yöneticisinin bölgesini açın.

analiz, araçlar, yatırım getirisi yöneticisi takip edin. Çokgen seçim aracını kullanarak, belirli bir projeksiyonda doldurulması gereken bir alan seçin. İlgi çekici bölgelerin şekillerini enterpolasyon yapabilmeniz için bunu zed-stack'teki birkaç projeksiyon için birkaç kez yapın.

Seçili şekilleri enterpolasyonlamak için, bunların tümlerini seçin ve daha fazla basın, ROI'leri enterpolasyonlayın. Ardından tüm ROI'leri beyazla doldurun. Doldurma delikleri prosedürünü bir kez daha kullanın.

Delikleri doldurduktan sonra maske kalınlığını yeniden bir araya getirmek için aşındırma 3D işlevini uygulayın. Eklentileri takip edin, işleyin, 3D'yi aşındırın. Bunun için mikroları da kullanabilirsiniz.

3D ve LA 3D'yi aşındıran yineleme sayısı eşit olmalıdır. Conidia sayım uygulamasını başlatın. Dosya ekle düğmesine basın ve hazırlanan hava yolu maskesi ve Conidia floresan görüntüleri ile DIFF dosyalarına sahip klasörleri seçin.

Sıfır ile bir arasında özel bir eşik ayarlayın. Tamam'a basın ve sonuçları görün. Bu yaklaşımı kullanarak, Conidia uygulamasından altı saat sonra bronşiyal fare ağacının içinde ve dışında Conidia'nın nicel analizini gerçekleştiriyoruz.

Veriler, orijinal uygulamamızda, Conidia'nın çoğunluğunun alveola alanına nüfuz ettiğini ve enflamatuar immün yanıtın başlangıcında oraya tahsis edildiğini göstermektedir. Fare akciğerlerinin konfokal lazer tarama mikroskopisi ile üç boyutlu görüntülenmesi, hava yollarında Aspergillus fumigatus Conidia'nın tanımlanmasını sağlar. Bu protokol kullanılarak üç boyutlu görüntülerin işlenmesi, bronş dalları içindeki ve dışındaki Conidia dağılımının nicel analizini yapmaya izin veriyor.

Yaklaşımımız, Conidia eliminasyonunun kinetiğini farelerin uzaklarından tahmin etmek ve immün yetimsiz ve bağışıklık sistemi baskılanmış farelerdeki anatomik Conidia dağılımını karşılaştırmak için de kullanılabilir. Ek olarak, bu yaklaşımı kullanarak, mikropartiküllerin veya nano parçacıkların hava yollarındaki aglomeraların dağılımını analiz edebilirsiniz.