Murine Hepatosit Organoidlerinin Kurulması ve Genetik Manipülasyonu

Karaciğer memelilerde en büyük organdır. Metabolizma ve detoksifikasyonda çok önemli rol oynar. Karaciğer in vitro olarak olağanüstü bir rejenerasyon kapasitesine sahip olmasına rağmen, hepatosit in-vitro kültürü için uzun vadede hala çok büyük bir zorluktur.

Burada olgun hepatositlerden hepatosit organoidlerini kuruyoruz. Hepatatositlerin ana özelliklerini morfoloji ve fonksiyonda tutar. Bu videoda, bu organoidlerin nasıl kültürlenecekleri ve geçişleri ve bu organoidlerin genetik modifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceği ayrıntılı olarak tanıtılacaktır.

İlk olarak, karaciğer perfüzyonu ve sindirimi. Tüm bölgeleri ve aletleri hazırlayın ve steril hale getirin. Fareyi yıkayın ve epidermal ve cildi açın ve ardından karaciğerin kese fırınını bulmaya çalışın.

İğneleri içine enjekte et ve bunu yakala. Karaciğer soluklaşana kadar perfüzyonu dakikada beş mililitre hızında yapın. Onları perfüzyon tamponuna değiştirin, dikkatlice yerleştirin, yumuşayana kadar karaciğeri izleyin.

Genellikle üç ila beş dakika sürer, sonra karaciğeri kesin ve plakalara koyun ve makasla küçük parçalara ayırın. Sık sık yukarı ve aşağı pep. Genellikle, onları tek hücreye yapmak 10 ila 15 dakika sürer.

Ve sonra 10 ila 15 dakika ile yukarı ve aşağı pep ve fitter ile onları beslemek. Onları tek bir hücreye dönüştür. 50 mililitrelik tüpteki tüm hücreleri toplayın ve hız ile santrifüj edin ve ardından plaka başına tüm hücreleri toplayın.

Onları her zaman soğuk buzda tutmaya çalış. Tek hücreli süspansiyonları yapın ve hücre sayacıyla sayın. Genellikle hepatositler mutluysa, canlı floresan vardır.

İkinci bölümde, hücreleri oturtmaya ve organoid kültürünü yapmaya çalışıyoruz. Tüm hücre süspansiyonlarını topluyoruz ve hücreleri belirli bir konsensyonla sayıyoruz ve sonra. Metrogeller. ve kod ortamı.

Genellikle, orta ve metrogellerle, 1 ila 2 veya 1 ila 3 oranında alırız. Dikkatlice karıştırdıktan sonra, degrade plakalara oturtacağız. Genellikle 24 plakaya 100 mikrolitre ekliyoruz.

Onları 37 derece sıcaklıkta inkübatöre koyun. 20 dakika sonra, altta altta ve daha sonra ortada alt ile ters öne koyuyoruz. İki ya da üç günlük karşı koymayla, genellikle organoidlerin çıktığını görürüz.

Bu organoidlerimizin tipik görüntüsüdür. Geçişi yapmak veya genetik modifikasyon yöntemi yapmak istiyorsak genellikle organoidlerden tek hücrelere ihtiyacımız var Tüm organoidleri karşı plakalardan kat yıkama tamponu ile toplarız. Süpernatantı düşürüyoruz, sonra palto yıkama tamponuna tabağa, karıştırıyoruz, bu yüzden yukarı ve aşağı pep.

Ve sonra genellikle tüm uçları yıkama bantları tamponu ile önceden yıkarız. Tüm organoidlerin uçlara uçmasını önlemek için. Ve sonra, buzda yeni bir partiyle ya da onsuz, tüm organoidleri centro-fusion ile topluyoruz.

Onları tedavi ediyoruz, tüm metrogelleri çıkarmak için bir ışıltı var. Buz üzerinde 20 ila 30 dakika kuluçkadan sonra tüm metrogeller kaldırılır. Tüm temiz organoidleri topluyoruz ve tek hücre haline getirmek için tripsin ekliyoruz.

Tripsin eklendikten sonra organoidleri inkübatöre tedavi ediyoruz. Karaciğer organoidlerinin tek hücreli olması 5 ila 10 dakika sürer. Triplatin durdurmak için daha fazla yıkama tamponu ekliyoruz.

