Name: Murine Hepatosit Organoidlerinin Kurulması ve Genetik Manipülasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Keşfedin fare hepatosit organoid kültürü ve CRISPR-Cas9 ile genetik manipülasyon yöntemlerini. Bu 3D sistem, karaciğer biyolojisi ve tedavi uygulamaları için uzun süreli fonksiyonel hücre modelleri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Profesör Hans Clevers'e rekombinant R-spondin1 üretmek için hücre hatlarını sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı'ndan (2019YFA0111400), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (31970779) H.H.'ye ve Shandong Üniversitesi Gençler Arası ve İnovasyon Araştırma Grubu'ndan (2020QNQT003) H.H.'ye verilen hibelerle desteklendi.

Tüm fare deneyleri Shandong Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Okulu Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve İçişleri Bakanlığı yönergeleri ve yönetmelikleri uyarınca Lisansa göre gerçekleştirilmiştir (Hayır. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOT: Bu protokol esas olarak izole primer hepatositlerden 3D organoidleri kültüre etmek için kullanılır.
1. Murine Hepatosit Organoid Kültürünün Kurulması
NOT: Matrigel veya BME gibi hücre dışı matris, organoidleri kültüre etmek için bodrum matrisi olarak kullanılır. Hücre dışı matrisi -20 °C'de saklayın ve 4 °C'de veya buzda önceden çözün. Deneyler sırasında hücre dışı matrisi buzun üzerinde tutun. Yıkama ortamı GlutaMAX, HEPES ve penisilin/streptomisi ile desteklenmiş Gelişmiş DMEM/F12'dir. Organoid kültürü için standart bir inkübatör (37 °C, nemlendirilmiş atmosfer, %5 CO2) kullanılır.
<ol><li>Malzemelerin hazırlanması<ol>
<li>Deney için gerekli aletleri hazırlayın: fare yastığı, cımbız, makas, tüp gibi steril cerrahi aletler ve 2-10 mL / dk akış hızına sahip bir pompa.</li>
		<li>Perfüzyon tamponu, sindirim tamponu dahil olmak üzere reaktifleri hazırlayın ve hepatosit izolasyonu için steril hale getirin. Taze tip IV kollajenaz (0,10 mg/mL) ve CaCl2 (0,50 M) ekleyin ve bir su banyosunda 37 °C'de tamponu önceden ısıtın.</li>
		<li>R-spondin 1 ve tüm kimyasal ve büyüme faktörü stoklarını üreticinin talimatlarına göre üretmek için koşullu ortamı hazırlayın. NOT: Koşullu ortamı ve stokları sık sık dondurmaktan ve çözmekten kaçının. Kültür ortamını taze hazırlayın ve bir ay içinde kullanın. Bu organoid şekillendirme verimliliği için kritik öneme sahiptir.</li>
	</ol></li>
	<li>Karaciğer perfüzyonu ve sindirimi ile Murine hepatosit izolasyonu NOT: Organoid kültürü için 12 hafta ile 6 ay arasında erkek veya dişi fareler kullanılmıştır. Bu aralıktaki donör fare çağından organoid oluşum verimliliğinde belirgin bir farka rastlanmadı.<ol>
<li>Fareyi etik olarak onaylanmış bir yöntemle ötenazi.</li>
		<li>Fareyi fare yastığına sabitleyin ve karın kürkü ve cildini% 70 alkolle temizleyin. Karnı açığa çıkar ve karaciğeri vücudun geri kalanının üzerine kaldırın. Karaciğeri açığa çıkarmak için bir orta hat kesiği yapın.</li>
		<li>Pompaya bağlı tüpü perfüzyon tamponu ile doldurun. Portal damarın bir kesisini yapın (damarın çapının yaklaşık 1/3'ü) ve içine dikkatlice bir kateter yerleştirin. Kanın yerleştirilmesine yardımcı olmak için sindirim organlarını kaldırın. Dışarı kaymayı ve yırtılmayı önlemek için cerrahi hatla bir kravat isteğe bağlıdır.</li>
		<li>Pompayı çalıştırın ve perfüzyon tamponu ile 5-7 mL/dk debide perfüzyon gerçekleştirin. Karaciğer hemen soluklaşırsa, perfüzyon tamponun tüm karaciğerden akmasını ve kanı dışarı sürmesini sağlamak için alt vena kavayı kesin.</li>
