Name: S Aşamasında DNA İşe Alımını İncelemek için Lazer Mikro Işınlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Öğrenin, S fazında lazer mikro ışınlama ile DNA onarım proteinlerinin işe alım dinamiklerini canlı hücrelerde nasıl analiz edeceğinizi. PCNA işaretleyicisi ve konfokal mikroskopi kullanarak yüksek çözünürlüklü kinetik veriler elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar M. Pagano'ya sürekli desteği için ve D. Simoneschi, A. Marzio ve G. Tang'a makaleyi eleştirel incelemeleri için teşekkür eder. B. Miwatani-Minter, R. Miwatani ve B. Minter'e sürekli destekleri için teşekkür ediyor. G. Rona, K. Ronane Jurasz ve G. Rona'ya sürekli destekleri için teşekkür ediyor.

<ol><li>Aleksandrov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+in+complex+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics in complex DNA lesions.</a> Molecular Cell. 69 (6), 1046-1061 (2018).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+Analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+permeable+DNA+replication+and+repair+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">A novel cell permeable DNA replication and repair marker.</a> Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).</li>
<li>Keijzers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exonuclease+1+%28EXO1%29+regulatory+functions+in+dna+replication+with+putative+roles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in dna replication with putative roles in cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), (2018).</li>
<li>Cheruiyot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29-binding+promotes+Exo1+damage+recruitment+and+suppresses+its+nuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose)-binding promotes Exo1 damage recruitment and suppresses its nuclease activities.</a> DNA Repair (Amsterdam). 35, 106-115 (2015).</li>
<li>Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+domain+of+EXO1+recognizes+poly%28ADP-ribose%29+in+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).</li>
<li>Rona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+recruitment+of+the+FBXL10-RNF68-RNF2+ubiquitin+ligase+to+sites+of+DNA+damage+controls+H2A.Z+loading%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading.</a> elife. 7, (2018).</li>
<li>Young, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMELESS+forms+a+complex+with+PARP1+distinct+from+its+complex+with+TIPIN+and+plays+a+role+in+the+dna+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response.</a> Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+to+study+in+vivo+cellular+responses+to+simple+and+complex+dna+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin+I+recruitment+to+base+damage-enriched+DNA+lesions+is+modulated+by+PARP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1.</a> PLoS One. 6 (8), 23548(2011).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+site-specific+induction+of+oxidative+DNA+damage+reveals+differences+in+recruitment+of+repair+proteins+to+heterochromatin+and+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).</li>
<li>Zerjatke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cell+cycle+analysis+based+on+an+endogenous+all-in-one+reporter+for+cell+tracking+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification.</a> Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infection+induces+reactive+oxygen+species+and+DNA+damage+in+A549+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+DNA+damage+induction+and+DNA+repair+pathway+activation+by+continuous+wave+visible+light+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation.</a> AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).</li>
<li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+human+NTH1%2C+a+homolog+of+Escherichia+coli+endonuclease+III.+Direct+identification+of+Lys-212+as+the+active+nucleophilic+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).</li>
<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).</li>
<li>Taccioli, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku80%3A+product+of+the+XRCC5+gene+and+its+role+in+DNA+repair+and+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination.</a> Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).</li>
<li>Marsin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+XRCC1+in+the+coordination+and+stimulation+of+oxidative+DNA+damage+repair+initiated+by+the+DNA+glycosylase+hOGG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44068-44074 (2003).</li>
<li>Thompson, L. H., Brookman, K. W., Jones, N. J., Allen, S. A., Carrano, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+human+XRCC1+gene%2C+which+corrects+defective+DNA+strand+break+repair+and+sister+chromatid+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the human XRCC1 gene, which corrects defective DNA strand break repair and sister chromatid exchange.</a> Molecular and Cell Biology. 10 (12), 6160-6171 (1990).</li>
<li>Scharer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+excision+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide excision repair in eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 5 (10), 012609(2013).</li>
<li>Oeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+protein+migration+and+localization+after+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of protein migration and localization after laser micro-irradiation.</a> Science Reports. 9 (1), 3148(2019).</li>
<li>Mistrik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+and+stripes%3A+A+novel+quantitative+photo-manipulation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique.</a> Science Reports. 6, 19567(2016).</li>
<li>Durand, R. E., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity%2C+mutagenicity+and+dna+damage+by+hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity, mutagenicity and dna damage by hoechst 33342.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (2), 111-116 (1982).</li>
<li>Tobey, R. A., Oishi, N., Crissman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization%3A+reversible+induction+of+G2+synchrony+in+cultured+rodent+and+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization: reversible induction of G2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 87 (13), 5104-5108 (1990).</li>
<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+phosphorylation%3A+Its+role+in+DNA+damage+response+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">H2AX phosphorylation: Its role in DNA damage response and cancer therapy.</a> Journal of Nucleic Acids. 2010, (2010).</li>
</ol>

Yazarlar, sunulan eserin yayınlanmasının Nikon Corporation tarafından desteklendiğini belirtmiştir. Yazarlar rakip çıkarların olmadığını beyan eder.

