Yetişkin Farelerden Atriyal ve Ventrikül Miyositlerinin Eşzamanlı İzolasyonu için Langendorff Yönteminin Modifikasyonları
May 13th, 2021
Bu protokol, yetişkin farelerden atriyal ve ventrikül miyositlerinin eşzamanlı izolasyonu için aort kanülasyonunun derinliğini de içeren Langendorff yönteminin modifikasyonlarını açıklar.
Bu protokol, perfüzyonlu bir fare kalbinden atriyal verimi artırmaya yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, atriyal ve ventriküler miyositlerin aynı sindirim durumu altında aynı anda izole edilebilmesidir. Bu yöntem, hücresel ve hücre altı düzeyde kalp hastalığının mekanizmaları hakkında fikir verebilir.
Sekiz ila 10 haftalık bir erkek C57 siyah altı fareyi ötenazi yaptıktan sonra, xiphoid derisini kaldırmak için doku tokmaklarını kullanın. Daha sonra doku makası kullanarak ciltten küçük bir yanal kesi yapın. Cilt ve fasya arasında künt bir diseksiyon gerçekleştirin.
Deri kesisini her iki tarafta da V şeklinde aksiliğe doğru uzatın ve kesiye göğüs kafesi boyunca devam edin. Daha sonra doku tokaları kullanarak sternumu kenetleyin ve kalbi ve akciğerleri tamamen açığa çıkarmak için göğüs kafesini yukarı doğru saptırın. Kavisli asalar kullanarak perikardiyumu soyun.
Timus bezi büyük damarları kaplarsa, timus bezini her iki tarafa doğru yırtmak için iki kavisli önlük kullanın, ardından aort ve dal arterleri Y şeklinde bir kan damarı olarak görünene kadar kalbin tabanını yavaşça kuyruğa doğru çekin. Sol ortak karotis arterdeki aortu transekte edin, sonra brakiyofalik arteri kesin. Kalbi çıkar ve hemen kalan kanı yıkamak ve pompalamak için Tyrode'un çözeltisini içeren bir Petri kabına batırın.
Daha sonra kalbi çözelti bir içeren başka bir Petri kabına aktarın. Stereo mikroskop altında, ince Iris makası kullanarak, fazla dokuları kırpın. Şırınd'dan hava kabarcıklarını dışarı at.
Daha sonra iki düz bağlı kuvvet yardımıyla, tüm cannülasyon işleminin sıvı yüzeyin altında yapılmasına dikkat ederek retrograd aort cannülasyonu gerçekleştirin. Kanolans derinliğini, aort kapaklarına nüfuz etmemeye dikkat ederek, canül ucu yükselen aortta olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra düğüm öncesi 3-O dikişi ile aortu kavun çentiğine bağla.
Kalan kanı temizlemek için şırınnadan bir çözeltiyi hafifçe enjekte edin. Daha sonra, kalbe herhangi bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat ederek, konserve kalbi Langendorff cihazına bağlayın. Konserve kalbi Langendorff cihazına bağladıktan sonra, kalbi yaklaşık iki dakika boyunca çözelti bir ile perfuse edin.
Tek kullanımlık steril polietilen pipet kullanarak, yaklaşık 2,5 mililitre çözelti üç çizin ve daha sonra kullanmak üzere su banyosunda önceden ısıtın. Daha sonra dokuları sindirmek için, kalbi kalan çözelti üç ile yaklaşık 11 ila 12 dakika boyunca perfuse edin. Çözelti üç ile perfüzyonun ilk iki dakikasından sonra, perfüzyonlu çözeltiyi, sindirim tamamlanana kadar yeniden kullanılmak üzere peristaltik pompa tarafından perfüzyon rezervuarlarına geri dönüştürin.
Kalp şiştiğinde, hafif solgun ve flacid olduğunda, dişli tokmalar kullanarak miyokardları hafifçe çimdikleyin. Bir baskı görünüyorsa, sindirimi sonlandırın ve kalbi aparattan ayırın. Arteriyel ve ventriküler miyositleri izole etmek için, ventrikülleri ve artriyeleri çıkarmak ve farklı Petri tabaklarına yerleştirmek için önlük kullanın.
Daha sonra önceden ısıtılmış çözeltiyi her iki yemeğin yanına üç ekleyin. Künt forseps kullanarak, dokuları bulanık bir dokuya dönüştürun, ardından hava kabarcıklarını tanıtmadan dokuyu sindirim için hafifçe pipetlayın. Kalan enzim aktivitesini tutuklamak için, bir pipet kullanarak, bulanık sindirilmiş dokuyu çözelti dört'e aktarın, sonra 192 kez 20 saniye santrifüj edin G.Süpernatantı çıkardıktan sonra, hücre tortusunu çözelti beşte yeniden kullanın.
Kalsiyum paradoksu ve kalsiyum aşırı yüklenmesini önlemek için, hücre süspansiyonu için litre başına 100 milimoler kalsiyum klorürden oluşan toplam 50 mikrolitreyi kademeli olarak ekleyerek kalsiyumu adım adım yeniden tanıtmak. Tüm kalsiyum klorür eklendikten sonra, hücreleri yama kelepçesi çalışması için Tyrode'un çözeltisinde saklayın. Kanülasyon derinliği, atria ve eklerinin perfüzyonu ile ilişkilidir.