		<li>Akış temizlendiğinde, kanı çıkarın. Yaklaşık 5-10 dakika sürer.</li>
		<li>Perfüzyon tamponunu önceden ısıtılmış sindirim tamponu ile 5 mL/dk hızında değiştirin. Karaciğer yumuşayana ve şişene kadar pompayı durdurmayın. Karaciğer şişmeyi bıraktığında kateteri çıkarın. NOT: Aşırı sindirimden kaçınmak ve tek karaciğer hücreleri almak için uygun sindirim süresini tutmak çok önemlidir.</li>
		<li>Karaciğeri kesin ve 15 mL soğuk yıkama ortamı ile dolu 100 mm'lik bir tabağa yerleştirin. Bağları küçük makasla kesin. Karaciğeri pipet uçları veya asalarla parçalara ayırın.</li>
		<li>Tampon hücrelere doyurulana kadar hücreleri serbest bırakmak için pipet yukarı ve aşağı doğru (12-15 kez). Hücre süspansiyonu 70 μm filtreler aracılığıyla 50 mL'lik bir tüpe dökün.</li>
		<li>50 x g ve 4 °C'de 1-3 dakika santrifüjleyin. Üsttanan decant. İsteğe bağlı olarak, hücreleri yıkama ortamıyla yeniden biriktirin veya hücreleri doğrudan kültür ortamıyla yeniden biriktirin. Hemacytometer ile hücreleri sayın.</li>
		<li>Canlı hücre boyası boyamadan sonra canlı veya ölü hücreleri hücre sayacı makinesiyle ayırt edin. NOT: Hepatositleri soğuk % 40 Percoll kullanarak saflaştırmak en iyisidir. Bu adımdan sonra, uygulanabilir hepatositler tüplerin dibinde olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Organoid kültürü ve geçişi<ol>
<li>Üstnatantı çıkarın ve hepatositleri hücre dışı matris ve kültür ortamının bir karışımıyla 3:1 oranında yeniden canlandırın. NOT: 24 kuyulu bir plaka için kuyu başına 50-60 μL karışımda 10.000-20.000 hücre önerilir. Hızlı bir şekilde çalışmak ve karışımı işlem boyunca buzda tutmak önemlidir. Bu konsantrasyonda 200-500 organoid oluşabilir.</li>
		<li>Damlacıkların birbirine bağlanmasını önlemek için küçük damlacıklarla tabağa hücre/karışım damlasını ekleyin. Plakayı hücre inkübatöründe 37 °C'de, %5 CO2'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın ve hücre dışı matris katılaşana kadar plakayı 20-25 dakika dışarı alın.</li>
		<li>Kuyulara kültür ortamı (24 kuyu plakası için kuyu başına 500 μL) ekleyin ve plakayı organoid kültürü için inkübatöre geri verin. Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. Organoidleri geçilecek kadar büyük olana kadar gözlemleyin. NOT: Hepatatosit organoidlerinin geçişi için yaklaşık 400-500 μm'lik bir çap uygundur.</li>
		<li>Aşağıdaki ayrıntılı işlemle organoidleri hücre dışı matristen izole edin. Diyaframını daraltmak için bir cam Pasteur pipeti alev içinde tutun (~1/2). Organoidleri pas geçme sırasında daha küçük organoidlere ayrıştırmak için mekanik olarak 5-10 kez yukarı ve aşağı pipet. NOT: Geçiş sırasında, tüplere veya uçlara yapışan organoidlerin kaybını önlemek için önceden yıkanmış mikropipette uçları ve tüpleri uç yıkama tamponu ile hazırlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Murine hepatosit organoidlerinin genetik manipülasyonu
<ol><li>Hepatosit organoidlerinden tek hücreler<ol>
<li>Her kuyuya 500 μL soğuk yıkama orta/hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı hücre / hücre dışı matris karışımını bir mikropipette ile yok etmek ve daha sonra organoid süspansiyonu buz üzerinde 15 mL santrifüj tüpüne aktarmak için. İsteğe bağlı olarak, karışımı iyice eritmek için tüpü zaman zaman yukarı ve aşağı çevirin.</li>