Kritik adımlar ve olası protokol sorun giderme/değişiklikleri Mikro ışınlama için uygun doku kültürü damarı başarı için kritik öneme sahiptir. Çoğu yüksek çözünürlüklü görüntüleme sistemi 0,17 mm kapak camı kalınlığı için optimize edilmiştir. Daha yüksek veya daha düşük kalınlıklı görüntüleme odaları veya plastik polimerlerden yapılmış olanları (405 nm görüntüleme için optimize değildir) kullanmak görüntü kalitesini önemli ölçüde azaltabilir. Cam yüzeyleri kullanırken, hücre yapışmasını arttırmak için doku kültürüne göre işlem gördüğünden emin olun. Doku kültürü tedavi edilmezse, bu odaların, örneğin hücrelerin tohumlamadan önce poli-D lizin ile kaplanması gerekecektir. Hücreleri odalı örtü örtüsüne kaplarken, hücre döngüsü düzensizliklerini ve hücrelere ek stresi önlemek için ideal hücre yoğunluğu çok önemlidir. Kararlı bir sıcaklığı korumak için deneyden önce mikroskop bileşenlerinin uygun termal dengelenmesi, hem odağın zaman atlamalı görüntüleme boyunca korunması için çok önemlidir hem de zaman ve numuneler arasında homojen bir DDR sağlamak için de gereklidir.
Artekter verileri azaltmak için hücrelerin mikro ışınlamadan önce sağlıklı bir durumda olması önemlidir. Hücrelerin enfeksiyon sonrası/seçim sonrası düzensiz morfolojisi varsa, morfoloji normale dönene kadar hücrelerin birden fazla geçitten ilerlemesine izin verin. Her zaman kullanılan hücre hatlarının mikoplazma kontaminasyonundan arındırılmış olduğundan emin olun. Mikoplazma enfeksiyonunun birçok olumsuz etkisi arasında, konak hücrelerde DNA hasarına neden olur ve DDR yollarını etkileyebilir14,15. Hücre kültüründe mikoplazmayı tespit etmenin en hassas yolu PCR 'dir (DAPI veya Hoechst ile algılamaya karşı).
İlgi çekici onarım proteininin optimal aşırı ekspresyonu, endojen seviyelerle karşılaştırılabilir, ancak tespit için yeterince yüksek olmalıdır. Viral vektörlerde kullanılan promotör, enfeksiyon sırasında viral titre ve enfeksiyon süresinin uzunluğu ideal ifade seviyeleri için ayarlanabilir. Tutarlı sonuçlar için, homojen ifade düzeylerini ve normal hücre morfolojisini sağlamak için tek tek hücre klonlarını izole edin. Uygun hücre döngüsü ve DNA onarım işaretleyici işlevi için etiketli PCNA'yı endojen seviyelerden daha yüksek bir seviyede aşırı ifade etmeyen vektör yapılarının kullanılması önerilir. Düşük PCNA aşırı ifade seviyeleri bile S faz hücrelerini ayırt etmek için yeterlidir. Retroviral pBABE vektörleri bu amaçla başarıyla kullanılmıştır (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA, herhangi bir monomerik kırmızı(örneğin, mPlum, mCherry, mRuby, vb.) veya monomerik yeşil floresan proteinlerle (örneğin, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, vb.) etiketlenebilir ve daha sonra dönüşümlü olarak etiketlenmiş bir POI ile birleştirilebilir. Floresan etiketli bir İçN'yi aşırı ifade etmenin bazı sınırlamaları ve dikkat edilmesi gereken noktalar vardır. Floresan etiketler normal protein fonksiyonunu ve lokalizasyonunu bozabilir. Bu nedenle, etiketin konumu (N veya C terminali) dikkate alınmalıdır. Monomerik olmayan varyantların oligomerizasyonu İçN'nin işlevini etkileyebileceğinden, her zaman monomerik floresan proteinler kullanın.
Optik yolun birçok bileşeni hücrelere teslim edilen gerçek gücü etkileyeceğinden, lazer ayarları her görüntüleme sistemi için belirlenmelidir. Lazer mikro ışınlama, heyecan dalga boyuna, FRAP lazerinin güç çıkışına ve önceden duyarlı ajanların (Bromodeoxyuridine veya Hoechst gibi) kullanılıp kullanılmadığına bağlı olarak çeşitli DNA lezyonlarına neden olabilir. 405 nm lazerler oksidatif DNA hasarına neden olabilir, tek ve çift iplikli kırılmalar16,17. Daha yüksek lazer çıkış ayarları kullanılarak, DSB miktarı artar. Bu protokolde ön duyarlılık yöntemleri kullanılmamıştır, ancak bu teknikler literatürde büyük ölçüde ele alınmıştır ve aşağıdaki tartışmada yeniden kaplanmıştır. Bize göre, istenen lezyonun üretilip üretilmemelerini test etmenin en iyi yolu, bilinen DNA hasar yolu spesifik genlerinin işe alımını test etmektir. BER yolunun bileşenleri olan NTHL1 veya OGG1'in işe alınması, oksitlenmiş DNA bazları10 , 11,17,18,19'unindüksiyonunu önerirken, FBXL10 veya XRCC5 DSB 8 ,20,21'invarlığını gösterir. XRCC1'in işe alımı hem oksitlenmiş DNA bazlarının varlığını hem de tek iplikli kırılmaları (SSB)22,23gösterebilir. XPC (yani RAD4), ultraviyole ışık (UV)17,24tarafından üretilen hacimli DNA eklerini kaldıran iyi bir NER göstergesidir. Eksojen proteinlerin işe alınması bazı düzensizliklere neden olabileceğinden, endojen DNA onarım proteinlerinin veya belirteçlerinin immünofluoresan lekelenmeleri (çift iplikli molalar için φH2A.X gibi) spesifik DNA lezyonlarının varlığını doğrulayabilir. Alternatif olarak, belirli DNA lezyonlarına karşı yetiştirilen antikorlar da kullanılabilir. Teslim edilen lazer gücünü ayarlamak için hem durma süresi hem de lazer gücü değiştirilebilir.
Matematiksel modelleme yardımıyla, İçN'nin işe alım özellikleri hakkında değerli içgörüler sağlayabilecek ayrıntılı bir kinetik analiz yapılabilir (örneğin, birden fazla DNA bağlayıcı etki alanının katkısı, farklı sinyal olaylarına duyarlılık vb.). Otomatik işe alım değerlendirmesi ve hücre takibi, sağlam iş akışları oluşturmak için birleştirilebilir 1,25.
DNA ön duyarlılığının avantajları ve sınırlamaları Mikro ışınlamadan önce DNA'nın önceden duyarlı hale getirilmesi, DNA onarım proteini alımı için yaygın olarak kullanılan bir araçtır16,17. Dna'yı mikro ışınlamadan önce hassaslaştırmak DSB'lere karşı daha hassas hale gelir. DNA ön duyarlılığı için en yaygın iki yöntem Bromodeoxyuridine (BrdU) veya Hoechst boyası ile hücrelerin ön tedavisidir. Yüksek lazer güçlerinde mikro ışınlama yapamayan sistemler için, bu yöntemler DSB'ler gibi DNA lezyonlarını indükleme için gerekli olabilir. Ayrıca, iletilen bir ışık dedektörünün veya hücre çekirdeğini vurgulayan bir floresan sinyalin yokluğunda (örneğin, etiketlenmemiş endojen DNA onarım proteinlerinin alımını incelerken), Hoechst hem önceden hassaslaştırıcı bir araç hem de floresan bir nükleer leke görevi görür. Bununla birlikte, DNA ön duyarlılığı önemli komplikasyonlar ortaya getirebilir. BrdU (10 μM'lik son konsantrasyonda kullanılır), DNA'ya düzgün bir şekilde dahil olmak için hücrelere 24 saat (veya kullanılan hücre hattındaki tam hücre döngüsüne eşdeğer bir süre) eklenmelidir ve hücre döngüsü parazitine neden olabilir26. Hoechst 33342 (1 μg/mL'lik son konsantrasyonda kullanılır) uzun kuluçka dönemlerinden sonra sitotoksiktir, ancak çekirdeği boya ile doyurmak için yeterli zaman gerektirir. Bu nedenle, mikro ışınlamadan sadece 15-20 dakika önce uygulanmalıdır; aksi takdirde, işe alım verileri tutarlı olmayacaktır. Bu şekilde boyanmış hücreler birkaç saatten fazla kültürde tutulamaz27,28. Hoechst 33342 boyası kadar hücre geçirgen olmayan Hoechst 33358'i kullanmamaya dikkat edin. Ön duyarlılık ayrıca deneyler arasında gereksiz farklılıklar ortaya çıkarır ve deneyi hücre yoğunluğundaki farklılıklara karşı daha da hassas hale getirir (çünkü bu, birikmiş boya / hücre miktarını etkileyecektir).
