Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

Bilgimize göre, bu, analiz başına iki sonucu aynı anda ölçmek için iki muhabir sinyali kullanan boncuk tabanlı çoklama protokolünün ilk örneğidir. Bu teknik, kullanıcının antijene özgü IgM ve IgG'yi aynı anda ölçmesini sağlar, daha az örnek ve sonuç için daha kısa bir süre. Bu çift muhabir yöntemi antikor izotiripleme için özel olsa da, çeviri sonrası değişiklikler veya serbest ve bağlı ilaç formları gibi diğer analit çiftlerini ölçmek için uyarlanabilir.

Bugün prosedürümüzü gösteriyoruz, Luminex Şirketi'nin kıdemli saha uygulama bilimcisi Dr. Steve Angeloni. Çift muhabir IgG ve IgM serolojik testine başlamak için, bireysel çift boncuktan gerekli çoklayıcı boncuk karışımlarını hazırlayın ve boncuk stoklarını mililitre başına altı boncuk başına bir kez 10 kez konsantrasyonda kontrol edin. Daha sonra, 990 mikrolitre PBS-TBN tampona 10 mikrolitre serum ekleyerek serum örneklerini 100 kat seyreltin, ardından 1:100 seyreltmenin 20 mikrolitresini 180 mikrolitre PBS-TBN'ye ekleyerek örnekleri on kat daha seyreltin.

Boncuk karışımları ve serum örnekleri hazır olduğunda, 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakasının atanmış kuyularına çok katlı boncuk karışımlarından 50 mikrolitre ekleyin, ardından seyreltilmiş serum örneklerinin 50 mikrolitresini uygun kuyulara ekleyin. Tüm numuneler eklendikten sonra, plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın. Daha sonra, plakayı iki dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcıya yerleştirerek boncukları reaksiyon karışımından ayırın.

Plakayı mıknatıs üzerinde tutarak folyo contayı çıkarın. Daha sonra plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, plakayı emici kağıda damlatın.

Reaksiyon kuyularını yıkamak için plakayı plaka mıknatısından çıkarın ve her kuyuya 150 mikrolitre PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve iki dakika daha plaka mıknatısı üzerine yerleştirmeden önce ısıtılmış çalkalayıcı üzerinde iki dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, süpernatantı atmak için plakayı ters çevirin ve plakayı emici kağıda damlatın.

İkinci PBS-TBN yıkamadan sonra, plakayı mıknatıstan çıkarın ve her kuyuya 100 mikrolitre taze Algılama Reaktif karışımı ekleyin. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile kapledikten sonra, 15 dakika ısıtılmış bir plaka çalkalayıcıya ve ardından iki dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcıya yerleştirin. Plaka mıknatıs üzerindeyken, plakayı bir atık kabının üzerine ters çevirerek ve emici kağıda şişirerek Algılama Reaktif karışımını atın.

Reaksiyon kuyularını PBS-TBN ile daha önce gösterildiğinden iki kez yıkayın, ardından plakayı mıknatıstan çıkarın. Her kuyuya 100 mikrolitre PBS-TBN ekleyin, ardından plakayı folyo conta ile örtün ve 37 santigrat derecede iki dakika sallayın. Folyo contayı çıkarın ve akış analizöründeki her kuyudan numunenin 50 mikrolitresini okumaya devam edin.

Plakayı okumak için sol üst köşedeki açılır menüyü seçin, Plaka Yapılandırması'na gidin, önceden yapılandırılmış plakayı yükleyin ve Plakayı Çalıştır'ı seçin. Çıkar simgesini seçerek plaka taşıyıcısını çıkarın, ardından plakayı plaka taşıyıcısına yükleyin ve plaka taşıyıcısını geri çekmek için Geri Çek simgesini seçin. Plaka taşıyıcısı analizöre uzadıktan sonra, plakayı okumaya başlamak için Çalıştır simgesini seçin.

Çift muhabir nötralizasyon tahlilleri için, 96 kuyulu bir mikrotiter plakasının atanmış kuyularına çok katlı boncuk karışımlarının 50 mikrolitresini ekleyin, ardından her kuyuya mililitre ACE2 başına iki mikrogramdan 25 mikrolitre ekleyin ve plakayı bir folyo conta ile kaplayın. Isıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde iki dakikalık bir inkübasyonun ardından, atanan kuyulara 25 mikrolitre 1:500 serum seyreltme ekleyin. Tüm örnekler eklendikten sonra, serolojik test için daha önce gösterildiği gibi inkübasyon, yıkama, algılama ve analiz adımlarını gerçekleştirin.

Semptom başlangıcından itibaren beş ila 60 gün içinde serum örnekleri kullanılarak DyLight 405 muhabir boyasına konjuge edilen bir anti-IgM testi ve bir IgG şerit serum örneği spike antijeni için yüksek bir sinyal üretmedi. IgM orta floresan yoğunluğu yüksek olan numunelerde reseptör bağlama alanı ve nükleokapsid antijenler için en yüksek sinyaller görülmüştür. Bazı örneklerde IgM titresinin yükselmesi gerekirken, gözlenen orta floresan yoğunluk seviyeleri 140 MFI ünitesini geçmedi.

Ayrıca, IgM için kontrol boncuk, aynı konsantrasyonda anti-IgM etiketli bir fikoerythrin ile karşılaştırıldığında, anti-IgM'ye konjuge edilmiş DyLight 405 kullanırken ortanca floresan yoğunluğu için önemli bir dinamik aralıktan yoksundu. IgG tespiti için, parlak menekşe konjugesi, florore Super Bright 436'nın streptavidin konjugesinden daha yüksek ortanca floresan yoğunluk sinyallerine sahipti. Bununla birlikte, parlak menekşe konjugesinin sinyal yoğunluğu ACE2 titrasyonlarında farklılık gösterdi.

ACE2 konsantrasyonlarında parlak menekşe konjugesi tarafından yapılan bu sinyal dalgalanması, IgG titreleri aralığında ACE2'nin yüzde inhibisyonunu belirlemeye de müdahale etti. IgM algılaması için, fitoerythrin anti-IgM, DyLight 549 anti-insan IgM tarafından üretilenlerden daha yüksek sinyaller gösterdi. IgM bağlamasının yüzde 12 inhibisyonu belirlenirken, iki IgM algılama reaktifi arasında hafif ama önemsiz bir fark vardı.

Bu nedenle prosedürdeki en önemli adımlardan biri, multipleks boncuk karışımınızı bireysel boncuk stoklarınızdan hazırlamak ve bunu doğru yaptığınızdan emin olmaktır. Bu nedenle bu prosedür, aşıların etkinliğini ölçmek ve diğer patojenlere karşı bağışıklık tepkilerini izlemek için de kullanılabilir.