Ve sonra onlara doğru aşağı yukarı moral ver. Opsiyon işlemi için, tüm tripsinleri çıkarmak için bir kez daha yıkayabilirsiniz. Centrofusion ile yıkadıktan sonra, onları hücre sayacının altında sayabiliriz.

Daha sonra bu hepatosit organoidlerinin nasıl işlem yapılacağını veya transfeksiyonunun nasıl yapılacağını göstereceğiz. İlk olarak, ne yapacağınızı tüpleri etiketleyin ve sonra üreticinin talimatlarına göre görme transfeksiyonunu yapacağız. İhtiyacın olan, LIPOYL gerçeğinin INI MaX'i evcilleştirme naibi.

Biz de ekliyoruz. kontrol ve spesifik gen siRNA, ve üreticinin talimatlarına göre optimum ile onları kuluçkaya. Ve sonra hücre konsantrasyonuna göre RAN max'i ekleyip iyice karıştırıyoruz.

Daha sonra RAN max'i optimum ile ayrı ayrı ekleyip buza koyuyoruz. 5 dakika sonra, farklı siRNA'lar, Spesifik gen RANi ve II kontrolü ile ayrı RAN max karışımını ayrı ayrı pep pep ve iyice karıştırın. Onları tekrar buza koyun, ve sonra tüm organoidleri toplarız, yavaş centrofusion, tüm süpernatantı bırakırız, RNAi max'i, siRNA karışımını bu hücre plakasına ekleriz ve iyice yukarı ve aşağı pepleriz.

Kısaca, hücreler ve etiket RNAi max ve siRNA karışımı gentrifikasyon ve 37 derecede 4 ila 5 saat kuluçka edildi. Son bölüm, bu hepatosit organoidleri de Lenti virüsü tarafından enfekte olabilir. Benzer mesaj siRNA transfection olarak gerçekleştirildi.

Kontrol ve siRNA virüs tüpleri iyi hazırlanmıştır ve optimum üreticinin talimatlarına göre eklenmiştir. Daha sonra poli yeşil gibi enfeksiyon bölgeleri ile ve daha sonra üreticinin talimatlar anayasasına göre farklı Lenti virüsü ekliyoruz. Organoid kültüründeki tek hücreli süspansiyonları ve 1,5 mililitre eppendorf tüplerindeki çeşitli parçacıkları birleştirin, ekleyin, iyice karıştırın Bu karışımı tabaklayın ve 32 derecede 1 saat konsantre edin.

Konsantre füzyonu 500 G'de gerçekleştirilecek ve 37 derecede 4 ila 5 saat kuluçkadan sonra hücre süspansiyonu toplanacak ve metrogelde oturtılacaktır. Ve onları tekrar kuvöze koy. Oluşum verimliliği veya diğer fonksiyonel analizler üzerindeki organ 7 ila 10 gün sonra yapılabilir.

İşte temsili sonuçlarımız. Şekil 1A'da, fareden ALB-Cre Rosa 26-GFP veya RFP hepatosit organoidimizi görebilirsiniz. Şekil 1B'de, hepatatit organoidlerimizin çoğaldığını gösteren lekelemede Ki67 pozitif sinyalini görebiliyorsunuz.

Şekil 2A ve 2B'de genlerimizin müdahale edici ekspresyonunun temsili bir gen ifadesi vardır. Hepatatit organoidlerinde genetik manipülasyondan sonra, müdahale edici etkili çok etkilidir. İşte şekil 2C, murine organoidlerimizde carsonite teknolojisi ile genetik manipülasyondan sonra görebilirsiniz.

Sonuç olarak, sonuçlarımız hepatosit organoidlerinin in vitro olarak genişletilebileceğini ve genetik olarak manipüle edilebileceğini gösterdi. Özetle, bu videoda karaciğer perfüzyon ve sindiriminin hepatositleri almak için nasıl yapacağını gösteriyoruz. Hepatositler nasıl yakalanır ve hepatositler organoidleri nasıl geçirilır.

Ayrıca, bu organoidlerin genetiğinin değiştirilmesini yapmak için siRNA ve vektör transfeksiyonunun veya Lenti virüs enfeksiyonunun nasıl yapacağını gösterdik. Ayrıca organoidlerimizde iki eksiklik var. İlk olarak, hepatatitleri saflamak için çekirdek veya kürk çekirdeği başına kullanmadık.

ve ikinci olarak, organoidlerin büyüme süresini iyileştirmek için daha fazla büyüme faktörü ve sinyalizasyon denenmesi gerektiğini düşünüyorum.