Konfokal mikroskopinin avantajları ve sınırlamaları Konfokal mikroskopinin görüntüleme hızı geniş alan mikrokroskopisi ile karşılaştırıldığında sınırlayıcı olabilir. Bununla birlikte, rezonans tarayıcı ile donatılmış bir konfokal mikroskop, dönen disk mikroskopi hızlarına yaklaşan görüntüleme hızını (çözünürlük pahasına) inanılmaz derecede artırabilir. Üç özellik, A1R HD25 konfokal sistemi burada sunulan protokol için mükemmel bir seçim haline getirir. İlk olarak, sistemin 25 mm FOV'u, tek bir taranmış alanda (normal kurulumlarda 5-10 hücreye karşı) 15-20 hücre arasında görüntü oluşturmayı mümkün kılar ve istatistiksel analiz için yeterli hücre elde etmek için gerekli kazanım sayısını sınırlar. İkincisi, FRAP modülü ve iki scanhead, hücreleri yalnızca ardışık olarak değil, aynı anda görüntülemeyi ve mikro ışınlanmayı mümkün kılır. Son olarak, hem rezonans hem de galvano tarayıcılara sahip olma esnekliği, floroforların söndürülmesine en aza indiren olağanüstü hıza sahip yüksek zamansal çözünürlüklü görüntüleme ile daha yüksek sinyal-gürültü oranına sahip görüntüler üretmek için daha yavaş tarama hızlarını kullanan yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme arasında kolayca geçiş yapma olanağı sağlar. Kullanılan sistem yukarıda belirtilen esnekliğe izin verirken, daha yaygın olarak bulunan konfokal mikroskop konfigürasyonlarına benzemesi için, sunulan deneylerde (hem mikro ışınlama hem de sonraki görüntüleme için) sadece galvano tarayıcı kullanılmıştır.
Mikro ışınlamanın avantajları ve sınırlamaları Mikro ışınlama rakipsiz mekansal ve zamansal çözünürlük sağlarken, sınırlamasız değildir. Lazer mikro ışınlama ile DNA hasarı, doğal olarak meydana gelen zarar verici ajanlara kıyasla çekirdeğin belirli bölgelerine yüksek oranda kümelenmiştir. Bu nedenle, mikro ışınlama nedeniyle kromatin yanıtı homojen olarak dağıtılmış hasara göre farklılık gösterebilir. Ek olarak, mikro ışınlama zaman alıcıdır ve sadece birkaç düzine hücre üzerinde yapılabilirken, büyük popülasyon bazlı biyokimyasal yöntemler (kromatin fraksiyonasyonu, immün önkoşulasyon, ChIP) aynı anda binlerce hücreyi inceleyerek daha fazla sağlamlık sağlayabilir. Mikro ışınlama ile yapılan gözlemlerin geleneksel biyokimyasal tekniklerle doğrulanması güvenilir sonuçlar için etkili bir stratejidir. Belirli bir FOV'daki birçok hücrenin aynı anda mikro ışınlanması mümkün olsa da, görüntüleme sisteminin görevi yerine getirmek için daha fazla zamana ihtiyacı olacaktır. Bu nedenle, DNA lezyonlarına çok hızlı bir şekilde katılan proteinlerin dinamiklerinin ölçülmesi, aynı anda kullanılan mikro ışınlama için olası ROI sayısını sınırlar. Bu protokol için kullanılan görüntüleme sisteminde, tek bir 1024 piksel uzunluğundaki yatırım getirisinin mikro ışınlanması, 1000 μs bekleme süresi kullanılarak 1032 ms ve tamamlanması için 3000 μs bekleme süresi kullanılarak 3088 ms sürer. Birden fazla ROI satırı kullanmak mikro ışınlamayı bitirmek için gereken süreyi önemli ölçüde artıracaktır (örneğin, 7 x 1024 piksel uzunluğunda yatırım getirisi, 1000 μs bekleme süresi kullanarak 14402 ms ve 3000 μs bekleme süresi kullanarak 21598 ms sürer). Bu süre görüntü alımından kaybolur ve dikkate alınmalıdır. Hızlı işe alım olaylarını görüntülerken, mümkün olan en kısa yatırım getirisini kullanın ve aynı anda yalnızca bir hücreyi mikro ışınlayın.
Senkronizasyon yöntemlerine göre avantajlar ve sınırlamalar Hücre döngüsüne özgü çalışmalar için, mevcut yöntemler ya hücrelerin belirli hücre döngüsü aşamalarına eşitlenmesini ya da hücrenin belirli hücre döngüsü aşamasını tanımlamak için floresan muhabirlerin kullanılmasını içerir. Ancak, bu yöntemlerin her biri kendi zorluklarını ve sınırlamalarını sağlar.
FUCCI sistem3 (CDT1 ve Geminin floresan protein etiketli kesilmiş formlarına dayanarak) hücre döngüsü çalışmaları için özellikle yararlı bir araçtır, ancak hücre döngüsünün S ve G2 aşamaları arasında ayrım yapma konusunda sınırlamaları vardır. Geminin seviyeleri zaten orta S fazından yüksektir ve M fazı olana kadar yüksek kalır, bu da bu aşamaların ayrılmasını zorlaştırır. FUCCI sisteminin kullanılması, İçN'yi görüntülemek için mikroskobun iki optik kanalının kullanılamayacağı anlamına da gelir.
Kanser dışı hücre hatları, serumda bulunan büyüme faktörlerinin (serum açlığı) uzaklaştırılmasıyla G0'ye senkronize edilebilir ve hücrelerde çok az DNA hasarına neden olabilir veya hiç DNA hasarına neden olmaz. Bununla birlikte, çoğu kanser hücresi hattı, ortamlarında yeterli miktarda serum olmasa bile hücre döngüsü boyunca kısmen ilerlemeye devam edecektir. Ayrıca, hücreler G1'in sonlarına, erken S aşamasına kadar senkronizasyonu kısmen kaybetmeye başlar. Serum açlığı ek olarak, hücre döngüsü senkronizasyonu elde etmek için çok sayıda kimyasal yöntem vardır. Hidroksiüre, aphidicolin ve timidin blokları, hücreleri erken S fazına senkronize etmek için DNA replikasyonunu durdurma yöntemleridir. Bu yöntemler ucuz ve basit olsa da, DNA hasarına neden olan çoğaltma stresi ortaya çıkarandır. Bu DNA replikasyon inhibitörlerinin H2A'nın fosforilasyonunun indüklendiğini göstermiştir. X, DSBs 2,29'uniyi bilinen bir işareti. S fazlı hücreler için bir işaretleyici olarak etiketli-PCNA kullanma yöntemi, kimyasal senkronizasyonun neden olduğu eserler için potansiyeli azaltır ve serum açlığına kıyasla çok çeşitli hücre hatlarına uygulanabilir.
Son DNA hasarı, mutajenik lezyonların hücrelerin kötü huylu dönüşümüne yol açabileceği genetik hastalıklar için itici bir güçtür. DNA sentez makinelerinin hedeflenmesi, kanser gibi hiperproliferatif hastalıkların tedavisinde temel bir terapötik stratejidir. Bu hastalıkları daha hedefli bir şekilde tedavi etmek için DNA lezyonlarını onaran proteinlerin daha iyi anlaşılmasına ihtiyacımız vardır. Burada açıklanan protokol, olası eserleri azaltmak ve deneylerin tekrarlanabilirliğini artırmak için geleneksel senkronizasyon yöntemlerinin sunduğu zorlukları en aza indirerek S aşamasında mikro ışınlama tabanlı çalışmalara yardımcı olur.

