Name: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden böbrek organoidleri üretmek için basitleştirilmiş, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir bir 3D protokol. Bu yöntem, böbrek gelişimi ve hastalık modellemesi için sağlıklı, tekdüze organoidler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 DK069403, UC2 DK126122 ve P30-DK079307 ve ASN Böbrek Araştırmaları Vakfı Ben J. Lipps Araştırma Burs Programı tarafından AP'ye finanse edilmiştir.

hPSC'leri kullanan tüm deneyler kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip bir Sınıf II biyogüvenlik başlığında gerçekleştirildi. Tüm reaktifler, aksi belirtilmedikçe hücre kültürü sınıfındadır. Tüm kültürler 37 °C, %5 CO2 hava atmosferinde inkübe edilir. Tahlilin tüm aşamalarında, embriyoid cisimler veya böbrek organoidleri toplanabilir ve analiz için sabitlenebilir veya hazırlanabilir. Bu verileri oluşturmak için kullanılan hPSC hatları tamamen karakterize edilmiş ve yayınlanmıştır18.
1. Kültür plakalarının hazırlanması
NOT: hPSC'lerin bölünmesinden yaklaşık 1 saat önce, 2 x 100 mm doku kültürü plakalarını kök hücre nitelikli bazal membran matris ekstresi (BME) ile kaplayın. Plakalar önceden kaplanabilir, bir parafin filmle kapatılabilir ve üreticilerin talimatlarına göre 4 ° C'de saklanabilir.
<ol><li>2 x 100 mm doku kültürü ile muamele edilmiş plakalar (böbrek organoid testi için 1, hücre hattını korumak için 1) ve Sınıf II biyogüvenlik başlığında 15 mL konik tüp hazırlayın.</li>
	<li>Aliquot 8 mL soğuk, serumsuz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) 15 mL konik tüpe ve ~ 4 mL 100 mm plakaların her birine, her plakanın tabanını orta ile örtmeye yetecek kadar.</li>
	<li>Dondurucudan 100 μL BME aliquot alın (-20 ° C). 2 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, 15 mL'lik konik tüpten ~1 mL soğuk DMEM alın. BME aliquot'u soğuk DMEM ile hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek, kabarcık yapmaktan kaçınarak yavaşça çözün. NOT: BME aliquot'un oda sıcaklığında oturmasına izin vermeyin. Hemen kullanın.</li>
	<li>Çözülmüş DMEM/BME'yi kalan DMEM ile birlikte 15 mL konik tüpe geri aktarın. 10 mL'lik serolojik pipetle, BME'yi eşit şekilde dağıtmak için seyreltilmiş BME'yi en az 8 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, kabarcıklar yapmaktan kaçınarak nazikçe karıştırın.</li>
	<li>Seyreltilmiş BME'nin 4 mL'sini DMEM ile her plakaya aktarın ve BME'nin eşit olarak dağıtılması için plakayı yavaşça döndürün. Kaplanmış plakayı oda sıcaklığında 1 saat veya 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. NOT: 100 mm plaka başına 50 μL BME kullanın. Diğer hPSC kültür ortamlarının ve hücre hatlarının kullanımı farklı konsantrasyonlarda BME gerektirebilir.</li>
</ol>2. Pasaj hPSC'leri
NOT: Rutin hPSC kültürü için, %70-80 oranında geçiş hücresi çizgileri.
<ol><li>Kültür ortamını geçilecek hPSC plakasından aspire edin. hPSC plakasına ~ 8 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ekleyin ve hücreleri yıkamak için hafifçe döndürün.</li>
	<li>DBPS'yi aspire edin ve 100 mm plakaya 2 mL yumuşak hücre ayrışma reaktifi (GCDR) ekleyin, hücreleri örtmek için üstüne damla damla damla ekleyin. NOT: Diğer ayrışma reaktifleri de kullanılabilir. Buna göre ayarlayın.</li>
	<li>Koloniler parçalanana ve hücreler faz kontrastı altında kırılana kadar oda sıcaklığında ~ 6-8 dakika boyunca inkübe edin (Şekil 2A). NOT: Zamanlama hücre hatları arasında değişebilir. Buna göre ayarlayın.</li>
	<li>Kuluçka yaparken, 50 mL'lik bir konik tüp hazırlayın. 16 mL hPSC ortamı (100 mm plaka başına 8 mL) ekleyin ve Rho ile ilişkili kinaz inhibitörü (ROCKi) 5 μM'lik son konsantrasyona ekleyin.</li>
