Kızılötesi Lazer Destekli Mikropatterning ile Hücre Geometrisinin Kontrolü
10 Temmuz 2021
Burada sunulan protokol, memeli hücrelerindeki sitoskeletal yapıları incelemek için hücre şeklini standartlaştıran mikropatternlerin otomatik olarak üretilmesini sağlar. Bu kullanıcı dostu teknik, piyasada bulunan görüntüleme sistemleri ile kurulabilir ve standart hücre biyolojisi laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipman gerektirmez.
Mikropatterning, hücre şekli ve hücreler arası makinelerin aktivitesi arasındaki bağlantıları anlamak için bilim adamları tarafından kullanılan güçlü bir tekniktir. Çeşitli teknikler araştırmacıların hücre şeklini modüle etmesine izin verse de, bu teknikler genellikle bazı biyoloji laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipmanlar gerektirir. Bu video, piyasada bulunan çok sesli görüntüleme sisteminde mikropatterning'i otomatikleştirmek için gereken adımlarda size rehberlik edecektir.
Bu protokolün bir avantajı, özel ekipman kullanımından kaçınmasıdır. Desenler, genellikle mikropatterning'de en çok zaman alan işlem olan foto maskeleri yeniden yorumlamadan kolayca değiştirilebilir. Görüntü işleme aracımız, proteinlerin tarafsız ve otomatik bir şekilde temsili dağılımını yansıtan ortalama hücre görüntüleri oluşturur.
Deneylerimizde coverlips kullanmamıza rağmen, otomatik iş akışı slaytlar ve cam tabanlı yemekler üzerinde desen yapmanıza da olanak tanır. Sistemin otomatik bir şekilde görüntülenerek doğru odak düzlemini ve desenini tanımlaması için uygun mikroskop kurulumu kritik olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir. PVA çözümünü belirtildiği gibi hazırlayın.
Sekiz parça PVA'ya bir bölüm HCL ekleyin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez dikkatlice ters çevirin. Çözeltinin iki mililitresini küçük bir Petri kabına dökün ve sıvıya temiz bir ön işlemeli kapak batırın.
Oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda beş dakika kuluçkaya yatır. Kapak kapağını çözeltiden dikkatlice çıkarın. Ceketi 40 saniye döndürmek için kapak döndürücü spinner kullanın.
Bu arada, cımbızları temizle. Kapak kapağını bir kutuya aktarın ve gece boyunca dört derecede kurutun. Mikroskop yazılımını açın.
İlk olarak, lazer hattını 750 nanometreye ayarlayın. Ardından Image adlı yeni bir optik yapılandırma ayarlayın. Bu, kapak çizgisini yansıtıcılar aracılığıyla görüntüleyenemizi sağlayan temel optik yapılandırmadır.
Diğer seçenekleri varsayılan olarak bırakın ve uygun hedefi seçin. Bu optik yapılandırma altında donanım ayarlarını yapılandırın. Kızılötesi lazeri stimülasyon lazerimiz olarak ayarlayın.
Görüntüleme için IR lazeri kullanmak için ışın ayırıcıyı ışık yoluna yerleştirin. Galvano tarayıcı birimini ve uygun D tarama dedektörünü seçin. Kapak üzerindeki küçük özellikleri yakalamak için yeterli olan bir tarama boyutu ve çalışma süresi seçin.
IR Lazer Kullan kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Kapak tabanı yüzeyinin parlak, ancak doygun olmayan bir görüntüsünü elde etmek için alım lazer gücünü ve dedektör hassasiyetini ayarlayın. Tarama alanı penceresinde, tüm görüş alanını yakalamak için yakınlaştırmayı bire ayarlayın.
Optik yapılandırmayı kaydedin. Şimdi mikroskobun odaklanmasını, yatırım getirisi maskesini yüklemesini ve otomatik bir şekilde desenler üretmesini sağlayacak bir dizi optik yapılandırma kuracağız. İlk optik yapılandırma, mevcut görüş alanına otomatik odaklanmak için kullanılan güven verici bir işaretleyici yazdırmamızı sağlar.
Görüntü optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Güven verici işaretleyiciyi yazdırın. Bu adımda yazdırdığımız için, ışın ayırıcıyı ışık yolundan dışarı taşıyın ve uygun bir dikroik ayna ile değiştirin. Zaman kazanmak için en küçük tarama boyutunu seçin.
Bu adımda görüntülemeye gerek olmadığından dedektör hassasiyetini sıfır olarak ayarlayın. Yazdırmayı etkinleştirmek için lazer gücünü artırın. Tarama alanı penceresinde yakınlaştırmayı maksimum olarak ayarlayın ve tarama alanını görüş alanının ortasına yerleştirin.
Şimdi PVA yüzeyindeki düzensizliği hesaba katmak için bir Z-stack deneyi kuracağız. Z konumundaki hareketi göreli olarak ayarlayın. Uygun Z cihazını seçin.
Ardından, görüntü optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Otomatik odaklama. En küçük tarama boyutunu seçin ve tarama alanı penceresindeki yakınlaştırma faktörünü azaltın, böylece görüş alanı güven verici işaretçiden biraz daha büyüktür. Bu, kapak kapağındaki diğer küçük özelliklerin otomatik odaklamayı engellememesini sağlar.
Aygıtlar menüsünde Otomatik Odaklama kurulumu'nu seçin. Z yığını denemesinde tarama kalınlığını buna ayarlayın. Mikroskop bu aralığı tarayacak ve güven verici işaretleyiciyi kullanarak en iyi odak düzlemini bulacaktır.
Ardından, görüntü optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Yatırım Getirisini Yükle. Maske bu optik yapılandırmayla çekilen bir görüntüye yüklendiğinden, tarama boyutunu yatırım getirisi maskesininkiyle aynı şekilde ayarlayın. Çözünürlük ve hız arasında optimum dengeyi sağlamak için 2048 piksel kullandık.
Şimdi kapak tonlarını desenlamak için kullanılan optik konfigürasyonu kuracağız. Baskı güven verici işaretleyici optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Micropattern. Yakınlaştırma faktörünü bir olarak ayarlayın.
PVA'yı alevlendirmek için stimülasyon lazer gücünü artırın. Uygun bir tarama hızı seçin. ND stimülasyon penceresinde, bir ND stimülasyon deneyi ayarlayın.
Zaman çizelgesine birkaç aşama ekleyin ve her biri stimülasyonda ayarlayın. Stimülasyon alanının ve süresinin doğru olduğundan emin olun. Aynı pencerede, her aşamadan önce sahne taşı ana Z işlevini etkinleştirin.
Bu yine Z yönünde herhangi bir sapmayı hesaba hazırlar. Son olarak, kapak kapağında desenleri bulmamıza yardımcı olabilecek görünür bir etiket yapmak için bir optik yapılandırma ayarlayın. Yazdırma güven verici işaretçisi çoğaltın ve yeniden adlandırın, Etiket yüzeyi.
Lazer gücünü önemli ölçüde artırın ve yakınlaştırmayı bire ayarlayın. PVA kaplı kapak kapağını bir tutucuya aktarın. Dik bir mikroskop için PVA yüzeyinin aşağı bakan olduğundan emin olun.
Kapak boruyu stabilize etmek için köşelere su ekleyin. Tutucuyu mikroskop aşamasına monte edin. Hedefi düşür ve aralara su ekleyin.
Mikroskop yazılımında, IR lazer deklanşöre açın ve desenlemeden önce otomatik hizalama gerçekleştirin. Görüntü optik yapılandırmasına geçin. Hedefi yavaşça kapak kılıfı ile yaklaştırırken görüş alanını tarayın.
İlk başta, görüntü son derece soluk görünecektir. Görüntü parlaklığı biraz artana kadar hedefi kapak kılıfı yakınlaştırın. Bu, hedefe bakan kapaklı yüzeydir.
Parlaklık azalana ve tekrar artana kadar hedefi hareket ettirmeye devam edin. Bu, modelleyeceğiz PVA yüzeyi. Kapak kusurları veya toz gibi herhangi bir küçük özelliğe odaklanın ve Z sürücüsünde sıfır ayarlayın.
Etiket yüzeyi optik yapılandırmasına geçin. Yakala'ya tıklayın. Görüntüleme ve taramaya geri dönün.
Cam hasarı etiketin başarıyla basıldığını gösterir. Cam parçacıklarını önlemek için sahne alanını bir ila iki görüş alanına taşıyın. Onaylamak için tarayın.
Aygıtlar menüsünde sahne alanı hareketi makrosunu açın. M ve N değişkenlerini desenlenecek istenen görünüm alanı sayısına ayarlayın. Makroyu kaydedin ve çalıştırın.
Desenleme tamamlandıktan sonra görüntü optik yapılandırmasına geçin ve desenleri tarayın. Her görüş alanındaki desen adaları net sınırlara sahip olmalı ve ışığı eşit olarak yansıtmalıdır. Daha koyu ve düzensiz görünen desenler eksik PVA kaldırmayı önerir.
Bunun nedeni genellikle yetersiz lazer gücü veya yanlış odak düzlemidir. Lazer gücü çok yüksek ayarlanmışsa, PVA'nın kabarcık yapmasına da neden olabilir. Hücreleri kapak örtülerine kapaktan sonra, hücreler yayılmalı ve desenin şeklini almalıdır.
Bu, yaylı tüfek deseni üzerine kaplanlanmış bir insan fibroblastının immünoresans görüntüsüdür. Hücre, aktiin bakımından zengin bir lamellipodia jantı görüntüler. İki tarafı kalın, ventral stres lifleri ve enine yaylarla birbirine bağlanmış sırt stres lifleri.
Miyozin ışık zinciri yoğun lamellipodia jantının arkasına oturdu ve aksin demetleri boyunca çizgili bir desen sergiledi. Özel görüntü işleme aracımızı kullanarak, ilgi çekici proteinlerimizin ortalama bir görüntüsünü oluşturduk. Bu görüntü, yukarıda açıklanan aksin yapılarının çok sayıda desende tutarlı olduğunu gösterir.