Hücrelerde ortaya çıkabilecek farklı DNA lezyonlarını ele almak için çeşitli DNA onarım yolları gelişti ve bunların hepsi hem uzayda hem de zamanda son derece düzenlenmiştir. Hücre döngüsünün en savunmasız dönemlerinden biri DNA sentezinin gerçekleştiği S fazıdır. Çoğalma yaşam için temel olsa da, aynı zamanda büyük bir zorluk sağlar. Hücrelerin, mutasyonların gelecek nesillere aktarılabilmesi için genomlarının sadık bir şekilde çoğaltılmasını sağlamaları gerekir. Sonuç olarak, çoğalma onkoloji alanında terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için kullanılan terapötik bir müdahale noktası sağlar.
DNA lezyonlarında protein alımını incelemek için kullanılan tüm ana tekniklerin güçlü ve sınırlamaları vardır. Mikro ışınlama, iyonlaştırıcı radyasyon kaynaklı odakların (IRIF), kromatin-immünoreipitasyonunun (ChIP) veya biyokimyasal fraksiyonasyonun immünofluoresan görüntülemesi gibi alternatif yöntemlerin çoğundan daha iyi mekansal ve zamansal çözünürlük1'e sahiptir. Bununla birlikte, mikro ışınlama, aynı anda çok sayıda hücreyi örnekleyebilen yukarıda belirtilen tekniklerin sağlamlığını sağlar.
S fazında DNA onarımını araştırmak için, zaman uyumsuz hücre kültürü popülasyonundaki S faz hücrelerini ayırt edebilmek gerekir. Bunu ele almak için, hücrelerin senkronizasyonunu veya farklı hücre döngüsü aşamalarının görselleştirilmesini içeren birçok iyi bilinen yöntem vardır. Bununla birlikte, her iki yaklaşım da önemli zorluklar ve olası eserler ortaya koyuyor. Erken S fazında hücreleri zenginleştirmek için yaygın olarak kullanılan kimyasal senkronizasyon yöntemleri (örneğin, çift timidin bloğu, afidikolin ve hidroksiüre tedavisi) replikasyon stresinin indüksiyonu ile senkronizasyon elde eder ve sonunda DNA hasarının kendisi. Bu, S faz2'dekiDNA onarım süreçlerini incelemek için bu yöntemlerin kullanımını sınırlar. Serum açlığı ve salınımı yoluyla senkronizasyon sadece sınırlı sayıda hücre hattı için geçerlidir, büyük ölçüde dönüştürülmemiş hücre hatlarına kıyasla hücre döngüsü ilerlemesi için büyüme faktörlerine daha az dayanan kanser hücre hatları hariç. Floresan Ubiquitin Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) sistemi hücre döngüsünü incelemek için özellikle yararlı bir araçtır, ancak S ve G2 hücre döngüsü aşamaları arasında ayrım yaparken temel bir sınırlamaya sahiptir3.
Burada, S fazı için invaziv olmayan bir işaretleyici olarak floresan etiketli PCNA kullanmanın, kimyasal hücre döngüsü senkronizasyon yöntemlerinin dezavantajlarını sınırlarken, FUCCI sisteminden daha fazla özgüllük ve esneklik sağladığını gösterilmiştir. Tek bir işaretleyici olarak, PCNA sadece zaman uyumsuz bir popülasyondaki S faz hücrelerini vurgulamakla kalmaz, aynı zamanda S fazı içindeki hücrelerin tam ilerlemesini de gösterebilir (yani, erken, orta veya geç S fazı)4. Eksojen, etiketli PCNA'nın düşük ekspresyon seviyeleri, hem hücre döngüsü ilerlemesi hem de DNA onarım süreçlerine minimum parazit sağlar. Daha da önemlisi, PCNA ayrıca birkaç DNA lezyonunun onarımında yer aldığı ve lokal olarak indüklenen DNA hasar bölgelerine1,4.
Burada sunulan deneyler, S aşamasında EXO1b'nin işe alım dinamiklerinin nasıl ölçüldüğini ve bunun köklü PARP inhibitörü olaparib'den nasıl etkilendiğini göstermektedir. EXO1b nükleaz aktivitesi, uyuşmazlık onarımı (MMR), nükleotid eksizyon onarımı (NER) ve çift iplikli kırılma (DSB) onarımı dahil olmak üzere çok çeşitli DNA onarım yolları ile ilgilidir. S fazında EXO1b, DNA rezeksiyonu sırasında 3' ssDNA çıkıntlarının oluşumu yoluyla homolog rekombinasyonda (İK) önemli bir rol oynar5. EXO1b, replikasyonda iplikçik yer değiştirmesi sırasında gecikmeli iplikçikte astar kaldırma ve Okazaki parça olgunlaşmasının yanı sıra durmuş DNA çatallarını yeniden başlatmak için kontrol noktası aktivasyonundaki rollerle DNA replikasyonuna daha da karışmıştır5. Hasarlı DNA bölgelerine EXO1b alımı poli (ADP-riboz) (PAR)6,7ile doğrudan etkileşim ile düzenlenir. EXO1b'nin çok sayıda hücre döngüsüne özgü etkileri nedeniyle, PCNA kullanarak S fazı spesifik işe alım çalışmaları için mükemmel bir seçimdir.