	<li>DMEM'i BME kaplı plakalardan aspire edin ve her plakaya 8 mL hPSC ortamı artı ROCKi ekleyin.</li>
	<li>Hücreler hazır olduğunda (madde 2.3, Şekil 2A'da açıklandığı gibi), GCDR'yi aspire edin ve plakayı deneyciye doğru ~ 45 ° eğin ve hücreleri bir hücre kaldırıcı ile kazıyın. NOT: Hücreler parçalanıyorsa, aspire edici GCDR'yi atlayın ve devam edin.</li>
	<li>Plakayı ~ 90 ° çevirin ve kalan hücreleri kaldırmak için tekrar kazıyın. Plakayı ~ 45 ° tutun ve hücreleri 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 3 mL hPSC ortamı ile yıkayın.</li>
	<li>Büyük kümeleri (en fazla 2-3 kez) parçalamak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapın ve hücreleri hazırlanan plakalara ilgilenilen hücre hattı için uygun oranda tohumlayın. Plakayı inkübatördeki hücrelerle birlikte yerleştirin ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı şekil sekiz hareketle yavaşça hareket ettirin. NOT: Bu deneyde hPSC çizgileri 1:5 oranında bölünmüştür, bu diğer hücre hatları ve koşulları için değişebilir. Tabağı gece boyunca rahatsız edilmeden bırakın.</li>
	<li>~ 24 saat sonra, hücreleri bağlantı için inceleyin. Bağlı küçük bireysel kolonileri arayın. Harcanan ortamı aspire edin ve 8 mL taze hPSC ortamı ile doldurun (ROCKi eklenmedi).</li>
	<li>Böbrek organoid tahlilini başlatmak için hücreler ~% 60 akıcılığa ulaşana kadar günlük olarak gözlemlemeye ve beslemeye devam edin (genellikle pasajdan sonra 48 ila 72 saate ulaştı). Koloniler ideal olarak ayrık olacak ve birleşmeyecek (Şekil 2B). NOT: Pluripotens durumlarını korumak için hücreleri% 80'den fazla akıcılıkla sınırlamamak çok önemlidir. Akıcı kültürler, kaba kullanım veya daha yüksek pasajlar, istenmeyen spontan farklılaşmaya veya böbrek organoid oluşumunun düşük verimliliğine neden olabilir.</li>
</ol>3. Gün 0 - Böbrek organoid testinin kurulması
<ol><li>Başlamadan önce, hem E5-ILP hem de Aşama II ortamını formülasyonlara göre hazırlayın (Tablo 1 ve Tablo 2). NOT: Ortam, 4 °C'de 14 güne kadar saklanabilir.</li>
	<li>Bir böbrek organoid testi için (bir 6 delikli plaka için bir 100 mm kültür plakası gereklidir), 50 mL'lik bir konik tüpte tam E5-ILP ortamı hazırlayın: 8 μM CHIR99021 (14.4 μL), 3.3 μM ROCKi (6 μL), 0.1 mM beta-merkaptoetanol (32.7 μL) ile desteklenmiş 18 mL E5-ILP.</li>
	<li>6 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna 2 mL komple E5-ILP ortamı yerleştirin.</li>
	<li>hPSC'leri ~ 8 mL DPBS ile ~% 60 yoğunlukta (Şekil 2B) iki kez yıkayın. Aspirat DPBS daha sonra 100 mm plaka başına 2 mL dispase ekleyin, hücreleri örtmek için damla damla damla ve 37 ° C'de 6 dakika boyunca inkübe edin. NOT: 6 dakika sonra, kolonilerin kenarları kıvrılmaya başlayacak (Şekil 2C, kırmızı oklar) ve koloninin geri kalanı bağlı kalacaktır. Bu 6 dakika sonra elde edilmezse, hücreleri 30 saniye daha inkübatöre geri yerleştirin. Diğer hPSC ortamları ve matrisleri bu zamanlamayla uyumlu olmayabilir. Laminin esaslı BME kaplama, dispase ile uyumlu değildir. Laminin bazlı BME standart hPSC matrisi ise, bölüm 1'deki plakalardan birini, böbrek organoid testi için kullanılacak bu yöntemde açıklanan BME ile kaplayın.</li>
	<li>Hücreleri ~ 10 mL DPBS ile 3 kat yıkayın. DPBS'yi aspire edin, ardından plakayı ~ 45 ° eğin ve bir hücre kaldırıcı ile kazıyın. NOT: Dispase devre dışı bırakılmaz, bu nedenle iyice yıkanması gerekir. Yıkama sayısını azaltmayın.</li>
	<li>10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak kolonileri üstten aşağıya doğru 6 mL tam E5-ILP ortamı ile yıkayın. Büyük kolonileri parçalamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet yapın (genellikle 2 veya 3 kez yeterlidir).</li>