		<li>500-800 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj ve süpernatantı atın. Peletin içine 1 mL tripsin çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin. 37 °C'de 5-10 dakika kuluçkaya yaslanın ve ardından 2x hacimli yıkama ortamı ekleyerek sindirimi durdurun.</li>
		<li>800 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj ve süpernatantı atın. Peleti kültür ortamı ile yeniden biriktirin ve hemacytometer kullanarak hücreleri sayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>siRNA veya plazmid transfeksiyon NOT: 50 μm'den daha küçük bir çapa sahip küçük organoidler veya hepatosit organoidlerinden tek hücreli olanlar, üreticinin talimatlarına göre Lipofectamin veya plazmidler kullanılarak siRNA ile transfeksiyon reaktifi kullanılarak transkrna ile enfekte edilir.<ol>
<li>SiRNA veya plazmidleri transfeksiyon reaktifi ile karıştırın. Organoidlerden ve Lipofectamine-RNA/Lipo-plazmid karışımından (örneğin, RNAiMAX) tek hücreleri 24 kuyu plakasındaki 1-2 kuyuya ekleyin ve 500 x g ve 32 °C'de 1 saat santrifüj ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, plakayı 37 °C'de 4-5 saat boyunca inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Hücreleri ve tohumu hücre dışı matriste, kuyu başına 10.000 hücre konsantrasyonunda kültür ortamı ile toplayın. Ortamı transfectiondan iki gün sonra seçim koşuluna değiştirin. 10 gün sonra organoid oluşum verimliliğini değerlendirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lentiviral enfeksiyon NOT: Çapı 50 μm'den az olan küçük organoidler veya hepatosit organoidlerinden tek hücreli olanlar, üreticinin talimatlarına göre enfeksiyon reaktifleri ortamı kullanılarak lentivirüs ile enfekte olur.<ol>
<li>Organoidden tek hücreli süspansiyonun 250 μL'sini ve 1,5 mL'lik bir tüpte 250 μL viral partikülleri karıştırın.</li>
		<li>Karışımı ve santrifüjü 500 x g ve 32 °C'de 1 saat boyunca plakalayın. 37 °C'de 4-5 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Kültür ortamı ile hücre dışı matriste hücreleri ve tohumu toplayın. Ortamı transfectiondan iki gün sonra seçim koşuluna değiştirin. 10 gün sonra organoid oluşum verimliliğini değerlendirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CRISPR/Cas9 tarafından genetik mühendisliği NOT: Ek malzemelerde bu performans için video sağlıyoruz. Organoidlerden tek hücreler lentivirüs ile enfekte edildi veya sgRNA ve Cas9 taşıyan plazmidler tarafından trans enfekte edildi.<ol>
<li>Yukarıdaki yönteme göre kültürlenmiş ve geçişli hepatosit organoidlerinden tek hücreleri sindirin.</li>
		<li>Üreticinin talimatlarına göre Opti-MEM ortamı ve enfeksiyon reaktifleri kullanarak tek hücreleri sgRNA ile enfekte edin.</li>
		<li>1,5 mL'lik bir tüpte 250 μL tek hücreli süspansiyon ve 250 μL viral partikülü karıştırın.</li>
		<li>500 μL karışımı 500 x g ve 32 °C'de 1 saat santrifüjleyin ve ardından 37 °C'de 4-5 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu ve tohumu hücre dışı matriste toplayın. 10 gün sonra organoid oluşum verimliliğini değerlendirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li>
<li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+%2B+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li>
<li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li>
<li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li>
<li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li>
<li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çatışma açıklamaz.

