Ağız Boşluğundan Simbiyotik Sakkarakterinin Kararlı İkili Kültürlerinin Kurulması

Sakkaribakteri, uygun konak bakterilerle ortak kültür gerektiren zorunlu parazitlerdir. İnsan oral sakkaribacteria bilinen konak bakteri türleri kullanılarak çoğu birey için kolayca izole edilebilir gibi. Bu protokol, herhangi bir araştırmacının veya laboratuvarın ikili ortak kültürde kendi suşlarını izole etmesine izin verecektir.

Bu teknik, çoğu mikrobiyolojik laboratuvarda bulunan basit cihazları ve ekipmanları kullanır ve altı sakkaribacteria türünü temsil eden 30'dan fazla izolat kültürü için başarıyla kullanılmıştır. Bu protokol, aday takip edilen diğer radyasyon türlerinin izolasyonu için yararlı olabilir, ayrıca uygun akrebakteri konakçılarının tespit edilip izole edilebilmesi durumunda farklı ortamlardan ve diğer memelilerden sakkaripacteria. Prosedürü gösteren andrew Collins olacak, laboratuvarımda doktora sonrası eski bir adam.

Başlamak için, araknia propionica gibi konak bakteri kültürlerine başlayın ve erken sabit faza büyümeleri için yeterli zaman vardır. Kültürü başlatmak için, araknia propionica ile% 0.1 maya özü içeren iki ila beş mililitre triptik soya suyu aşılayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ardından, filtre tutucuları palet kazınmış 0,2 mikrometre filtre membranları ile monte edin.

Bunları folyoya sarın ve santrifüj tüpleri ve kapak montajları ile birlikte otomatik olarak sterilize edin. Steril olmayan yüzeylerle yanlışlıkla temas halinde ekstra malzemeleri sterilize edin. Diş eti hattı boyunca kazıyarak, steril bir kağıt noktası, zarif bir curette veya steril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak diş plağını toplayın ve MRD veya PBS gibi uygun bir tampona aktarın.

Daha fazla ilerlemeye hazır olana kadar numuneyi buzda tutun. Diş plağını küçük bir pipet ucu ile girdap ve pipetleme kombinasyonunu kullanarak güçlü bir şekilde yeniden depolayın, ardından yeniden sulandırılmış plak örneğini dokuz mililitre MRD tamponu içeren bir tüpe ekleyin. Aseptik teknik kullanarak steril bir filtre tertibatı dikkatlice çözün.

Çeyrek dönüşü açın ve dişlerin düzgün bir şekilde takıldığından ve cihazın düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olmak için filtre tutucuyu yeniden sıkın. Bir şırınna kullanarak aparattan 10 mililitre MRD tamponu geçirerek zarı yıkayın. Numuneyi yıkanmış filtreye uygulamak için pistonu bir şırınnadan çıkarın ve filtre cihazına takın.

Filtratı yakalamak için bu filtre cihazının altına steril bir santrifüj tüpü yerleştirin, ardından dağınık diş örneğini şırınna dökün ve filtreye yükleyin. Ardından numuneyi filtreden geçirmek için pistona hafif basınç uygulayın. Membranı 10 mililitre daha MRD tamponu ile yıkayın ve akışı filtrelenmiş numuneyle aynı tüpte toplayın.

Sonra tüpü aseptik olarak kaplayın ve buzda tutun. Santrifüjlemeden sonra hücre peletinin yerini belirlemek için tüp ve kapakta bir yönlendirme işareti yapın. Tüpü üst taraftaki işaretle yüksek hızlı bir santrifüje yerleştirin ve numuneleri dört santigrat derecede bir saat boyunca 60.000 G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, peletı tüpün üst tarafında tutarak süpernatantı dikkatlice dökün. Daha sonra peletı güçlü bir şekilde girdaplayarak bir ila iki mililitre MRD tamponunda yeniden depolar. Tüplere iki mililitre uygun büyüme ortamı alarak kültür tüpleri hazırlayın.

Ardından, konak organizmaların 200 mikrolitre geceleme kültürünü ve her tüpe 100 ila 200 mikrolitre yeniden tasarlanmış filtrelenmiş numune ekleyin. Kombine numuneleri konak organizmaya uygun koşullar altında kuluçkaya yatırın. İkili kültürün 200 mikrolitresini yeni bir tüpte iki mililitre taze büyüme ortamına aktararak hücreleri her iki ila üç günde bir aktarın.

Geçişli kültürler enfekte olmayan konak kültürünün 200 mikrolitresinde büyüme göstermiyorsa, hücreleri geçirirken aşılanmış tüpleri inkübatöre geri döndürün. PCR master'ın 24 mikrolitresi 0,2 mililitre PCR tüpüne karışır. Sakkaribacteria enfekte kültürünün bir mikroliterinde, tüpü bir Termo çevrimciye yerleştirin.

PCR programını metin taslağında açıklandığı gibi ayarlayın. PCR ürünlerini %1 Agros jel üzerine yükleyin ve çalıştırın. Yaklaşık 600 bazlık bir bant sakkaribacteria varlığını doğrulayacaktır.

Pozitif kültürlerin saflığını doğrulamak için, steril bir tamponda sakkaripacteria ortak kültürünün 10 kat seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve bir agar plakasına 100 mikrolitre yayın. Kültürü uygun büyüme koşulları altında kuluçkaya yatırın ve kirletici organizmalar için gözlemleyin. Yaklaşık 600 bazlık bir bant sakkaribacteria varlığını doğrulayacaktır.

PCR tespiti, sakkaribakteri sisyonlarının az sayıda olduğu için ilk enfeksiyon kültürlerinde negatif görünebilir. Bununla birlikte, birkaç pasajdan sonra, istikrarlı bir enfeksiyonun meydana geldiğini gösteren güçlü bir PCR ürünü görünmelidir. Aynı sakkaribacteria filtratı ile birkaç konak türü test etmek genellikle düşük bir başarı oranına sahip olacaktır.

Symbiont konak etkileşimi çok spesifik olduğu için. Enfekte kültürler büyüdükçe, normal bulanık büyüme ortaya çıkmalıdır. Simbiyoz kendini kurdukça, enfekte kültürler enfekte olmayan konak organizmaların kültürlerinden daha az bulanık görünecektir.

Kontamine bir kültür, kaplamadan sonra enfekte koloniler seçerek saflaştırılabilir. Enfekte koloniler bazen enfekte olmayan kolonilere kıyasla düzensiz bir koloni şekli ile tanımlanabilir. Düzenli bir koloninin oranı, ikili kültürdeki sakkaribacteria titreye bağlıdır.

Titre düşükse, daha az koloni düzensiz görünecektir, bu da enfekte kolonileri seçmeyi ve saf bir ikili kültür başlatmayı kolaylaştırır. Kültürler birkaç pasaj için olumlu görünmeyebilir. Bu yüzden bazı hastalara ihtiyaç duyulacaktır.

Ayrıca, kültürün dengesini bozabileceğinden ve sakkaripterinin ölümüne yol açabileceğinden, ikili kültürlerin kirlenmesini düzenli olarak kontrol etmek gerekir. İkili kültür her türlü laboratuvar deneyi için kullanılabilir. Genom dizilimi ve transkriptom analizi için sırasıyla DNA ve RNA çıkarılabilir.

Patojenite hayvan modelleri kullanılarak da araştırılabilir.