	<li>6 delikli plakaya kuyu başına 1 mL ekleyerek koloni kümelerini eşit olarak dağıtın. Plakayı 37 °C inkübatöre yerleştirilen bir yörüngesel çalkalayıcıya (ayarlar: orbital = 30, karşılıklı = 330°, titreşim = 5° - 2 s) yerleştirin (Şekil 2D). NOT: Titreşim özelliği, organoidlerin yeterli dağılımı ve kümelenmenin önlenmesi için önemlidir.</li>
</ol>4. Gün 2 - Yarı-orta değişimle besleme
NOT: 48 saat içinde, koloni kümeleri embriyoid cisimler oluşturacaktır.
<ol><li>Tüm ortamı hazırlayın: 6 delikli bir plaka için 15 mL'lik bir konik tüp içinde 12 mL E5-ILP ortamı + 8 μM CHIR99021 hazırlayın. NOT: Beta-merkaptoetanol ve ROCKi gerekli değildir.</li>
	<li>Embriyoid cisimlerin plakanın dibine yerleşmesine izin verin, plakayı ~ 45 ° eğin, ardından ortamı yavaşça üstten aspire edin, kuyucuk başına ~ 1 mL bırakın. NOT: Bu aşamada embriyoid cisimler hızla kümelenir. Onları > 5 dakika yetinmeye bırakmayın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL hazırlanmış tam ortam (bölüm 4.1) ekleyin. Plakayı çalkalayıcıya geri koyun.</li>
</ol>5. Gün 3 - Embriyoid cisimlerin Aşama II ortamına transferi
<ol><li>50 mL'lik bir konik tüp ve DMEM (düşük glikoz) hazırlayın. Embriyoid cisimlerin plakanın dibine yerleşmesine izin verin. Plakayı ~ 45 ° eğin ve ortamı üstten yavaşça aspire edin, kuyucuk başına ~ 1 mL bırakın.</li>
	<li>10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak tüm embriyoid cisimciklerini her bir kuyucuktan dikkatlice toplayın ve 50 mL konik tüpe aktarın.</li>
	<li>Kalan embriyoid cisimleri ~ 1 mL DMEM (düşük glikoz) ile toplamak için her bir kuyucuğu yıkayın ve bunları aynı 50 mL konik tüpe ekleyin.</li>
	<li>Embriyoid cisimleri tüpün dibine yerleşmek için bırakın, ~ 5 dakika. Beklerken, 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 2 mL Aşama II ortamı ekleyin. 200 μm hücre süzgeci kullanarak büyük embriyoid cisimleri (>300 μm) yok edin (Şekil 2E).<ol>
<li>Yeni bir 50 mL konik tüp kullanın ve 200 μm hücre süzgecini üstüne yerleştirin. Hücre süzgeci üzerinde 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak embriyoid cisimlerin tümünü dikkatlice pipetleyin.</li>
		<li>Hücre süzgecine sıkışmış embriyoid cisimleri toplamak için hücre süzgecini ek ~ 5 mL DMEM (düşük glikoz) ile durulayın. Embriyoid cisimlerin konik tüpün dibine yerleşmesine izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyoid cisimler yerleştiğinde, süpernatantı aspire edin ve ~ 10 mL DMEM (düşük glikoz) ile yıkayın.</li>
	<li>DMEM'i aspire edin ve embriyoid cisimleri 6 mL'lik Evre II ortamında yeniden askıya alın.</li>
	<li>Embriyoid cisimleri 6 kuyu ultra düşük bağlantı plakasına geri aktarın ve 6 kuyu arasında eşit olarak dağıtın.</li>
	<li>Adım 4.2 ve 4.3'te açıklandığı gibi her gün yarım orta ölçekli değişiklikler gerçekleştirin. NOT: 3. günden itibaren, embriyoid cisimler 'altın' ve pürüzsüz, küresel bir görünüme sahip olacaktır (Şekil 2F). ~ 6. günden itibaren, bireysel embriyoid cisimlerde tübül oluşumu belirginleşecek, takip eden günlerde artan sayılar optimum sayılara ulaşacak ve 14. güne kadar büyüyecektir (Şekil 2G, H). Ara sıra kümelenmeyi ortadan kaldırmak için, böbrek organoidlerini veya tübülsüz çok küçük embriyoid cisimleri görsel olarak gözlemledikten sonra, <200 ve büyük >500 μm organoidleri, 5.4.1 ve 5.4.2 numaralı adımlarda açıklandığı gibi 500 ve 200 μm hücre süzgeçleri ile eleyin.</li>
</ol>6. İplikçi şişeye ve beslemeye aktarma
NOT: Bir iplikçi şişesi, çok sayıda organoid gerektiren deneyler için 3. günden itibaren herhangi bir zamanda kullanılabilir. Organoidlerin rutin transferi laboratuvarımızda 6-8. günler arasında gerçekleşir. Ekipman mevcut değilse alternatifler için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