<table><tbody><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>Formaldehit</td></tr><tr><td>Anti-EXO1 Tavşan Poliklonal Antikoru</td><td>Proteintech</td><td>16253-1-AP</td><td>birincil antikoru</td></tr><tr><td>Anti-fosfo-histon H2A'yı söndürmek için. X (Ser139) Antikor, klon JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>primer antikor</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td> BrdU'yu bloke <td>etmek için BSA</td></tr><tr><td>(5-Bromo-2'-deoksiuridin)</td> <td>Merck</td><td>19-160</td><td>ön duyarlılaştırıcı ajan</td></tr><tr><td>Citifluor & trade; Mountant Çözeltisi AFR3</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>17973-10</td><td>görüntüleme için PBS çözeltisi içeren</td></tr><tr><td>antifade DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>nükleik asit lekesi</td></tr><tr><td>DMEM Orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>10569010 HEK293T hücreleri için hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Araç kontrolü ve çözünme çözücüsü</td></tr><tr><td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>EGFP-FBXL10</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp için viral ekspresyon vektörü; (pRetroQ içinde)</td><td>özel klonlama</td><td>na</td><td>EXO1b cDNA, pRetroQ-AcGFP1-N1 vektörünün NheI, BamHI bölgelerinde klonlandı.</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Medya takviyesi</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Mikroskopi için fenol kırmızı içermeyen ortam</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td>ikincil antikor</td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>Hücre hattı viral paketleme için</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>Canlı hücre görüntüleme ortamını desteklemek için tamponlama maddesi</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>ön hassaslaştırıcı ajan</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A (Değiştirilmiş) Orta Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>16600-108</td><td>U-2 OS hücreleri için hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>hücre döngüsü markörü için uygun viral olmayan PCNA yapısı</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>hücre döngüsü markörü için uygun viral olmayan PCNA yapısı</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (pBABE'de)</td> <td>özel klonlama</td><td>na</td><td>mPlum-PCNA cDNA, pBABE'nin (puro) BamHI, SalI bölgelerindeki Addgene #55994'ten klonlandı</td></tr> Nikon <tr><td>A1R-HD25 Konfokal Tarama Kafası ve Kontrol</td> Cihazı <td>Nikon</td> na <td>konfokal görüntüleme sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Nikon LUN4 lazer ünitesi</td><td>Nikon</td><td>uyarma</td><td>sistemi</td></tr><tr><td>Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP lazer ünitesi</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>FRAP lazer ünitesi</td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements Konfokal Kontrol Cihazı Yazılımı</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>Konfokal kontrol yazılımı</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Ters Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>ters epifloresan mikroskop tabanı</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-LAPP Modüler Aydınlatma Sistemi</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>aydınlatma sistemi</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (pRetroQ'da)</td> <td>özel klonlama</td><td>ve</td><td>NTHL1 cDNA, pRetroQ-mCherry-N1 vektörünün NheI, SalI bölgelerinde klonlandı.</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Odacıklı Kapak Camı (4 kuyulu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>Canlı hücre mikroskobu hücre kültürü odası</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>PARP inhibitörü</td></tr><tr><td>Opti-MEM azaltılmış serum ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Geçici transfeksiyon için seyreltme ortamı</td></tr><tr><td>Paraformaldehit sulu çözeltisi (%32)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>Fiksatif</td></tr><tr><td>pBABE (higro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>retroviral ekspresyon vektörü (düşük ekspresyon seviyeleri için)</td></tr><tr><td>pBABE (neo)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>retroviral ekspresyon vektörü (düşük ekspresyon seviyeleri için)</td></tr><tr><td>pBABE (puro)</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>retroviral ekspresyon vektörü (düşük ekspresyon seviyeleri için)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>retroviral ekspresyon vektörü (düşük ekspresyon seviyeleri için)</td></tr><tr><td>PCNA Antikoru (PC10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-56</td><td>primer antikoru</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Medya takviyesi</td></tr><tr><td>polibren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>Viral enfeksiyon verimliliğini artırın</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>retroviral ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>retroviral ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Takara</td><td>632567</td><td>retroviral ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td>632568</td><td>retroviral ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>Viral paketleme vektörü</td></tr><tr><td>Sodyum-piruvat</td><td>Canlı hücre görüntüleme ortamı için</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td> Takviyesi</tr><tr><td>Triton X-100 sulu çözelti (% 10)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>Hücre geçirgenliği tamponu için PBS'de seyreltin</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA Çözeltisi 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>Hücreleri bölmek için PBS'de seyreltin</td></tr><tr><td>U-2 OS Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; HTB-96</td><td>Mikroskopi deneyleri için optimal hücre hattı</td></tr><tr><td>Evrensel Mikoplazma Tespit Kiti</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td><td>PCR tabanlı Mikoplazma tespit kiti</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td> <td># 8454</td><td>Viral protein zarf vektörü</td></tr></tbody></table>

s aşamasında dna İşe alımını İncelemek için lazer mikro işınlama

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA hasarı onarımı, oldukça reaktif bir ortamda hücrelerin genetik bütünlüğünü korur. Hücreler, metabolik aktiviteler veya UV radyasyon gibi hem endojen hem de eksojen kaynaklar nedeniyle çeşitli DNA hasarı türleri biriktirebilir. DNA onarımı olmadan, hücrenin genetik kodu tehlikeye girer, proteinlerin yapılarını ve işlevlerini baltalar ve potansiyel olarak hastalığa neden olur. 
Çeşitli hücre döngüsü aşamalarında farklı DNA onarım yollarının mekansal dinamiklerini anlamak, DNA hasarı onarımı alanında çok önemlidir. Mevcut floresan mikroskopi teknikleri, DNA hasarı indüksiyonu sonrası farklı onarım proteinlerinin işe alım kinetiğini ölçmek için harika araçlar sağlar. Hücre döngüsünün S evresi sırasında DNA sentezi, DNA onarımı ile ilgili hücre kaderinde tuhaf bir noktadır. Tüm genomun hatalarını taramak için benzersiz bir pencere sağlar. Aynı zamanda, DNA sentez hataları, bölünmeyen hücrelerde karşılaşılmayan DNA bütünlüğü için de bir tehdit oluşturur. Bu nedenle, DNA onarım süreçleri S fazında hücre döngüsünün diğer aşamalarına göre önemli ölçüde farklılık gösterir ve bu farklılıklar yekçe anlaşılamaz. 
Aşağıdaki protokol, 405 nm lazer hattı ile donatılmış bir lazer tarama konfokal mikroskobu kullanılarak, hücre hatlarının hazırlanmasını ve yerel olarak indüklenen DNA hasar bölgelerinde S fazında DNA onarım proteinlerinin dinamiklerinin ölçüldüklerini açıklar. Etiketli PCNA (mPlum ile), S fazında DNA hasarı alımını ölçmek için acgfp etiketli bir onarım proteini (yani EXO1b) ile birlikte bir hücre döngüsü işaretleyicisi olarak kullanılır.

Hücreler, her DNA lezyon türünü, hangi hücre döngüsü evresinde olduklarına da bağlı olarak belirli bir şekilde ele haline gelir. Örneğin, mikro ışınlamadan sonra, çift iplikli kesmeler (DSB), hücre döngüsü aşamasına bağlı olarak homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya İk tarafından işlenir. Hücre döngüsünün S ve G2 aşamalarında en yoğun şekilde hareket eden nükleazlar, uygun İk için çok önemli olan DNA çıkıntları oluşturur. S fazındaki hücrelerin değerlendirilmesini teşvik etmek için PCNA tek renkli hücre döngüsü işaretleyicisi olarak kullanıldı. Şekil 1A, hücre döngüsü ilerlemesi sırasında mPlum-PCNA'nın yerelleştirme profilini gösterir. PCNA, G1 ve G2 fazında çekirdekte tamamen homojen bir dağılım vardır (aynı zamanda çoğunlukla çekirdeklerden dışlanmıştır). S fazında, PCNA çekirdekte parlak noktalar olarak görselleştirilebilen DNA replikasyon bölgelerine lokalize olur. Erken S faz hücrelerinde, lekeler nispeten küçüktür ve hücrenin çekirdeği boyunca eşit olarak dağılmıştır. Orta S fazına doğru ilerleyen lekeler bulanıklaşır ve çekirdeğin ve çekirdeğin çevresine doğru daha fazla lokalize olur. Geç S aşamasında, noktalar sayıca azalır, ancak PCNA geç çoğaltma sitelerinde yoğunlaştıkça giderek daha büyük hale gelir (Şekil 1B). Daha da önemlisi, pBABE vektör omurgasından eksojen PCNA ekspresyonu endojen seviyelerden daha azdı, ancak hücre döngüsü ilerlemesi ve DDR'deki potansiyel eserleri en aza indiren mikroskopi ile tespit için yeterliydi. Şekil 1C, PCNA aşırı ifadenin endojen seviyelere göre kapsamını göstermektedir. mPlum-PCNA'ya karşılık gelen bandın daha büyük boyutu nedeniyle daha yavaş geçiş yaptığını lütfen unutmayın.
S evresinde bu lezyonlara PARP1/2 bağımlı EXO1b alımını araştırmak için mikro ışınlama sırasında DSB'leri tanıtmayı amaçladık. Şekil 2A, düşük dozda enerjinin (1000 μs durma süresi) EGFP-FBXL10'un işe alınmasına neden olmadığını göstermektedir, bir DSB yanıtlayıcısı (FRUCC kompleksinin bileşeni 8), bir baz eksizyon onarımı (BER) yol proteini olan NTHL1-mCherry'nin işe alımını teşvik etmek için yeterliyken, oksidatif DNA hasarı bölgelerine işe alım10,11,12. 3000 μs'de, hem EGFP-FBXL10 hem de NTHL1-mCherry işe alım, hem oksidatif lezyonlar hem de DSB'ler üreten bir lazer çıkışı gösterir. PCNA, her iki lazer bekleme süresi ayarıyla da yeterince işe alım yaptığı için hem hücre döngüsü işaretleyicisi hem de başarılı mikro ışınlama için bir işaretleyici görevi görür. Daha da önemlisi, bu muhabir işlevi için hem eksojen hem de/veya endojen floresan protein etiketli PCNA benzer şekilde davranarak kullanılabilir (Şekil 3). Endojen olarak etiketlenmiş PCNA, mRuby'yi PCNA locus13'ün bir alelesine ilk ekson ile çerçeveye yerleştirerek tasarlanmıştır (hücre hattı Jörg Mansfeld'in nazik bir hediyesiydi).
Şekil 4A ve Şekil 4C, S faz hücrelerinde ACGFP etiketli EXO1b'nin işe alımını göstermektedir. EXO1b, mikro ışınlama bölgelerinde yaklaşık 1 dakika boyunca maksimum birikim seviyesine ulaşır ve daha sonra yavaşça DNA lezyonlarından ayrılmaya başlar. Mikro ışınlama alanlarındaki zenginleştirmeler, grafikte &gt; 1 göreli floresan birimi ile gösterilir. Olaparib varlığında, 1 dakikada lazer şeritte EXO1b birikimi araç kontrolüne göre önemli ölçüde daha azdır. Bu sonuçlar literatür6,7 ileuyulur. Şekil 4B, protokoldeki 6. Şekil 4D, mikro ışınlama için kullanılan hücrelerde endojen EXO1b ve eksojen EXO1b-AcGFP'nin karşılaştırılabilir ifade düzeylerini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg"> Şekil 1: PCNA'nın yerelleştirme deseni. (A) Görüntüler, U-2 işletim sistemi hücrelerindeki hücre döngüsü boyunca stably entegre, eksojen PCNA'nın lokalizasyon modelini göstermektedir. (B) Görüntüler, U-2 işletim sistemi hücrelerinde S fazının farklı aşamalarında (erken, orta ve geç) PCNA odak desenlerini gösterir. (C) Görüntüleme için kullanılan U-2 işletim sistemi hücrelerinde endojen ve eksojen PCNA seviyelerini gösteren batı lekesi. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">eder.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg"> Şekil 2: Optimize edilmiş lazer güç çıkışı ile DSB'lerin indüksiyonu. (A) Lazer ayarları farklı DNA hasarı formlarına neden olacak şekilde optimize edilebilir. Sırasıyla DSB'leri ve oksidatif lezyonların bölgelerini tanımlamak için hem EGFP-FBXL10 hem de NTHL1-mCherry'yi saptayarak ifade eden U-2 OS hücreleri kullanıldı. 405 nm lazer hattı ile mikro ışınlama, 1000 μs veya 3000 μs durma süresine sahip asenkron U-2 işletim sistemi hücrelerinde gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. (B) φH2A.X'e karşı immünofluoresan boyama, mRuby etiketli endojen PCNA'ya sahip insan retina pigment epitel hücrelerine (hTERT RPE-1) yapıldı. Hücreler mikro ışınlamadan 5 dakika sonra 1000 μs veya 3000 μs durma süresi ile sabitlendi ve işlendi. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">eder.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg"> Şekil 3: Endojen mRuby-PCNA ve eksojen mPlum-PCNA'nın 1000 μs veya 3000 μs lazer bekleme süresinde mikro ışınlama alanlarına benzer işe alımı. S fazı sırasında hem endojen hem de eksojen etiketli PCNA form replikasyon odakları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg"> Şekil 4: PARP1/2-bağımlı EXO1b S aşamasında işe alım. EXO1b-AcGFP ve mPlum-PCNA'yı saptayarak ifade eden U-2 işletim sistemi hücreleri, 3000 μs durma süresi kullanılarak 405 nm FRAP lazer hattı ile mikro ışınlandı. (A)Araç kontrolü (DMSO) veya olaparib (1 μM) ile ön işlemden sonra belirtilen zaman noktalarında mikro ışınlanmış hücrelerin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu, işe alım analizi için A,Bve C alanlarının tanımlanmış bölgelerinin 20 μm. ( B ) Temsili görüntülerini temsil eder. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. (C) DNA hasarı işe alım dinamikleri canlı hücre görüntüleme ile yakalandı. Göreceli ortalama floresan değerleri ve görüntüleri 12 dakika boyunca her 5 sn elde edildi. Her durum için ≥30 hücre değerlendirildi. Ortalama göreli floresan değerleri (düz siyah çizgiler) ve standart hata (gölgeli bir alanla görselleştirilmiş aralık) zamana göre çizildi. Kesikli çizgi, mikro ışınlamadan sonra işe alım değerlerini 1 dakikada gösterir. DMSO (n=32) ve olaparib (n=31) tedavisi arasındaki fark Mann-Whitney testi kullanılarak hesaplandı. Asterix, s&lt;0.0001'i belirtir. (D) Batı blot mikro ışınlama için kullanılan hücrelerde endojen EXO1b ve eksojen EXO1b-AcGFP ifade düzeylerini karşılaştırır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, lazer mikro ışınlama ile DNA onarım proteini alımını ölçmek gibi aşağı akış mikroskopi çalışmaları için S faz hücrelerini verimli bir şekilde tanımlamak için invaziv olmayan bir yöntemi açıklar.

S Aşamasında DNA İşe Alımını İncelemek için Lazer Mikro Işınlama

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Bu protokol, hücre döngüsü aşamasını göz önünde bulundurarak DNA hasar onarım proteinlerinin mekansal ve zamansal alımını anlamaya yardımcı olur. Hücre döngüsü ayrımcılığı için, floresan protein etiketli PCNA'yı, diğer hücre döngüsü senkronizasyon yöntemleri tarafından tanıtılan eserleri atlatan S fazının bir belirteci olarak kullanırız. Bu lazer tabanlı mikro ışınlama ile birlikte DNA hasarı onarım protein kinetiğine benzersiz spatiotemporal çözünürlük verir.Protokolümüzün rutin kullanımında başarılı olmak, temel konfokal görüntüleme bilgisine dayalıdır. Mikro ışınlamadan 24 saat önce, dört kuyulu bir kapak camına 500 mikrolitrede toplam sekize 10'a 10 mililitrelik bir ortam plakası koyun. Mikro ışınlamadan bir saat önce, normal büyüme ortamını olaparib veya DMSO gibi bir araç kontrolü içeren görüntüleme ortamıyla değiştirin.Görüntülemeden en az dört saat önce, çevre odasını ve mikroskop bileşenlerini açın. Isıtma, karbondioksit beslemesi ve nem regülatörü açık olsun. Hücreleri mikroskopa aktarmadan en az bir saat önce lazer hatlarıyla birlikte ışık kaynaklarını başlatın.Mikroskop hedefini yağlayın ve mikroskop altına odalı bir kapak camı yerleştirin. Zaman uyumsuz popülasyondaki S faz hücrelerini seçmek için, S fazında mPlum etiketli PCNA'nın benzersiz yerelleştirme deseni için okülere bakın ve mikro ışınlama için yeterli S faz hücresine sahip bir görüş alanı seçin. İkili hatlar eklemek için ilişkili yazılımı kullanarak mikro ışınlama için ilgi çekici bölgeyi ayarlayın.İstenen satır ve aralık sayısını ayarlamak için ikiliyi tıklatın, sonra istediğiniz sayıda çizgi çizmek için satır ekle, daire ve elips'i seçin, sonra yatırım getirisini tıklatarak bu ikili çizgileri uyarım ROI'lerine dönüştürün, ikiliyi yatırım getirisine taşıyın, sonra ROI'lerden herhangi birine sağ tıklayın ve uyarım ROI S1 olarak kullan'ı seçin. Bu çizgileri, hücrelerin çekirdeğinden geçecek şekilde görüş alanına yerleştirin. Mikro ışınlamadan önce, daha sonra analiz için PCNA odaklarını tanımlamak için, A1 LFOV kompakt GUI ve A1 LFOV tarama alanı pencerelerinde gerekli parametreleri ayarlayarak ve ardından yakalama düğmesine basarak görüş alanının daha yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü alın. Mikro ışınlamayı ayarlamak için ND stimülasyon sekmesini açın, ardından galvano tarayıcılarını kullanarak bir dizi uyarım öncesi görüntü ve ardından bir dizi uyarım sonrası görüntü elde etmek için zaman çizelgesi penceresine erişin.Zaman çizelgesi penceresinde üç aşama ayarlayın. Edinme ve stimülasyon sütununda, sırasıyla üç aşama için edinme, uyarılma ve edinmeyi seçin. Uyarılma aşaması için S1'i yatırım getirisi olarak ayarlayın.Galvano XY penceresinde, 405 nanometre lazer hattı için %100 lazer güç çıkışını ayarlayın ve mikro ışınlama için bekleme süresini ayarlayın. İstenen zaman aralığı ve aralıkları için timelapse görüntülemeyi ayarlamak için, A1 LFOV kompakt GUI ve A1 LFOV tarama alanı pencerelerini kullanın. A1 LFOV kompakt GUI penceresinde görüntüleme sırasında fotoğraf ağartma oranını azaltmak için lazer güç yüzdesini, kazancını ve ofset ayarlarını optimize edin.Proteinin kinetiğine bağlı olarak, zaman çizelgesi penceresinde üçüncü faz alım satırı için istenen aralığı ve süreyi ayarlayarak görüntüler arasındaki aralığı veya toplam zaman diliminin süresini uzatın veya kısaltın. Mikro ışınlamayı ve sonraki timelapse görüntülemeyi yürütmek için şimdi çalıştır'a basın. Timelapse görüntülemenin sonunda, stimülasyon ROI'lerini ayrı görüntüler olarak kaydedin, bu da analiz için kullanılan herhangi bir aşağı akış yazılımında mikro ışınlama koordinatlarını tanımlamak için yararlı olacaktır.PCNA, G1 ve G2 fazlarında çekirdekte tamamen homojen bir dağılıma sahiptir. S fazında, PCNA çekirdekte parlak noktalar olarak görselleştirilebilen DNA replikasyon bölgelerine lokalize olur. Erken S faz hücrelerinde, lekeler nispeten küçüktür ve hücrenin çekirdeği boyunca eşit olarak dağılmıştır.Orta S fazına ilerlerken, lekeler bulanıklaşır ve çekirdeğin ve çekirdeğin çevresine doğru daha fazla lokalize olur. Geç S aşamasında, noktalar sayıca azalır, ancak PCNA geç çoğaltma sitelerinde yoğunlaştıkça giderek daha büyük hale gelir. 1.000 mikrosaniyelik yükseklik süresi gibi düşük dozlarda enerji, çift iplikli bir mola müdahalecisi olan EGFP-FBXL10'un işe alınmasına neden olmaz, ancak oksidatif DNA hasarı bölgelerine alınan bir baz eksizyon onarım yolu proteini olan NTHL1-mCherry'nin işe alımını teşvik etmek için yeterlidir.3.000 mikrosaniyelik bir sürede, hem EGFP-FBXL10 hem de NTHL1-mCherry işe alınarak hem oksidatif lezyonlar hem de çift iplikli kırılmalar üreten bir lazer çıkışı gösterilmiştir. EXO1b yaklaşık bir dakika içinde maksimum birikim ve mikro ışınlama bölgesi seviyesine ulaşır ve daha sonra yavaşça DNA lezyonlarından ayrılmaya başlar. Olaparib varlığında, bir dakikada lazer şeritte EXO1b birikimi araç kontrolüne kıyasla önemli ölçüde daha azdır.Mikroskobun ısınması için geniş bir zaman verilmesi ve tutarlı sonuçlar elde etmek için kültür ve koşulların her deney için en uygun olması çok önemlidir. Ayrıca, belirli DNA lezyonlarını test etmek için lazer ayarlarınızı farklı DNA hasarı muhabirleri ile optimize etmek önemlidir. Mikro ışınlamayı takiben, sonuçları fraksiyonasyon, immün önseçim veya ChIP gibi klasik biyokimyasal yöntemlerle doğrulamayı düşünün.Bu yaklaşımlar daha büyük bir hücre popülasyonu örnekle, böylece istatistiksel güç sağlar.

laser-micro-irradiation-to-study-dna-recruitment-during-s-phase

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Edimsel koşullanma paradigması kullanarak rasgele nokta kinematograms ve bilgisayar tarafından oluşturulan omurgasızlar video oynatma kullanan bir kertenkele görsel duyarlılık testi.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Ayrıntılı bir protokol görüntüleme için DNA onarım komplekslerin gerçek zamanlı oluşumu...

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile...

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Öğrenin, S fazında lazer mikro ışınlama ile DNA onarım proteinlerinin işe alım dinamiklerini canlı hücrelerde nasıl analiz edeceğinizi. PCNA işaretleyicisi ve konfokal mikroskopi kullanarak yüksek çözünürlüklü kinetik veriler elde edin.

S Aşamasında DNA İşe Alımını İncelemek için Lazer Mikro Işınlama

Daha fazla video keşfet