Kanül ucu yükselen aortta olduğunda, her iki atriyal ek de yeterli atria perfüzyonu gösteren şişirilir. Bununla birlikte, kanül ucu aort kökünde olduğunda, her iki atriyal ek de yetersiz perfüzyona işaret eden wizened edilir. Yükselen aortta canülasyon ile izole edilen atriyal miyositler, hem kalsiyumun yeniden girişi öncesi hem de sonrasında aort kökünde canülasyon ile izole edilenlerden daha yüksek sağkalım oranlarına sahipti.
Buna karşılık, yükselen aortta veya aort kökünde hem kalsiyumun yeniden girişi öncesi hem de sonrasında canülasyon ile izole edilen ventrikül miyozitlerin sağkalım oranlarında bir fark yoktu. İzole atriyal ve ventrikül miyositlerindeki sodyum akımının tüm hücreli yama kelepçe kaydı ve mevcut yoğunluklar, izole hücrelerin kalitesinin elektrofizyolojik deneyler için gereksinimleri karşıladığını doğrulamaz. Aortu transekte ederken, ligasyon için yeterli bir bez tuttuğunuzdan emin olun.
Aksi takdirde, kanon ligasyondan sonra aort kapağına nüfuz edebilir.
Genel Bakış
Bu protokol, yetişkin farelerden atriyal ve ventriküler miyositlerin eşzamanlı izolasyonu için Langendorff metodunda yapılan modifikasyonları açıklamaktadır. Bu metod, elektrofizyolojik çalışmalar için izole edilen hücrelerin kalitesini korurken atriyal miyositlerin verimini artırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyovasküler fizyoloji
- Hücresel biyoloji
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Langendorff metodu, kalbin perfüzyonu için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.
- Hem atriyal hem de ventriküler miyositlerin eşzamanlı olarak izolasyonu, kardiyak fonksiyon hakkında daha iyi anlayış sağlayabilir.
- Miyositlerin davranışını anlamak, kalp hastalıklarının çalışılmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir.
- Atriyal miyosit veriminin artırılması, doğru deneysel sonuçlar için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Fare kalplerinden atriyal miyositlerin verimini artırmak.
- Atriyal ve ventriküler miyositlerin eşzamanlı olarak izolasyonunu sağlamak.
- Kalp hastalığının altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kalp ekstraksiyonu için yetişkin erkek C57BL/6 fareler ötanazi yapıldı.
- Perfüzyon için retrograd aortik kanülasyon gerçekleştirildi.
- Kalpler, sindirim için özel çözeltiler ile perfüze edildi.
- Miyositler izole edildi ve elektrofizyolojik çalışmalar için hazırlandı.
Ana Sonuçlar
- Modifiye edilmiş metod kullanılarak izole edilen atriyal miyositler daha yüksek hayatta kalma oranları gösterdi.
- Eşzamanlı izolasyon, ventriküler miyositlerin kalitesini etkilemedi.
- Elektrofizyolojik kayıtlar, izole edilen hücrelerin canlılığını doğruladı.
- Etkili atriyal perfüzyon için optimal kanülasyon derinliği kritik öneme sahipti.
Sonuçlar
- Modifiye edilmiş Langendorff metodu, atriyal miyosit verimini artırır.
- Eşzamanlı izolasyon, kardiyak fizyoloji araştırmalarındaki araştırma yeteneklerini geliştirir.
- Bu protokol, kalp hastalığı mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına olanak tanıyabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes using a modified Langendorff method addresses a critical bottleneck in cardiac target validation and mechanistic de-risking. This protocol enables high-quality, reproducible cell preparations essential for predictive electrophysiological assays and translational cardiac research. The approach supports robust early discovery and preclinical workflows by ensuring reliable access to both atrial and ventricular cell types from a single preparation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of atrial and ventricular mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing viable myocytes for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in cardiac safety and efficacy assessments.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability cardiomyocytes for downstream electrophysiological assays.
- Improves assay reproducibility by controlling for cell source and preparation conditions.
- Enables scalable preparation of both atrial and ventricular cells for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular models with disease-relevant atrial and ventricular pathologies.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical cardiac safety studies.
- Reduces biological risk by validating cell quality for patch clamp and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical cardiac research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and safety de-risking.
- Discovery Biology: Provides robust cellular substrates for mechanistic hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for electrophysiological assay development.
- Analytics: Enables direct measurement of sodium currents and cell viability for comparative studies.
- Translational Research: Bridges cellular findings to preclinical cardiac models by ensuring cell quality and relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for consistent cardiomyocyte isolation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cardiac dissection and Langendorff perfusion.
- Needs access to specialized perfusion apparatus and patch clamp infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of cannulation and digestion steps.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or cardiac disease models.
- Careful control of cannulation depth is critical for optimal atrial cell yield and viability.