<ol><li>Embriyoid cisimleri, 45 mL Aşama II ortam ile 125 mL'lik bir iplikçi şişeye aktarın. Manyetik karıştırıcı hızını 120 rpm'ye ayarlayın ve inkübatöre yerleştirin (Şekil 2I).</li>
	<li>Embriyoid cisimleri veya böbrek organoidlerini beslemek için, böbrek organoidlerinin iplikçi şişenin dibine kısa bir süre yerleşmesine izin verin. Kapağı şişenin bir yan kolundan kaldırın ve aspire edici pipeti, ucu karşı iç duvara değecek şekilde içine yerleştirin.</li>
	<li>Aspire edici pipeti yavaşça aşağı doğru açın ve ortamın yaklaşık yarısını aspire edin. Aynı açıklıktan pipetleyerek 20 mL taze Stage II ortamı ile doldurun.</li>
</ol>7. 6 delikli manyetik karıştırma plakasının (6MSP) ayarlanması
NOT: Birden fazla koşulun test edilmesi gerekiyorsa, eğirici şişelerin yerine 6MSP formatı kullanılabilir. Bileşik veya nefrotoksin tedavileri için 6MSP'yi kullanın. Bu, difüzyon yoluyla besin mevcudiyetini korurken ikinci aşamada kullanılan ortam miktarını korur.
<ol><li>Oval manyetik karıştırma çubuklarını 50 mL'lik konik bir tüp içinde doku kültürüne uygun bir deterjanda (hiç kullanılmamışsa) yıkayarak temizleyin veya daha önce kullanılmışsa 1 saat > bekletin.</li>
	<li>Steril DPBS'de 3x'i kısaca yıkayın.</li>
	<li>1x'i %70 etanolde 5 dakika, steril DPBS'de 1x yıkayın.</li>
	<li>Yapışma önleyici çözelti ile durulayın ve steril DPBS'de 1x yıkayın ve aspire edin.</li>
	<li>Dikkatlice, uzun steril forseps kullanarak, embriyoid cisimler veya böbrek organoidleri ile 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin.</li>
	<li>Plakayı 6MSP'ye yerleştirin ve hızı 120 rpm'ye ayarlayın (Şekil 2J). Böbrek organoidlerini bölüm 4.2 ve 4.3'e göre yarı orta değişiklikle koruyun. NOT: Manyetik karıştırma çubuklarının yerine oturması ve dönmeye başlaması için, önce güç seviyesini kısaca 100'e ayarlamanız, ardından hepsi döndükten sonra güç seviyesini 25'e indirmeniz gerekebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715(2015).</li>
<li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li>
<li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715(2015).</li>
<li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li>
<li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).</li>
<li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li>
<li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li>
<li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150(2020).</li>
<li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li>
<li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis%2C+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li>
<li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li>
<li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li>
<li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+of+New+Zealand%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li>
<li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li>
<li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li>
<li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li>
<li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li>
<li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Önceki çalışmalar, ilk protokol adımlarının ara mezoderm farklılaşması 5,19,20 için kritik olduğunu ve bu nedenle bu aşamada sıkı bir orta bileşimin uygulanmasının gerekli olduğunu göstermiştir. Serum, albümin, proteinsiz hibridoma medium II gibi tanımlanmamış bileşenlerin protokolün ilk aşamasından çıkarılması, tahliller21 arasındaki tutarlı farklılaşma verimliliğinin artırılmasına yardımcı olabilir....