Ortalamadan sonra miyozin bireysel yapılarını kaybetmemize rağmen, aksin demetleri boyunca lokalizasyon korunur. Bu videoyu izledikten sonra, en az manuel çalışma ile piyasada bulunan bir multifotoğraf sistemi kullanarak bir mikro desenleme iş akışı kurabilmelisiniz. Tamamlanmamış desenler oluşturmaktan kaçınmak için lazer gücünü kendi sisteminiz için optimize etmek önemlidir veya otomatik odaklama ve mikropatterning adımlarındaki parametreleri ayarlayarak PVA Maksimum verimlilik elde edilebilir.
Hücre morfolojisini içeren hücresel yolların araştırılmasının yanı sıra, bu teknik ilaç taramasına ve hücre şeklindeki varyasyonlara duyarlı diğer uygulamalara da uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, memeli hücrelerinde sitoiskelet yapılarının incelenmesi için hücre şeklinin standartlaştırılmasına olanak tanıyan mikro desenlerin otomatik üretimini sağlar. Kullanıcı dostu olup ticari olarak temin edilebilen görüntüleme sistemleri ile uyumludur ve özel ekipman ihtiyacını ortadan kaldırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Sitoiskelet Araştırması
- Mikrodesen Teknikleri
Arka Plan
- Mikrodesen, hücre şekli ve hücresel mekanizmalar arasındaki ilişkiyi anlamaya yardımcı olur.
- Mevcut birçok teknik özel ekipman gerektirir ve erişilebilirliği sınırlar.
- Bu protokol, fotomask yeniden üretilmesi gerekmeden kolayca desenlerin değiştirilmesine olanak tanır.
- Otomatik görüntü işleme araçları, tarafsız ortalama hücre görüntüleri sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Memeli hücrelerinde sitoiskelet yapılarını incelemek için standart bir yöntem geliştirmek.
- Özel ekipman kullanmadan hücre şekli modülasyonunda araştırmayı kolaylaştırmak.
- Standart biyoloji laboratuvarlarında mikrodesen tekniklerinin erişilebilirliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Çok fotonlu görüntüleme sistemi üzerinde otomatik mikrodesen oluşturma.
- Ticari olarak temin edilebilen görüntüleme sistemlerinin kullanılması.
- Fotomask yeniden üretimi olmadan desenlerin değiştirilmesi.
- Temsili protein dağılımlarını oluşturmak için görüntü işleme.
Ana Sonuçlar
- Mikrodesen tekniklerinin başarılı bir şekilde otomatikleştirilmesi.
- Tutarlı sitoiskelet çalışmaları için standart hücre şekilleri.
- Desen üretimi için gereken zaman ve kaynakların azaltılması.
- Hücrelerdeki protein dağılımlarının tarafsız temsili.
Sonuçlar
- Protokol, memeli hücrelerinde sitoiskelet yapılarının incelenmesini geliştirir.
- Özel ekipman bulunmayan laboratuvarlar için pratik bir çözüm sunar.
- Gelecek araştırmalar bu yöntemin esnekliğinden ve verimliliğinden faydalanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Automated infrared laser-assisted micropatterning enables precise control of cell geometry, directly addressing variability in cell-based assays and supporting robust quantitative analysis. By standardizing cell shape using accessible imaging platforms, this method enhances predictive confidence in early discovery and screening workflows. The approach facilitates high-throughput studies of morphology-function relationships, supporting portfolio-wide target validation and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular pathways by controlling cell morphology and reducing biological variability.
- Supports functional target validation by standardizing experimental conditions across large cell populations.
- Improves predictive confidence for pathway analysis and mechanistic de-risking in early-stage research.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible, geometry-defined cell systems for downstream compound screening and phenotypic assays.
- Facilitates assay standardization and scalability by automating pattern generation and cell seeding.
- Enables quantitative, high-throughput imaging and analysis of protein localization and cytoskeletal organization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cell morphology with disease-relevant phenotypes for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing reproducible, quantitative data across experimental replicates.
- Enhances mechanistic insight into form-function relationships relevant to preclinical model selection.
Pipeline & Workflow Integration
This micropatterning protocol integrates from early discovery through screening and translational research, leveraging standard imaging systems for broad applicability.
- Discovery Biology: Standardizes cell shape to enable hypothesis testing and pathway clarification with reduced confounding variability.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible cell systems for reliable compound evaluation and phenotypic screening.
- Analytics: Delivers quantitative, averaged measurements of protein localization and morphology for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant systems by controlling cellular architecture.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, reusable workflow adaptable to various substrates and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Streamlines standardization, reproducibility, and scalability of cell patterning workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing biological variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement across discovery and screening programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in imaging system configuration and laser parameter optimization.
- Depends on access to multiphoton or IR laser-equipped imaging platforms.
- Necessitates cross-team standardization of pattern design and imaging protocols.
- Adaptable to coverslips, slides, and glass-bottom dishes for diverse assay formats.
- Pattern quality is sensitive to laser power, focal plane accuracy, and substrate preparation.