Olgun hepatositleri uzun süreler boyunca kültürleme yeteneği, karaciğer temel bilimi, ilaç toksikolojisi ve sıtma ve hepatit virüsleri gibi hepatotropik konak mikrobiyoloji enfeksiyonlarının incelenmesinde temeldir. İyi tanımlanmış bir niş ile, protokol burada hepatositler için bir kültür sistemi kurar. Bu protokol, olgun hepatositlerin hücre-hücre etkileşimini, çoğu hepatosit fonksiyonunu ve genetik değişiklikleri yeniden sağlayan bir heterojenlikle 3D kültüründe genişlemesini sağlar ve gen fonksiyon çalışmalarının ve r...

Organoidler, kendi kendini yenileyen kök hücreleri ve çok soylu farklılaştırılmış hücreleri içeren kendi kendine organize edilmiş, üç boyutlu (3D) in vitro kümelerdir1,2. Birçok organın organoidleri, bağırsak, beyin, kolon, böbrek, karaciğer, pankreas, tiroid, mide, cilt ve akciğer3,4,5,6,7 gibi iyi tanımlanmış niş faktörlerle pluripotent veya yetişkin kök hücrelerinden kurulmuştur. . Organoidler, hastalık araştırma ve tedavisinde yeni yollar açan gelişim (embriyonik veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden, PSC'lerden) veya homeostaz/rejenerasyon ilerlemesini (yetişkin kök hücrelerinden, ASC'lerden kaynaklanır) taklit ederek fiziksel hücre fonksiyonlarını yeniden kapsüllerler8,9.
Memelilerde en büyük organ olarak, karaciğer esas olarak depolama, metabolizma ve detoksifikasyondan sorumludur. İki tür epitel hücre tipi, hepatositler ve kolanjiositler, bir karaciğer lobüllerinin temel birimini oluşturur. Hepatositler karaciğer fonksiyonlarının % 70-80'inden sorumludur10. Karaciğer olağanüstü rejenerasyon kapasitesine sahip olmasına rağmen, hepatosit özelliklerinin hızlı kaybı, düzensiz hücre polarizasyonu ve adanmışlık ile geleneksel monolayer kültleme sırasında meydana gelir ve bu da araştırmacıların ve klinisyenlerin bir tabakta 'boşluk köprüleme' karaciğer modelleri inşa etme ihtiyacını arttırır. Bununla birlikte, yakın zamana kadar birincil hepatositlerden ex vivo genişletme modelleri iyi kurulmamıştı11,12,13,14,15. Karaciğer organoidleri embriyonik/indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden, fibroblast hepatosit benzeri hücrelere ve dokudan türetilmiş hücrelerden kurulabilir. Karaciğer organoidlerinin gelişimi, ilaç elekleri ve karaciğer toksisitesi tahlilleri için bir in vitro modelin uygulanmasını artırır16,17.
Burada, murine primer hepatositlerden karaciğer organoidleri oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, kollajenazın iki perfüzyonu ile hepatosit organoidlerinden oluşan bir in vitro kültür sistemi kurduk. Bu organoidler aylarca uzun süreli genişleme için geçiş yapılabilir. Fizyolojik fonksiyonları hepatositlerle oldukça uyumludur. Ayrıca, organoidler kullanılarak lentivirüs enfeksiyonu, siRNA transdüksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliği gibi genetik manipülasyonun nasıl gerçekleştirildiğinin ayrıntılı bir açıklamasını da sunuyoruz. Hepatosit organoidlerinin yayılması, karaciğer biyolojisini anlamak ve kişiselleştirilmiş ve çevirisel tıp yaklaşımları geliştirmek için organoid kullanma olasılığına ışık tutmaktadır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Perfüzyon Tamponu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sangon Bitech</td><td>A600077-0100</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100188-0500</td><td>9,00 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4,00 g/L</td></tr><tr><td>Na2HPO<>sub4&middot; 12H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1,51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80,0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0,78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Fenol Kırmızısı</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100882-0025</td><td>0,06 g/L</td></tr><tr><td><güçlü>Sindirim Tamponu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501330-0005</td><td>0.50 M</td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Sigma</td><td>C1639</td><td>0.10 mg/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sangon Bitech</td><td>C621110-0010</td><td>23.80 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4.00 g/L</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1,51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80,0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0,78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td><güçlü>Uç yıkama Tamponu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10091148</td><td>4 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C14190500BT0</td><td>4 >'de saklanır; C</td></tr><tr><td>< güçlü > Yıkama Ortamı< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM / F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td><güçlü>Kültür Orta</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Stok konsantrasyonu 500 ve mikro; M, nihai konsantrasyon 2 &mikro; M</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td>, <td>4 &°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>B-27 takviyesi 50x, eksi A vitamini</td><td>Gibco</td><td>1704-044</td><td>50 X</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>Stok konsantrasyonu 30 mM, nihai konsantrasyonu 3 ve mikro; M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>4 >'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Gastrin I</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td>Stok konsantrasyonu 100 mM, nihai konsantrasyonu 10 nM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Matrigel martix</td><td>BD</td><td>356231</td><td>-20 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>N-asetilsistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>Stok konsantrasyonu 500 mM, nihai konsantrasyonu 1 mM</td></tr><tr><td>Nictinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>Stok konsantrasyonu 1 M, son konsantrasyon 3 mM</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Rekombinant insan EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Stok konsantrasyonu 100 & mikro; g / ml, nihai konsantrasyon 50 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinant insan FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Stok konsantrasyonu 100 &mikro; g/ml, nihai konsantrasyon 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinant insan HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>Stok konsantrasyonu 100 &mikro; g / ml, son konsantrasyon 25 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TGF -&alfa;</td><td>Peprotech</td><td>100-16A</td><td>Stok konsantrasyonu 100 & g / ml, son konsantrasyon 100 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TNF -&alfa;</td><td>Origene</td><td>TP750007-1000</td><td>Stok konsantrasyonu 100 &mikro; g / ml, son konsantrasyon 100 ng / ml</td></tr><tr><td>Rho kinaz inhibitörü Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 dihidroklorür</td><td>Stok konsantrasyonu 10 mM, son konsantrasyon 10 & mikro; M</td></tr><tr><td>Rspondin-1şartlandırılmış ortam</td><td></td><td></td><td>Hu Lab'da üretilen kararlı hücre hattı. Nihai konsantrasyon% 15.</td></tr><tr><td><güçlü>Diğerleri< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m filtre</td><td>Millipore SCGPT01RE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 # silikon tüp</td><td>LangerPump</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 kuyu, süspansiyon</td><td>Greiner bio-one</td><td>GN662102-100EA</td><td></td></tr><tr><td>37 & derece; C Su Banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 & m filter</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>kök hücre</td><td>AT-104</td><td>4 > C</td></tr><tr><td>Anti-CTNNB1</td><td>BD</td><td>610154</td><td>Fare</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>CST</td><td>5174S</td><td>Tavşan</td></tr><tr><td>Anti-HDAC7</td><td>Abcam</td><td>ab50212</td><td>Fare</td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Tavşan</td></tr><tr><td>Biyolojik güvenlik kabini</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Geri Kazanım Çözeltisi</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>saklanır 4 & derecede; C</td></tr><tr><td>Santrifüj 5430</td><td>eppendorf</td><td>542700097</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>ESCO</td><td>AC2-4S1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A100231</td><td>RT</td></tr><tr><td>EVOS FL Renkli Görüntüleme Sistemleri</td><td>Invitrogen</td><td>AME4300</td><td></td></tr><tr><td>Hdac3 siRNA</td><td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.'</td>de saklanır.<td>siG2003180909192555</td><td>-20 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Hdac7 lentivirus</td><td>ShanghaiGenePharmaCo., Ltd</td><td>LV2020-2364</td><td>-80 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Hitrans GA</td><td>Şangay Genechem Co., Ltd.</td><td>REVG004</td><td>Artan virüs enfeksiyonu verimliliği</td></tr><tr><td>Image Pro Plus yazılımı Media</td><td>Cybernetics, Bethesda, MD, ABD</td><td>sürüm 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>Artan virüs enfeksiyonu verimliliği</td></tr><tr><td>Canlı hücre boyası</td><td>Luna</td><td>F23001</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Düşük hızlı masaüstü santrifüj</td><td>cence</td><td>TD5A-WS/TD5AWS</td><td></td></tr><tr><td>Nükleofaktör-&alfa; 2b Cihaz</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>31985070 4 &°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Pastör pipeti</td><td>Sangon Bitech</td><td>F621006-0001</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>LangerPump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Metanol</td></tr><tr><td>PX458</td><td>Addgene</td><td>48138</td> ile aktive edin <td>-80 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Thermo Scientific Heraeus</td><td>Labofuge 400</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td>Stok konsantrasyonu 10 mM, nihai konsantrasyon 4 &mikro; M</td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA</td><td>Gibico</td><td>25200072</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Wee1 siRNA</td><td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td><td>siG2003180909205971</td><td>-20 ° C'de saklanır; Ç</td></tr></tbody></table>