Son yıllarda, insan pluripotent kök hücrelerini böbrek organoidlerine ayırmak için bir dizi protokol geliştirilmiştir 1,2,3,4,5. Böbrek organoidleri, yeni rejeneratif tıp yaklaşımlarına yönelik araştırmalara yardımcı olmak, böbrekle ilgili hastalıkları modellemek, toksisite çalışmaları yapmak ve terapötik ilaç geliştirmek için önemli bir araç sağlamıştır. Geniş uygulanabilirliklerine rağmen, böbrek organoidlerinin olgunlaşma eksikliği, in vitro sınırlı uzun süreli kültür kapasitesi ve insan böbreğinde bulunan çeşitli hücre tiplerinin azlığı gibi sınırlamaları vardır 6,7,8. Son çalışmalar, organoid olgunlaşma seviyesini iyileştirmeye, kültür sürelerini uzatmaya ve mevcut protokollerideğiştirerek böbrek hücresi popülasyonlarının karmaşıklığını genişletmeye odaklanmıştır 9,10,11,12. Yerleşik protokolümüzün 5,13'ünün bu mevcut yinelemesinde, protokolün ilk aşamasındaki ortam bileşenlerini, insülin-transferrin-selenyum-etanolamin (ITSE), lipitler, polivinil alkol (E5-ILP) ve CHIR99021 ile desteklenmiş serumsuz bir baz ortama değiştirdik (Şekil 1). Bu değişiklikler, önceki orta bileşimimiz 5,13'ten daha az bileşene sahip ve ek büyüme faktörleri olmadan, tam olarak tanımlanmış, serum içermeyen, düşük proteinli bir ortam sağlar. Sonuç olarak, ilk aşama ortamının hazırlanması daha önce yayınlanmış sürümümüze göre daha az emek yoğundur ve partiden partiye değişkenliğiazaltabilir 5. Önceki çalışmalar, serumsuz kültür14,15'te hem insülin hem de transferrinin önemli olduğunu göstermiştir, ancak yüksek insülin seviyeleri mezoderm farklılaşmasına inhibide olabilir16. Orijinal protokolde belirtildiği gibi düşük insülin seviyelerini koruduk ve tahlilin ikinci aşamasında KOSR seviyelerini (insülin içeren) daha da azalttık. Böbrek organoid oluşumu için diğer protokollere uygun olarak, daha düşük KOSR seviyeleri, böbrek dokusunun çoğalması ve farklılaşması arasındaki dengeyi korumak için faydalıdır17. Ek olarak, Aşama II ortam13'ümüzdeki glikoz konsantrasyonunu düşürdük.
Yöntemimiz, orijinal yayın 5,13'te açıklandığı gibi, başlangıçtaki ~% 60 birleşik hPSC 100 mm kültür plakasından ~ 1.000 organoid veren böbrek organoidlerinin süspansiyon testi için bir kurulum tanımlamaktadır. Bu protokol, organoid sayılarını daha da artırmak için birden fazla 100 mm veya 150 mm plaka ile başlayarak kolayca ölçeklendirilebilir.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-985-023</td><td></td></tr><tr><td>Yapışma önleyici durulama çözeltisi</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72054</td><td>DMSO'da 10 mM stok</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; tek kullanımlık eğirme şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-152</td><td></td></tr><tr><td>Corning Ultra Düşük Ataşman 6 oyuklu plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Corning Yavaş Hızlı Karıştırıcılar</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-495-03</td><td>Eğirme şişesi kültürü için çok plakalı manyetik karıştırıcı</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>Aliquot ve dondurma</td></tr><tr><td>DMEM, düşük glikoz, piruvat, glutamin yok, fenol kırmızısı yok</td><td>Thermo Fisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Yumurta / Oval Karıştırma Çubukları</td><td>2mag</td><td>PI20106</td><td></td></tr><tr><td>Excelta Genel Amaçlı Cımbız</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-103</td><td>Hücre kültürü davlumbazında steril tutun</td></tr><tr><td>EZBio Tek Kullanımlık Ortam Şişesi, 250 mL</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>138-3211-FLS</td><td>PVA %10</td></tr> <tr><td>Falcon Standart Doku Kültürü Kapları (100 mm)</td> yapmak için <td>kullanılırThermo Fisher</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Steril Aspirasyonlu Pipet 2mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-135</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Hücre Kaldırıcılar - Hücre kaldırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Çok Fonksiyonlu 3D Döndürücüler</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-047</td><td>Orbital çalkalayıcı</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-İçermeyen Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Matrisi Termo</td><td>Fisher</td><td>A1413302</td><td><güçlü>BME</güçlü>. Buz üzerinde Aliquot ve dondurun. Bir başka uygun matris alternatifi Matrigel veya Cultrex'tir.</td></tr><tr><td>Nazik Hücre Ayrışma Reaktifi</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>7174</td><td><güçlü>GCDR</güçlü></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td>L-glutamin takviyesi.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum-Etanolamin</td><td>Thermo Fisher</td><td>51-500-056</td><td><güçlü>ITSE</güçlü></td></tr><tr><td>Nakavt&nbsp; Serum Replasmanı - Çok Türlü</td><td>Thermo Fisher</td><td>A3181502</td><td>KOSR. Aliquot ve donma</td></tr><tr><td>Lipid Karışımı 1, Kimyasal Olarak Tanımlanmış</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L0288-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Stericup Hızlı Bırakma-GP Steril Vakum Filtrasyon Sistemi 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma&nbsp; Stericup Quick Release-GP Steril Vakum Filtrasyon Sistemi 250mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Kontrol Ünitesi</td><td>2mag</td><td>VMF 90250 U</td><td></td></tr><tr><td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Mikroplaka Karıştırma Sürücüsü</td><td>2mag</td><td>VMF 40600</td><td>6MSP</td></tr><tr><td>MP Biomedicals&nbsp; 7X Temizleme Solüsyonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP0976670A4</td><td><güçlü>doku kültürüne uygun deterjan.</güçlü> Suda% 5'lik bir çözelti yapın</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF ve mTeSR Plus medium da test edilmiştir ve uygun alternatiflerdir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 50 mL Konik, Steril Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15mL Konik Steril Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-140-122</td><td>Aliquot ve dondurma</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpt</td><td>Anti-mikoplazma reaktifi. Aliquot ve </td></tr><tr><td>pluriSüzgeç & reg; 200 & mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0776417</td><td>Hücre süzgeci</td></tr><tr><td>pluriSüzgeç&reg; 500 &mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0822591</td><td>Hücre süzgeci</td></tr><tr><td>Poli (vinil alkol)% 87-90 hidrolize ve nbsp; (PVA)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P8136-250G</td><td>DPBS'de% 10, çözünene kadar 98 derece C'de karıştırılır, 138-3211-FLS</td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü Y-27632 (ROCKi)</td> <td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>72304</td> DPBS <td></td></tr><tr><td>Steril Tek Kullanımlık Serolojik Pipetlerde 10 mM stok&nbsp; - 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Steril Tek Kullanımlık Serolojik Pipetler - 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Steril Tek Kullanımlık Serolojik pipet - 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-12D</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E5</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>5916</td><td><güçlü>E5-ILP</güçlü</td></tr><tr><td>>Variomag distriBOX 2 Distribütörü</td><td>2mag</td><td>VMF 90512</td><td></td></tr> için serum içermeyen, düşük proteinli baz ortamı</tbody></table>

