İnsan Miyeloid U937 Hücrelerinde Akış Sitometrisi ile SAMHD1 Kısıtlamasının Analizi

Makrofajların HIV enfeksiyonunda hücresel faktörlerin rolüne olan ilginin artmasıyla, özellikle U937 hücrelerinde ifade edilmeyen SAM HG için esnek bir analiz sistemi geliştirdik. Sistemin en büyük avantajı esnekliğidir. Kurulduktan sonra, çeşitli proteinleri, hücreleri veya hedef virüsleri analiz etmek için kullanılabilir.

Hücrelerin sağlığını korumak ve ayrıca çok renkli akış sitometrisi ile rahat olmak önemlidir. Analize başlamadan 10 dakika önce sitometreyi ve bilgisayarı açın. Atıkların boş olduğundan ve kılıf tankının dolu olduğundan emin olun.

Ardından oturum açın ve analiz yazılımını açın. Kolunu hareket ettirdikten sonra, su tüpünü çıkarın. Akış hızını yüksek olarak ayarlayın ve asal basın.

Işığın sönmesini bekleyin ve bu işlemi üç kez daha tekrarlayın. Su tüpünü geri yerleştirin ve üç dakika boyunca yüksek bir akış hızında çalıştırın. Ardından, akış hızını düşük olarak ayarlayın ve edinime kadar bekleme moduna geçin.

Deneme, yeni deneme'yi seçin ve boş deneme seçmek için Tamam'a basın, denemeye sağ tıklayın ve yeni örnek ekleyin. Paneli boşaltmak için Tamam'a basın. Uygun bir adla yeniden adlandırmak için sağ tıklayın ve yeni bir tüp ortaya çıkarmak için artı işaretine tıklayarak örneği açın.

Denetçideki sitometre ayarlarını görmek için tüpe çift tıklayın. Parametreler menüsünde, mavi lazer 53030 ve sarı lazer 61020 dışındaki gereksiz florokromları silin. Çalışma sayfasında, ilgili simgeye tıklayarak ve eksen etiketine tıklayarak eksenleri değiştirerek yan dağılım alanı nokta grafiği, YFP histogramı, RFP histogramı ve RFP'ye karşı YFP nokta grafiği için bir ileri dağılım alanı ve yan dağılım alanı nokta grafiği oluşturun.

Virüs bulaşmamış, dönüştürülmemiş kontrolü yükleyin ve makinede çalıştır'a basın. Ardından, edinme panosunda acquire (edinim) düğmesine basın. Sol alt kadrandaki hücreleri konumlandırmak için gösterge tablosundaki ileri ve yan saçılma voltajlarını ayarlayın.

Bu popülasyonun etrafına kapı açın ve onu P biri olarak etiketleyin. Diğer grafiklere sağ tıklayın ve enkazı sonraki analizden kaldırmak için P'yi bir tane göster'i seçin. RFP ve YFP voltajlarını, tepe noktası histogramın soluna oturacak şekilde ayarlayın.

YFP için tek renk kontrolünü yükleyin ve al düğmesine basın. Kontrol panelindeki YFP voltajını, en fazla floresan hücresi dedektör aralığında olacak şekilde ayarlayın. Ardından RFP denetimi için de aynısını tekrarlayın.

Denemeyi seçin. Ücret kurulumuna gidin ve ücret denetimleri oluştur'u seçin ve normal bir çalışma sayfasına geçmek için Tamam'ı seçin, ardından lekesiz normal bir çalışma sayfası seçin. Koşuya basın ve lekesiz kontrol için edinin.

Sağlam hücrelerin etrafına bir P kapısı çizin ve kaydedin. Tüpü çıkarın ve makineyi bekleme moduna alın. P one'a sağ tıklayın.

Tüm ücret kontrollerine uygula'ya tıklayın ve RFP normal çalışma sayfasına geçin. Çalıştırmaya basın ve tek renkli RFP kontrolünü kaydedin ve yazılım otomatik olarak pozitif hücreleri geçecektir. Makineyi bekleme moduna alın ve YFP kontrolü için aynısını tekrarlayın.

Denemeyi seçin, ücret kurulumuna gidin, tazminatı hesapla'yı seçin ve ardından bağlantıya tıklayın ve kaydedin. Genel çalışma sayfasına geçin ve numune tüpüne dönün. HIV RFP ile enfekte olmuş vahşi tip SAM HD ile dönüştürülmüş hücreleri edinin ve YFP ve RFP için dikey ve yatay olarak hizalanmış kadranların köşelerinde dört ayrı popülasyonun görülebildiğini kontrol edin.

Tüpü çıkarın ve bekleme moduna basın. Dönüştürülmemiş, virüs bulaşmamış örneği yeniden yükleyin ve çalıştır'a basın. Alma panosunda, durdurma kapısını P bir ve olayları 30.000 olay kaydedecek şekilde ayarlayın.

Kayıt düğmesine basın. Her tüp arasında bir sonraki tüpe basarak diğer numuneler ve kontroller için de aynısını tekrarlayın. Çalışırken veya hawk sonrası örnekleri yeniden adlandırın ve verileri nokta FCS dosyaları olarak dışa aktarın.

Yazılımı açın ve tüm FCS dosyalarını panoya sürükleyin. Ücret denetimlerini seçin ve bunları ücret alt klasörüne sürükleyin. Dosyayı açmak için dönüştürülmemiş, virüs bulaşmamış tüpe çift tıklayın ve bir grafiğin karşı tarafına saçılma scatter'ını iletin.

Sol alt köşedeki kalıntıları hariç tutarak sağlam hücre popülasyonundaki çokgen aracını ve kapıyı seçin ve hücreleri adlandırın. Etiketleri, hücreleri gizlemeyecek şekilde hareket ettirin. Bu kapıyı tüm örnekler çubuğundaki tüm tüp popülasyonuna sürükleyin.

Her tüp için uygun geçişi sağlamak için yatay ok düğmelerini kullanarak tüm popülasyon arasında gezinin. Hücrelere çift tıklayın ve eksenleri alana karşı yüksekliğe ayarlayın. Çiftleri hariç tutmak ve yazılımın otomatik olarak tek hücreler olarak adlandırmayı önermesine izin vermek için dikdörtgen bir kapı kullanarak tek büyük popülasyonu seçin.

Ardından, bu geçidi tüm hücre popülasyonlarına sürükleyin ve geçidin tüm örnekler için uygun olup olmadığını kontrol edin. Enfekte olmamış, dönüştürülmemiş örnek için tek hücre popülasyonunu seçin. Y eksenini YFP için telafi edilmiş mavi lazere ve X eksenini RFP için telafi edilmiş sarı lazere değiştirin.

Kadran geçit aracını seçin ve negatif hücre popülasyonunun sağ üst uç noktasına tıklayın. Bu ön geçidi, tüm örnekler çubuğundaki üst kapıya sürükleyerek tüm tek hücreli popülasyonlara uygulayın. Kadran kapıları popülasyonu tatmin edici bir şekilde ayırmazsa, poligon aracını kullanarak bireysel kadranları kapılayın.

Dönüştürülmemiş YFP negatif ve YFP pozitif hücreler arasındaki doğru geçidi kontrol etmek için wild tipi SAM HD'ye tek bir örnek kaydırın. Negatif hücreleri loş YFP hücrelerinden ayırmak için kontur görünümünü kullanın. Tüm numuneler için geçerli olan YFP negatif ve pozitif arasındaki en iyi ayrımı kullanın ve geçidi YFP pozitifliğine göre kontrol etmek için numuneler arasında gezinin.

Dönüştürülmemiş HIV RFP ile enfekte olmuş örneğe ilerleyin ve enfekte olmamış RFP negatif ile enfekte RFP pozitif arasındaki geçidin doğru olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse kontur görünümünü kullanın ve geçitin tüm örnekler için geçerli olup olmadığını kontrol etmek için kalan örnekler arasında gezinin. Her örnek dört kadran gerektirir.

Q1 YFP pozitif, Q2 çift pozitif, Q3 RFP pozitif ve Q4 çift negatif. Tablo düzenleyicisini açın ve dört kadran kapısını panoya sürükleyin. Açılır menüden dosyalamak ve excel seçmek için seçin.

Dosya hedefinizi seçin ve tablo oluştur'a tıklayın. Oluşturulan elektronik tabloyu yerel dosya adlandırma kurallarına göre kaydedin. Grafiklerin ve geçit stratejilerinin temsillerini dışa aktarmak için düzen editörü simgesine tıklayın.

Her popülasyonu seçin ve gerekli eksenler, etiketleme ve aralıklarla düzenleyiciye sürükleyin. Toplu iş bölümünün altındaki tüm numuneler için gösterilen grafiklerle aynı grafiklere sahip bir düzen oluşturmak için sütuna bir tane girin ve toplu iş raporu oluştur düğmesine basın. Dosya menüsünde, genişliğe ölçeklendirilecek ölçeği seçin ve sayfa sonlarından kaçının.

Ardından gerekli dosya biçiminde kaydedin. Dışa aktarılan elektronik tabloda, sütunları metin makalesinde açıklandığı gibi oluşturun. Her SAM HD bir yapı için çoğaltılan verilerin ortalamasını almak ve kısıtlama oranı değerlerini hesaplamak için uygun veri analizi yazılımını kullanın.

Optimal ve yetersiz veriler için temsili YFP ve RFP grafikleri oluşturulmuştur. Optimal olmayan veri grafiği, HIV enfeksiyonunun çok düşük olduğunu ve tazminat ve geçit ile ilgili zorluklar yarattığını göstermektedir. Kısıtlama oranı 0,5 idi ve bu da beklenen 0,3 oranından daha yüksekti.

SAM HD bir'in vahşi tip ve negatif kontrole göre varyantları için kısıtlama oranı grafikleri, optimal ve yetersiz veriler için oluşturulmuştur. Optimal verilerde, vahşi tip yaklaşık 0.2 beklenen kısıtlamayı gösterdi ve negatif kontrol HD 206 ila yedi AA 1.0 kısıtlama oranına sahipti. R372D varyantı, vahşi tipten önemli ölçüde farklıydı, ancak negatif kontrolden önemli ölçüde farklı değildi ve kısıtlama yeteneğini kaybetti.

Optimal olmayan verilerde, negatif kontrol beklendiği gibi davrandı, ancak vahşi tip, düşük enfeksiyon oranı nedeniyle 0.5'lik bir kısıtlama oranı gösterdi. R143D, vahşi tipten ve negatif kontrolden istatistiksel olarak farklı bir ara fenotip gösterdi. G209S varyantı, vahşi tipten önemli ölçüde farklıydı, ancak negatif kontrolden önemli ölçüde farklı değildi ve bu nedenle kısıtlama yeteneğini kaybetti.

Kontrol hücrelerinizden bolca olması önemlidir, özellikle de akış sitometrisinde yeniyseniz. Bunu takiben veya paralel olarak, bütünsel bir resim oluşturmak için aynı mutantların biyokimyasal analizi yapılabilir.