HiBiT Tabanlı Bir Biyoreporter Kullanılarak SARS-CoV-2 Reseptör Bağlayıcı Etki Alanı Antikorunun Tespiti

Laboratuvarım COVID-19 araştırmalarında çalışıyor ve yakın zamanda SARS-CoV-2 antikorlarını hızlı ve doğru bir şekilde tespit etmemizi sağlayan yeni bir test geliştirdik. Bu protokol, mevcut pandemi göz önüne alındığında kritik öneme sahip olan hasta serum örneklerinde anti-SARS-CoV-2 antikorlarının tespiti için yüksek verim testini özetlemektedir. Mevcut serolojik testlerin çoğu hassasiyet için hızı feda eder veya tam tersi.

Verilerimiz, testimizin hem hassas olduğunu hem de hızlı bir yanıt süresine sahip olduğunu göstermektedir. Yeterli miktarda yüksek HiBiT-RBD biyoreporter üretmek için hücre kültürüne hazırlanarak başlayın. İlk olarak, Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin ve streptomisin içeren modifiye kartal ortamını hazırlayın.

Sonra medyayı 37 santigrat derecelik bir su banyosunda ısıtın. Biyolojik güvenlik kabinini açın ve kabin yüzeyini sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Hücre hattını kültüre etmek için eksi 80 santigrat dereceden veya sıvı azottan çıkarıp 37 santigrat derecelik bir su banyosunda çözün.

Çözülmüş hücreleri en az 10 mililitre tam orta ile karıştırın. Hücre süspansiyonunu 15 santimetrelik bir Petri kabına pipetlayın ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı döndürün. Yemeği 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %85 ila %95 nemde bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Yüksek izdiahta konfluens seviyesi % 80 ila 90'a ulaşana kadar mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin, ortamı çıkarın, hücreleri ılık PBS ile yıkayın ve hücreleri yüzeyden ayırmak için% 0.25 tripsin-EDTA'nın üç ila beş mililitresini ekleyin. Yaklaşık beş dakika sonra, mikroskop altındaki hücrelere bakın. Tüm hücreler yüzüyorsa, en az dört mililitre orta ekleyin ve hücre süspansiyonu yeni bir steril tüpe aktarın.

Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve transfeksiyon için altı kuyulu bir plakanın her kuyusuna bir milyon hücre ekleyin. HiBiT-RBD plazmidinin transfeksiyonunu gerçekleştirmek için, uygun bir transfeksiyon reaktifi ile HiBiT-RBD ekspresyon plazmidinin bir mikrogramını kullanın. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yaslayın, ardından plakanın her kuyusuna damla yönünde toplam hacmi ekleyin.

Ertesi gün, transfeksiyon karışımını içeren ortamı tam ortamla değiştirin. Transfeksiyondan 48 saat sonra transfeksiyon kontrolünü iyi gözlemleyin. Süpernatant 1,5 mililitre mikrotüpte toplayın.

Hücrelere 500 mikrolitre 1X pasif liziz tamponu veya PLB ekleyin, ardından hücre lizisi için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tabağı kuluçkaya yatırın ve sallayın. Daha sonra, bir luciferaz tahlil kullanarak biyo-raporlayıcıdan gelen lüminesans sinyalini değerlendirmek için, önce reaksiyon bileşenlerini hazırlayın ve süpernatantı biyo-raporlayıcının kaynağı olarak kullanın. Kullanmadan önce büyük BiT'yi seyreltin ve 1X'e kadar substratı seyreltin.

Süpernatantın 50 mikrolitresini her kuyudan veya tüpten 96 kuyulu bir tabağa aktarın ve her kuyuya 50 mikrolitre 1X büyük BiT ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yaslanın. Luminometre yazılımını açın, her kuyuya 50 mikrolitre 1X substrat ekleyin, plakayı luminometreye yerleştirin ve yazılımı çalıştırın.

HiBiT-RBD antikor tespit testini gerçekleştirmek için, hibit-RBD biyoreporterini daha önce açıklandığı gibi hazırlayın ve süpernatant içeren HiBiT-RBD'nin 50 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir mikrotubeda ticari SARS-CoV-2 RBD antikorunun bir mikrogramı ile birleştirin. Çözeltiye 20 mikrolitre immünoglobulin bağlayıcı protein veya Protein G ekleyin. PBS ekleyerek toplam hacmi 300 mikrolitreye getirin.

Tüpleri bir tüp çalkalayıcı veya rotator üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. 30 saniyeliğine 12.000 G'de santrifüj. Ardından üstnatant atın ve PBS ile yıkayın.

Ücretsiz HiBiT-RBD'yi kaldırmak için işlemi üç kez tekrarlayın. Hücreleri 50 mikrolitre PBS'de yeniden biriktirin ve 96 kuyu plakasına aktarın. 50 mikrolitre 1X büyük BiT ekleyin ve beş dakika bekleyin.

Daha sonra 50 mikrolitre 1X NanoLuc substrat ekleyin. Luminscence sinyalini hemen bir luminometre ile okuyun. Yüksek verim tahlilleri için daha büyük miktarlarda HiBiT-RBD biyo-raporlayıcı hazırlayın ve her örnek için 96 kuyulu bir plakanın her kuyusunda 20 mikrolitre manyetik Protein G ile HiBiT-RBD süpernatantının 50 mikrolitresini birleştirin.

Her kuyuya serum örneğinden 10 mikrolitre ekleyin ve PBS ekleyerek toplam hacmi 150 mikrolitreye getirin. Oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 30 dakika kuluçkaya yatır. Daha sonra protein G antikor kompleksini çökeltmek için plakayı manyetik bir yıkayıcıya yerleştirin.

Çözeltiyi her kuyunun orta bölümüne atın ve yıkama için PBS ekleyin. Fazla HiBiT-RBD'yi çıkarmak için yıkama adımını en az üç kez tekrarlayın. 50 mikrolitre 1X PBS ve 50 mikrolitre 1X büyük BiT ekleyin ve oda sıcaklığında en az beş dakika kuluçkaya yatırın.

Armatürer yazılımını hazırlayın. Daha sonra 50 mikrolitre 1X substrat ekleyin. Plakayı makineye yerleştirin, yazılımı çalıştırın ve sinyalleri kaydedin.

Serum örneklerinden gelen sinyalleri, kontrol örneklerini ve boş kuyulardan gelen arka plan sinyallerini karşılaştırın. Hem hücre lisatını içeren HiBiT-RBD'den hem de transfected hücrelerin süpernatantından gelen sinyaller, uygun protein kaynağını değerlendirmek için kaydedildi. Veriler, her iki parça birleştirildiğinde güçlü bir sinyale kıyasla düşük arka plan gösterdi.

Protein G ilavesi antikor çökeltmelerine yardımcı olur. Test, ticari bir SARS-CoV-2 nötralize edici antikorun sinyalini kontrol igg ile karşılaştırmak için kullanıldı. Spesifik antikor sinyali sağlamken, kontrol antikorları parlak arka plan seviyesine yakındı.

Fareleri aşılamak için eksojen RBD'yi ifade eden M proteininin 51 pozisyonunda mutasyona sahip rekombinant zayıflatılmış onkolitik veziküler stomatit virüsü veya VSV kullanıldı. Aşılanmış farelerden toplanan serum, kontrol VSV ile enjekte edilen farelerde sinyal olmamasına kıyasla sağlam bir sinyal üretti. Bu protokol hasta serum örneklerinde SARS-CoV-2 antikorlarının tespiti için kullanılabilir.

Protein G ile inkübasyonu takip eden yıkama adımları arka planı azaltmak için kritik öneme sahiptir. Buna ek olarak, sinyal kaybını önlemek için substratı mümkün olduğunca çabuk eklemek önemlidir. Birkaç ek optimizasyon adımı ile aynı test kan örneklerini analiz etmek için kullanılabilir ve hasta kan örneklerinde anti-SARS-CoV-2 antikorlarının belirlenmesinde etkili bir yöntem olabilir.