İnsan pluripotent kök hücrelerinden böbrek organoidleri Üretmek için basitleştirilmiş bir yöntem

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

hPSC'lerden üretilen böbrek organoidleri, sınırsız bir böbrek dokusu kaynağı sağlamıştır. İnsan böbrek organoidleri, böbrek hastalığı ve hasarını incelemek, hücre bazlı tedaviler geliştirmek ve yeni terapötikleri test etmek için paha biçilmez bir araçtır. Bu tür uygulamalar için, çok sayıda üniform organoid ve yüksek oranda tekrarlanabilir tahlillere ihtiyaç vardır. Organoidlerin genel sağlığını iyileştirmek için daha önce yayınlanmış böbrek organoid protokolümüzün üzerine inşa ettik. Bu basit, sağlam 3D protokolü, 3 gün boyunca lipitler, insülin-transferrin-selenyum-etanolamin takviyesi ve GSK3 inhibitörü (CHIR99021) ile polivinil alkol içeren minimum bileşen ortamında üniform embriyoid cisimlerin oluşumunu ve ardından nakavt serum replasmanı (KOSR) içeren ortamda kültürü içerir. Ek olarak, ajitasyon tahlilleri, embriyoid cisimlerin kümelenmesinde azalmaya ve organoidler arasındaki değişkenliği azaltmak için önemli olan düzgün bir boyutun korunmasına izin verir. Genel olarak, protokol büyük miktarlarda böbrek organoidi üretmek için hızlı, verimli ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.

Protokolümüzün bu en son versiyonunda, böbrek organoid farklılaşması tanımlanmış, düşük proteinli bir ortamda başlatılır. Tahliller tamamen süspansiyon halinde gerçekleştirilir ve hPSC'lerin tübülogenezin başlatılması için farklılaşma ve organizasyonun doğuştan gelen yeteneğine dayanır. 100 mm ~% 60 oranında bir akıcılık hPSC kültür plakasından kaynaklanan tek bir tahlil, önceki yayınımızda gösterildiği gibi rutin olarak 500-1.000 böbrek organoidi verir5. Üretilen bu kadar çok sayıda organoid nede...

Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için bir protokol tarif ediyoruz. Bu protokol iki hafta içinde böbrek organoidleri üretir. Elde edilen böbrek organoidleri, paralel ilaç testi yaklaşımları için büyük ölçekli iplikçi şişelerinde veya çok kuyulu manyetik karıştırma plakalarında kültürlenebilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Bu yöntem, hücre kültürü deneyleri için donatılmış herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kullanarak, böbrek gelişimi ve hastalık yolları hakkındaki anlayışımızı ilerletebiliriz. Bu, böbrek organoidleri üretmek için diğerlerine kıyasla nispeten basit ve ucuz bir yöntemdir.Bu tekniğin en büyük zorluğu, yüksek kaliteli insan pluripotent kök hücre kültürünü korumaktır. Hücrelerin% 80'den daha az bir yoğunlukta tutulması ve düzenli olarak bölünmesi çok önemlidir. İnsan pluripotent kök hücre kültüründe yeni olan araştırmacılar, farklılaşmaya geçmeden önce kök hücre hatlarına aşina olmalıdır.Böbrek organoid tahliline, altı kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna iki mililitre tam E5-ILP ortamı ekleyerek başlayın. İnsan pluripotent kök hücrelerini veya hPSC'leri, 100 milimetre doku kültürü ile muamele edilmiş plakalarda% 60 akıcılığa ulaşana kadar kültürleyin. hPSC'leri yaklaşık sekiz mililitre DPBS ile iki kez yıkayın.DPBS'yi aspire edin, ardından hücreleri örtmek için damla damla iki mililitre Dispase ekleyin ve 37 santigrat derecede altı dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri yaklaşık 10 mililitre DPBS ile üç kez yıkayın. DPBS'yi aspire edin, ardından plakayı 45 derece eğin ve hücreleri bir hücre kaldırıcı ile kazıyın.10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak kolonileri üstten altı mililitre tam E5-ILP ortamı ile yıkayın. Daha sonra, pipeti dikey olarak tutarak, kültür plakasının kenarlarına dokunmamaya dikkat ederek, yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek, büyük kolonileri parçalayın. Altı kuyucuklu plakaya kuyu başına bir mililitre ekleyerek koloni kümelerini eşit olarak dağıtın, ardından plakayı 37 derecelik bir santigrat inkübatörün içindeki yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.Alternatif olarak, bir orbital çalkalayıcı mevcut değilse, hücreler statik olarak kültürlenebilir. İkinci günde, embriyoid cisimlerin plakanın dibine yerleşmesine izin verdikten sonra, plakayı 45 derece eğin ve ortamı üstten yavaşça aspire ederek kuyucuk başına bir mililitre bırakın. Kuyucuk başına iki mililitre hazırlanmış tam ortam ekleyin ve plakayı çalkalayıcıya geri döndürün.Üçüncü günde, daha önce gösterildiği gibi ortamı aspire ettikten sonra, 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak tüm embriyoid cisimleri her bir kuyucuktan dikkatlice toplayın ve 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Kalan embriyoid cisimleri toplamak için, her bir kuyucuğu bir mililitre düşük glikozlu DMEM ile durulayın ve bunları aynı 50 mililitrelik konik tüpe ekleyin. Embriyoid cisimlerin tüpün dibine yerleşmesini beklerken, altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna iki mililitre Aşama II orta ekleyin.Daha sonra, yeni bir 50 mililitrelik konik tüpün üzerine 200 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirerek ve tüm embriyoid cisimleri hücre süzgeci üzerinde dikkatlice pipetleyerek büyük embriyoid cisimleri eleyin. Süzgecin içine sıkışmış embriyoid cisimleri toplamak için hücre süzgecini ilave beş mililitre DMEM ile durulayın. Daha sonraki aşamalarda, önce çok büyük embriyoid cisimleri elemek için 500 mikrometrelik bir süzgeç kullanın, daha sonra tübülsüz çok küçük embriyoid cisimleri elemek için filtratın 200 mikrometrelik bir süzgeçten geçirilmesi.200 mikrometrelik süzgeci 50 mililitrelik yeni bir tüpe çevirerek ve süzgeci DPBS ile yıkayarak 200 ila 500 mikrometre arasında doğru boyutta embriyoid gövdeleri toplayın. Süzdükten sonra, embriyoid cisimlerin konik tüpün dibine yerleşmesine izin verin, daha sonra süpernatanı aspire edin ve yaklaşık 10 mililitre DMEM ile yıkayın. Daha sonra, embriyoid cisimleri altı mililitre Aşama II ortamında yeniden askıya alın.Embriyoid cisimleri altı kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasına geri aktarın ve kuyucuklar arasında eşit olarak dağıtın. Organoidlerin çoğu pipetin tepesinde toplandığından, sonunda yaklaşık yarım mililitre bırakın, ardından ucu her bir kuyucuktaki ortama hafifçe dokundurarak organoidlerin kuyuya akmasına izin verin. Embriyoid cisimleri, 45 mililitre Aşama II ortama sahip 125 mililitrelik bir iplikçi şişesine aktarın.Manyetik karıştırma hızını 120 rpm'ye ayarlayın ve şişeyi inkübatöre yerleştirin. Embriyoid cisimleri veya böbrek organoidlerini beslemek için, iplikçi şişenin dibine kısa bir süre yerleşmelerine izin verin, ardından kapağı şişenin bir yan kolundan kaldırın ve aspire edici pipeti, ucu karşı iç duvara değecek şekilde içine yerleştirin. Pipetin yavaşça aşağı doğru açılı olmasını sağlayın ve ortamın yaklaşık yarısını aspire edin.Aynı açıklıktan pipetleyerek, 20 mililitre taze Stage II ortamı ile doldurun. Embriyoid gövdeli veya böbrek organoidleri içeren altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna dikkatlice bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirmek için uzun steril forseps kullanın. Plakayı altı tekerlekli manyetik karıştırma plakasına yerleştirin ve hızı 120 rpm'ye ayarlayın.Manyetik karıştırma çubuklarının yerine oturması ve dönmeye başlaması için, önce güç seviyesini 100 olarak ayarlayın. Tüm çubuklar dönmeye başladığında, güç seviyesini 25'e indirin. Daha önce gösterildiği gibi ortamın yarısını değiştirerek böbrek organoidlerini koruyun.14. gün böbrek organoidlerinin parafin kesitlerinin immünofloresansı, hepatosit nükleer faktör-1 beta ve Lotus tetragonolobus lektini eksprese eden renal tübüller gibi nefron segmentlerinin yanı sıra V-maf musküloaponevrotik fibrosarkom onkogen homolog B ve nefrin'i eksprese eden podosit kümelerinin varlığını göstermektedir. Bu protokoldeki modifikasyonlar, kültürün 26. gününde trombosit ve endotel hücre adezyon molekülü-1 ile boyanarak doğrulandığı gibi, endotel hücrelerinin genişlemesini destekleyebilir. İnsan pluripotent kök hücrelerinin uygun süre Dispase ile tedavi edilmesi, daha sonra tüm izleri gidermek için iyice yıkanması gerekir.Dispase tamamen çıkarılmazsa, hücre ölümüne ve embriyoid cisimlerin kümelenmesine yol açabilir. Bu yöntem, konjenital böbrek hastalıklarının gelişimini, ayrıca çeşitli böbrek hasarı yollarını ve in vitro terapötik müdahaleler için potansiyeli incelememize yardımcı olmuştur.