murine hepatosit organoidlerinin kurulması ve genetik manipülasyonu

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Karaciğer memelilerdeki en büyük organdır. Glikoz depolama, protein salgılama, metabolizma ve detoksifikasyonda önemli bir rol oynar. Karaciğer fonksiyonlarının çoğu için uygulayıcı olarak, birincil hepatositler sınırlı çoğalma kapasitesine sahiptir. Bu, karaciğer fizyolojik ve patolojik araştırmalar için ex vivo hepatosit genleşme modellerinin kurulmasını gerektirir. Burada, murine hepatositleri iki adım kollajenaz perfüzyonu ile izole ettik ve hücre-hücre etkileşimlerini ve fiziksel fonksiyonları yeniden oluşturmak için 'mini karaciğer' olarak 3D organoid kültürü kurduk. Organoidler, progenitörler ve olgun hepatositler de dahil olmak üzere heterojen hücre popülasyonlarından oluşur. 2-3 hafta içinde organoid oluşturmak için murine hepatositleri veya fetal hepatositleri izole etmek ve kültüre etmek ve mekanik olarak yukarı ve aşağı pipetleyerek nasıl geçişlerini göstereceğimizi göstermek için süreci ayrıntılı olarak tanıtıyoruz. Ek olarak, shRNA / ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu için organoidlerin tek hücreye nasıl sindirileceğini de tanıtacağız. Organoidler, karaciğer biyolojisi ve patobiyolojisi modellenerek ilaç elekleri, hastalık modellemesi ve temel karaciğer araştırmaları için kullanılabilir.

Dişi Alb-Cre'den hepatatit organoidleri; Rosa26-GFP fare (8 hafta) tohumlamadan beş gün sonra gözlendi (Şekil 1A). Organoidler Ki67 pozitif lekeleme ile çoğalmaktadır (Şekil 1B). Hepatosit organoidlerinde siRNA transfeksiyonu veya lentivirüs enfeksiyonu ile temsili genlerin müdahale edici ekspresyonu qRT-PCR ve batı blotu ile incelendi. Sonuçlar Şekil 2A ve 2B'de gösterilmiştir. Şekil 2C</strong...

Fare hepatatitlerinden uzun süreli ek vitro 3D organoid kültür sistemi kuruldu. Bu organoidler shRNA/ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu ile geçiş ve genetik olarak manipüle edilebilir.

Murine Hepatosit Organoidlerinin Kurulması ve Genetik Manipülasyonu

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Karaciğer memelilerde en büyük organdır. Metabolizma ve detoksifikasyonda çok önemli rol oynar. Karaciğer in vitro olarak olağanüstü bir rejenerasyon kapasitesine sahip olmasına rağmen, hepatosit in-vitro kültürü için uzun vadede hala çok büyük bir zorluktur.Burada olgun hepatositlerden hepatosit organoidlerini kuruyoruz. Hepatatositlerin ana özelliklerini morfoloji ve fonksiyonda tutar. Bu videoda, bu organoidlerin nasıl kültürlenecekleri ve geçişleri ve bu organoidlerin genetik modifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceği ayrıntılı olarak tanıtılacaktır.İlk olarak, karaciğer perfüzyonu ve sindirimi. Tüm bölgeleri ve aletleri hazırlayın ve steril hale getirin. Fareyi yıkayın ve epidermal ve cildi açın ve ardından karaciğerin kese fırınını bulmaya çalışın.İğneleri içine enjekte et ve bunu yakala. Karaciğer soluklaşana kadar perfüzyonu dakikada beş mililitre hızında yapın. Onları perfüzyon tamponuna değiştirin, dikkatlice yerleştirin, yumuşayana kadar karaciğeri izleyin.Genellikle üç ila beş dakika sürer, sonra karaciğeri kesin ve plakalara koyun ve makasla küçük parçalara ayırın. Sık sık yukarı ve aşağı pep. Genellikle, onları tek hücreye yapmak 10 ila 15 dakika sürer.Ve sonra 10 ila

establishment-and-genetic-manipulation-of-murine-hepatocyte-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu iletişim kuralı bir fare extrahepatic safra kanalını 3 boyutlu organoid sistemi üretimi açıklar. Bu safra organoids cholangiocyte Biyoloji çalışma kültüründe korunabilir. Safra organoids işaretleri hem yaratıcı hem de safra hücreleri hızlı ve polarize epitel hücrelerinin oluşmaktadır.

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Bu protokol, hızlı ve tekrarlanabilir endodermal hepatik organoidlerin (eHEPO'lar) oluşumunu tanımlar. Bu protokol ile eHEPO'lar 2 hafta içinde üretilebilmekte ve farklılaşma ve işlevselliklerini kaybetmeden uzun vadede (1 yıldan fazla) genişleyebilmektedir.

Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Bu protokol, birincil fare ve insan dokusundan türetilen lakrimal bez organoidlerinin nasıl kurulacağını, sürdürüleceğini, genetik olarak değiştirileceğini, farklılaştırılacağını, fonksiyonel olarak karakterize edileceğini ve nakledileceğini açıklar.

Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

Organoidler, organ geliştirme, ilaç keşfi ve hastalık araştırmaları için kişiselleştirilmiş doku modellemesinde devrim yaratıyor. Organoid mühendisliği, karmaşık sentetik dokular oluşturmaya doğru ilerler. Amaç, doku mühendisliğini ilerletmek için morfogenez, assembloid teknolojisi ve biyomatrisleri entegre etmektir. Bu protokol, karaciğer organogenezinin modellenmesine ve sentetik doku yapımı için kılavuzların oluşturulmasına yardımcı olur.

Karaciğer Organogenezini Modellemek, Assembloidler Oluşturmak ve İnsan Hücre Hatlarını Kullanarak Sentetik Dokular Tasarlamak için İn Vitro Yetiştirme Teknikleri

Hasta tümörlerinden üretilen organoidler ortotopik olarak fare karaciğerine enjekte edilir. Tümör olmayan karaciğer dokusunun rezeksiyonu, tümörün bulunduğu karaciğer dokusunda rejeneratif bir ortama yol açar.

Karaciğer Rejenerasyonunun Tümör Büyümesi Üzerindeki Etkisini Araştırmak İçin Hepatosellüler Kanser Hastasından Elde Edilen Bir Organoid Ksenogreft Modeli

Bu protokol, bir sıçan modelinde optimize edilmiş iki aşamalı kollajenaz karaciğer perfüzyon tekniği sunar ve in vitro uzun süreli 3D organoid kültürü için izole hepatositlerin kullanımını gösterir.

Sıçan Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepatosit İzolasyonu: Son Teknoloji 3D Organoid Kültürü İçin Çok Önemli Eski Bir Prosedür

İki raporlayıcı stratejiye uygulanan konfokal görüntüleme ve takip boru hatlarını açıklıyoruz: bireysel hücre davranışını çözmek için mozaik organoidler ve insan ve fare bağırsak organoidlerinde hücre tipi geçişlerini izlemek için fate reporter organoidler.

İnsan ve fare bağırsak organoidlerinde klonal dinamikleri ve kader geçişlerini izlemek için canlı hücre görüntüleme ve tek hücreli takip

Bu video Yeni kültür, civciv embriyolarının 24 saat kadar yumurta dışında kültür olan bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem, erken gelişme (14 som ilkel bir çizgi.) Fare E7-9 karşılık gelen bir süre çalışma sağlar. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya, bu tekniğin Uygulamaları elektroporasyon içerir.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Keşfedin fare hepatosit organoid kültürü ve CRISPR-Cas9 ile genetik manipülasyon yöntemlerini. Bu 3D sistem, karaciğer biyolojisi ve tedavi uygulamaları için uzun süreli fonksiyonel hücre modelleri sunar.

Murine Hepatosit Organoidlerinin Kurulması ve Genetik Manipülasyonu

Daha fazla video keşfet