dNTPase SAMHD1 ile Küçük Molekül Etkileşimini Araştırmak için Yüksek Verimli Enzime Bağlı Aktivite Testi
16 Nisan 2021
SAMHD1, insan sağlığı ve hastalığında kritik rolleri olan bir deoksinükleozit trifosfat trifosfohidrolazdır. Burada, küçük moleküllerin ve nükleotid analoglarının SAMHD1 substratları, aktivatörleri ve inhibitörleri olarak değerlendirilmesine izin veren, 384 oyuklu bir mikroplaka formatında konuşlandırılan çok yönlü bir enzime bağlı SAMHD1 aktivite testi sunuyoruz.
Bu yöntem, hangi kemoterapi ilaçlarının SAMHD1 tarafından hidrolize edildiğini karakterize etmemizi sağlar ve bu enzimin küçük moleküllü inhibitörlerini tanımlamak için bir tarama testi olarak kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, basit, ucuz olması ve farklı küçük moleküllerin bu enzimle nasıl etkileşime girdiği hakkında çok miktarda bilgi vermesidir. Prosedürü gösteren, gruptan bir doktora sonrası olan Miriam olacaktır.
Başlamak için, sırasıyla% 0.005 ve 0.3 milimolar nihai konsantrasyonlara Tween-20 ve TCEP ekleyerek tam SAMHD1 reaksiyon tamponu hazırlayın. Tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda 7.9 milimolar nihai konsantrasyona EDTA ekleyerek EDTA durdurma çözeltisini hazırlayın. 10 kısım MG stok çözeltisini 2.5 kısım %7 amonyum molibdat ve 0.2 kısım %11 Tween-20 ile karıştırarak malakit yeşili veya MG çalışma solüsyonu hazırlayın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, şeffaf yuvarlak tabanlı polipropilen 96 oyuklu bir plakada ilgili çözücü içinde test bileşiklerini nihai konsantrasyonun 100 katı oranında seri olarak seyreltin. Nihai çözücü konsantrasyonunu %1'in altında tutmak için bu bileşikleri tam SAMHD1 reaksiyon tamponu ile nihai konsantrasyonun 25 katına kadar seyreltin Beş mikrolitre seyreltilmiş bileşeni şeffaf 384 kuyulu düz tabanlı bir tahlil plakasının uygun kuyucuklarına aktarın ve prosedürü yalnızca çözücü kontrol numuneleri ile tekrarlayın. Enzim ana karışımı hazırlığı için, rekombinant insan SAMHD1 proteinini ve rekombinant pirofosfatazı tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda istenen nihai konsantrasyonun dört katına kadar seyreltin.
50 mikromolar konsantrasyona ulaşmak için çözeltiyi tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda seyrelterek aktivatör veya substrat dGTP'yi hazırlayın. Bileşik dilüsyonları ve sadece çözücü kontrolü içeren kuyucuklara, beş mikrolitre SAMHD1 pirofosfataz ana karışımı dağıtın ve enzim kontrol kuyularına beş mikrolitre tam SAMHD1 reaksiyon tamponu ekleyin. Daha sonra reaksiyonu başlatmak için tüm kuyucuklara 10 mikrolitre dGDP çözeltisi dağıtın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Reaksiyonu durdurmak için 20 mikrolitre EDTA durdurma çözeltisi ekleyin. Tüm kuyucuklara 10 mikrolitre MG çalışma solüsyonu ekledikten sonra, içeriği bir orbital mikrokuyu plaka çalkalayıcı kullanarak karıştırın ve plakayı bir dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin. Plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin ve bir mikrokuyu plaka okuyucusunda 630 nanometrede absorpsiyonu okuyun.
Pozitif kontrol kuyularının standart sapmasını hesaplayın ve ardından ortalamayı hesaplayın. Benzer şekilde, negatif kontrol kuyuları için standart sapmayı hesaplayın ve ardından ortalamayı hesaplayın. Z faktörünü hesaplamak, tahlil kalitesinin bir göstergesidir.
Her absorbans değerini pozitif ve negatif kontrollerin ortalama değerlerine normalleştirin. Pozitif kontrolün %100 SAMHD1 aktivitesi ve negatif kontrolün %0SAMHD1 aktivitesi olarak ayarlanması. Plot SAMHD1 aktivitesi, bileşik konsantrasyonunun bir fonksiyonudur ve bileşiğin yarı maksimal inhibitör konsantrasyonunun belirlenmesine izin veren dört parametreli değişken eğim doz yanıt eğrisine uyar.
Nükleotid analog stoklarını seyreltin ve SAMHD1 reaksiyon tamponunu nihai konsantrasyonun dört katına kadar tamamlayın ve beş mikrolitreyi 384 oyuklu bir tahlil plakasının uygun kuyucuklarına aktarın. Enzim SAMHD1 veya pirofosfataz ana karışımını hazırlamak için, rekombinant insan SAMHD1 proteinini ve Escherichia coli pirofosfatazı tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda istenen nihai konsantrasyonun iki katına kadar seyreltin. Rekombinant Escherichia coli pirofosfatazı tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda istenen nihai konsantrasyonun iki katına seyrelterek sadece pirofosfataz çözeltisi hazırlayın.
Benzer şekilde, stoğu tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda nihai konsantrasyonun dört katına kadar seyrelterek aktivatörler GTP ve dGTP alpha S hazırlayın. Nükleotid analoglarını içeren 384 kuyulu bir tahlil plakasının uygun kuyucuklarına GDP veya dGTP alfa S veya tam SAMHD1 reaksiyon tamponu olmak üzere beş mikrolitre aktivatör dağıtın. 10 mikrolitre SAMHD1 pirofosfataz ana karışımı, tek başına pirofosfataz veya tam SAMHD1 reaksiyon tamponunu uygun kuyucuklara dağıtarak reaksiyonu başlatın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
EDTA durdurma çözeltisi kullanarak reaksiyonu durdurduktan sonra, tüm kuyucuklara 10 mikrolitre MG çalışma çözeltisi ekleyin. İçindekiler karıştırıldıktan sonra, plakayı 1000 x g'da bir dakika santrifüjleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından absorbansı 630 nanometrede ölçün.
Pirofosfataz için ortalama absorbans değerlerini hesaplayın, sadece arka plan değeri olacak olan reaksiyon kuyuları. Ardından, arka plan değerini SAMHD1 veya pirofosfataz reaksiyonlarındaki karşılık gelen kuyucuklardan çıkarın. Son olarak, tampon GTP ve dGTP alfa S koşulları ile her bir nükleotid analoğu için düzeltilmiş absorbans değerlerini çizin.
Bu çalışmada, malakit yeşili reaktifi ile inkübasyonu takiben artan sodyum fosfat konsantrasyonu ile emici artmış ve 0.25 milimolar konsantrasyonda doygunluğa ulaşmıştır. Fosfatın doğrusal algılama aralığı 0.004 ila 0.03 milimolar arasında görülebilir. Ölçülebilir SAMHD1 aktivitesi elde etmek için tahlil bileşenlerinin gerekliliği gösterilmiştir.
Ne SAMHD1 ne de pirofosfataz tek başına dGTP varlığında organik bir fosfat üretemez. Bununla birlikte, tüm tahlil bileşenleri mevcut olduğunda, sinyalde bir artış gözlendi. SAMHD1 inhibitör bileşikleri için elde edilen doz yanıt eğrileri, artan konsantrasyonların SAMHD1 aktivitesini etkili bir şekilde inhibe ettiğini göstermiştir.
Hidroksiüre, artan hidroksiüre dozları ile etkilenmemiş SAMHD1 aktivitesi ile gösterilen in vitro SAMHD1 aktivitesini inhibe etmez. Her iki allosterik bölgeye dGTP bağlanması, SAMHD1'i aktive ederek bu nükleotidin müteakip hidrolizine izin verirken, diğer üç kanonik dNTP, ikinci allosterik bölgeyi bağlamadan ve daha sonra katalitik bölgede hidrolize edilmeden önce birinci allosterik bölgenin GTP aktivasyonunu gerektirir. Nükleotid analogları için, klofarabin trifosfat, GTP varlığında aktivite gözlendiği için bir allosterik bölge iki aktivatörü ve bir substrattır.
Sitarabin trifosfat ise aktiviteyi gözlemlemek için dGTP alfa S gerektiğinden yalnızca katalitik bölgeyi işgal edebilir. Gemsitabin trifosfat ile herhangi bir aktivite gözlenmedi. Bu tahlilde SAMHD1'i inhibe eden küçük moleküllerin termal kayma tahlilleri gibi fiziksel yaklaşımlarla tanımlanmasını takiben, hedef katılımını sorgulamak için kullanılabilir.
Burada gösterilen yöntem, hangi kanser ilaçlarının SAMHD1 tarafından hidrolize edilebileceğini anlamamıza ve bu enzimi ilaç direncinin üstesinden gelmek için potansiyel bir terapötik hedef olarak oluşturmamıza yardımcı oldu.
Genel Bakış
Bu makale, Sterile alpha motif ve HD domain içeren protein 1 (SAMHD1) aktivitesini ve inhibisyonunu karakterize etmek için sağlam ve yüksek kapasiteli bir enzimle eşleşmiş malahit yeşili testi sunmaktadır. Bu yöntem, nükleotid hidrolizi sırasında salınan inorganik fosfatın miktarını belirleyerek SAMHD1 aktivitesinin dolaylı olarak ölçülmesini sağlar ve böylece inhibitörler ile allosterik regülatörler dahil olmak üzere küçük molekül etkileşimlerinin bu enzimle çalışılmasını kolaylaştırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Enzimoloji
- Kanser farmakolojisi
Arka Plan
- SAMHD1, dNTP'leri hidrolize ederek hücre içi deoksinükleozit trifosfat (dNTP) havuzlarını düzenler.
- Nükleotid metabolizması, tedavi direnci ve çeşitli patolojilerle ilişkilendirilmiştir.
- SAMHD1'in düzenlenmesini ve işlevini anlamak, terapötik geliştirme için kritik öneme sahiptir.
- SAMHD1 ile küçük molekül etkileşimlerini incelemek için basit ve yüksek verimli analizlere ihtiyaç vardır.
Çalışmanın Amacı
- SAMHD1 aktivitesi için basit, ucuz ve yüksek kapasiteli bir analiz yöntemi geliştirmek ve göstermek.
- Antikanser ilaçlar da dahil olmak üzere, SAMHD1'in bilinen inhibitörlerini ve substratlarını karakterize etmek.
- SAMHD1 kataliz mekanizmalarını ve allosterik aktivatörler tarafından yapılan düzenlemeleri aydınlatmak.
Kullanılan Yöntemler
- SAMHD1 reaksiyon tamponunun, EDTA durdurma çözeltisinin ve malahit yeşili çalışma çözeltisinin hazırlanması.
- Test bileşiklerinin ve kontrollerin 384 kuyucuklu plaka formatında seri dilüsyonu.
- Rekombinant insan SAMHD1 ve pirofosfataz kullanılarak, nükleotid substratları veya analogları ile gerçekleştirilen enzim reaksiyonları.
- İnorganik fosfatın malahit yeşili reaktifi ile kolorimetrik olarak tespit edilmesi ve 630 nm'de absorbans ölçümü.
- Verilerin normalizasyonu, assay kalitesi için Z faktörünün hesaplanması ve inhibitör potansiyelini belirlemek için doz-yanıt eğrisi uydurması.
Ana Sonuçlar
- Analiz, yalnızca tüm bileşenler mevcut olduğunda SAMHD1 aktivitesini güvenilir bir şekilde tespit eder.
- Bilinen SAMHD1 inhibitörleri doz bağımlı inhibisyon gösterir; hidroksiüre in vitro ortamda SAMHD1'i inhibe etmez.
- dGTP allosterik bir aktivatör olarak görev yaparken, diğer dNTP'ler aktivasyon için GTP'ye ihtiyaç duyar.
- Clofarabin trifosfat hem allosterik bir aktivatör hem de substrat olarak işlev görür; sitarabin trifosfat aktivite için dGTP analoğuna ihtiyaç duyar; gemcitabin trifosfat ise hidrolize edilmez.
- Analiz, küçük moleküllü inhibitörleri tanımlayabilir ve substrat özgüllüğünü karakterize edebilir.
Sonuçlar
- Enzimle eşleşmiş malahit yeşili testi, SAMHD1 aktivitesini ve inhibisyonunu incelemek için güçlü, yüksek kapasiteli bir araçtır.
- Küçük moleküllü inhibitörlerin taranmasına ve nükleotid analoğu etkileşimlerinin karakterizasyonuna olanak tanır.
- Bu yöntem, kanserdeki ilaç direncini aşmak için SAMHD1'in terapötik bir hedef olarak belirlenmesini destekler.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
SAMHD1 için geliştirilen yüksek kapasiteli enzimle eşleşmiş aktivite analizleri, küçük moleküllerin nükleotid metabolizmasının temel bir düzenleyicisi ile olan etkileşimlerinin hızlı ve kantitatif olarak sorgulanmasına olanak tanır. Bu yetenek, onkoloji ve antiviral ilaç keşif süreçlerinde hedef doğrulaması, mekanistik risk azaltma ve portföy seçimi için kritiktir. Malahit yeşili analiz formatı, hem inhibitör hem de substrat profilleme işlemleri için ölçeklenebilir taramayı ve güçlü veri üretimini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Küçük molekül modülasyonunu nicelleştirerek, SAMHD1'in terapötik bir hedef olarak sistematik bir şekilde sorgulanmasını sağlar.
- Aday bileşiklere yanıt olarak enzim aktivitesinin doğrudan ölçümü yoluyla mekanistik risklerin azaltılmasını destekler.
- İlaç direnç yollarıyla ilgili allosterik regülatörlerin ve inhibitörlerin fonksiyonel validasyonunu kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bileşik kütüphanelerinin SAMHD1'e karşı taranması için standardize edilmiş, yüksek kapasiteli bir platform sağlar.
- Doz-yanıt ve IC50 belirlemesine uygun, tekrarlanabilir ve kantitatif çıktılar sunar.
- Çeşitli bileşik sınıfları ve analoglar arasında analiz ölçeklendirilebilirliğine ve platformun yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Terapi direncini ilgilendiren ilaç-enzim etkileşimlerini karakterize ederek translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Aday inhibitörlerin veya substratların erken keşif aşamasından preklinik doğrulamasına kadar olan sürekliliği destekler.
- Substrat spesifitesini ve inhibitör potansiyelini netleştirerek risk ayarlı ilerleme kararlarına bilgi sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz yöntemi; hedef doğrulama, öncü bileşik belirleme ve nükleotid metabolizması hedeflerine yönelik preklinik mekanistik çalışmaların kesişim noktasında yer almaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Terapötik hipotezleri test etmek ve düzenleyici mekanizmaları netleştirmek için enzim aktivite değişikliklerini nicelleştirir.
- Tarama: Bileşik elemeleri ve hit doğrulamaları için sağlam, tekrarlanabilir okumalar sağlar.
- Analitik: Doz-yanıt eğrisi uydurma, Z-faktörü hesaplama ve koşullar arası karşılaştırma için normalizasyona olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: In vitro enzim modülasyonunu, potansiyel in vivo ilaç direnci mekanizmalarıyla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Daha geniş portföy uygulamaları için diğer fosfat salan enzimlere uyarlanabilir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef etkileşimi ve inhibitör etkinliğine yönelik öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Analiz kurulumunu, standardizasyonu ve yüksek verimli veri elde etme sürecini kolaylaştırır.
- Stratejik Değer: Devam/durdur karar kalitesini iyileştirir ve geç aşama biyolojik riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Aday moleküllerin ve mekanistik hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Enzimoloji, assay geliştirme ve kantitatif veri analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- Rekombinant protein üretimine ve yüksek verimli plaka okuyuculara erişim gereklidir.
- Kontrollerin ve normalizasyon prosedürlerinin ekipler arası titiz bir şekilde standartlaştırılmasını gerektirir.
- Minimum protokol değişiklikleri ile çeşitli nükleotid analoglarına ve küçük molekül kütüphanelerine uyarlanabilir.
- Her yeni enzim veya substrat sınıfı için tespit aralığı ve arka plan düzeltmesi valide edilmelidir.