a-simplified-method-for-generating-kidney-organoids-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, tanımlanmış kimyasal koşullar altında hücre farklılaşması yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden insan böbrek podositlerini türetme protokolünü açıklıyoruz. Üretilen podositler, nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için kullanılabilir.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Böbrek Podositlerinin Türetilmesi: Olgun Böbrek Podositlerinin Kök Hücrelerden Yönlendirilmiş Farklılaşması İçin Bir Prosedür

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Bu çalışma, organ gelişimini incelemek için iki yöntem, kültürlü embriyonik organ ve organoidlerin vaskülarizasyonuna olanak sağlayan kuş embriyolarından koryoallantoik membran (CAM) üzerine geliştirilmiş bir ksinotransplantasyon kurulumu ve yeni bir sabit z-yönü yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı konfokal görüntüleme sağlayan modifiye deneysel koşulları ile organ kültürü yöntemi.

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

Burada sunulan, insan böbrek podositlerinin yüksek verimli (%&gt;90) ve genetik manipülasyonlardan veya alt popülasyon seçiminden bağımsız olarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetülmesi için kimyasal olarak tanımlanmış bir protokoldür. Bu protokol 26 gün içinde istenen hücre tipini üretir ve nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için yararlı olabilir.

Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması

İnsan böbrek tübuloid kültürleri, böbrek fizyolojisi ve hastalığını incelemek için değerli bir in vitro modeli temsil eder. Tübuloidler böbrek dokusundan (sağlıklı ve hastalıklı) ve idrardan da kurulabilir, ikincisi kolayca elde edilebilir ve daha az invaziv bir araştırma malzemesi kaynağını temsil eder.

Doku ve İdrardan İnsan Böbrek Tubuloidlerinin Üretimi

Burada, insan pluripotent kök hücrelerini kendi kendine örgütlenerek verimli bir şekilde kullanarak gelişimsel olarak ilgili insan kalbi organoidleri (hSO'lar) oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, gelişimsel ipuçlarının sıralı aktivasyonuna dayanır ve son derece karmaşık, işlevsel olarak ilgili insan kalp dokuları üretir.

Pluripotent Kök Hücrelerden Elde Edilen Kendi Kendine Monte Edilen İnsan Kalbi Organoidlerinin Üretilmesi

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden farklılaşan genetik olarak eşleşen epitel ve vasküler endotel hücrelerini entegre ederek böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısını ve işlevini özetleyen kişiselleştirilmiş bir çip üzerinde organ sistemi tasarlamak için bir protokol sunulmaktadır. Bu biyomühendislik sistemi, böbrek hassas tıbbını ve ilgili uygulamaları ilerletebilir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

Burada, tavuk embriyolarının selomik boşluğunda böbrek organoidlerinin transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler ve bu süreçleri verimli bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Tavuk Embriyolarında İntralomik Transplantasyon Yoluyla Böbrek Organoidlerinin Etkin Vaskülarizasyonu

Bu protokol, süspansiyon kültürü koşulları kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için kapsamlı ve etkili bir yöntem sunar. Bu çalışmanın birincil vurgusu, başlangıç hücre yoğunluğunun ve WNT agonist konsantrasyonunun belirlenmesinde yatmaktadır, böylece böbrek organoid araştırmalarıyla ilgilenen araştırmacılara fayda sağlamaktadır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Süspansiyonda Böbrek Organoidlerinin Üretilmesi

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerini kullanarak vasküler organoidler oluşturmak için bir yöntem sunar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi

Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden böbrek organoidleri üretmek için basitleştirilmiş, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir bir 3D protokol. Bu yöntem, böbrek gelişimi ve hastalık modellemesi için sağlıklı, tekdüze organoidler sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet