Name: Farelerde İntrahepatik Adacık Transplantasyonu Sırasında İnfüzyon Sonrası Portal Ven Kanamasının En Aza İndirgenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Öğrenin farelerde intrahepatik adacık transplantasyonu sırasında portal ven kanamasını önlemek için geliştirilmiş cerrahi teknikleri. Bu yöntemler karaciğer kanseri ve diğer karaciğer hastalıkları araştırmalarında yüksek sağkalım oranları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Gazi İşleri Bakanlığı (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü HW'ye # 1R01DK105183, DK120394, DK118529 hibeleri tarafından desteklenmiştir. Dil düzenlemesi için Bay Michael Lee ve Bayan Lindsay Swaby'ye teşekkür ederiz.

Tüm prosedürler, Güney Carolina Tıp Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitelerinin ve Charleston'daki Ralph H Johnson Tıp Merkezi'nin onayı ile gerçekleştirildi.
1. Streptozotosin (STZ) kullanarak diyabet indüksiyonu
<ol><li>Alıcı farelerin hazırlanması:<ol>
<li>Tüm fareleri ayrı ayrı tartın.</li>
		<li>Bir glukometre kullanarak kuyruk damarı kan örneğinden kan şekeri seviyelerini kontrol edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Üç farklı senaryo için STZ doz belirleme:<ol>
<li>Yağlı karaciğer hastalığı olan fareler için, art arda 5 gün boyunca bir doz STZ [40 mg / kg / gün, intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon] enjekte edin.</li>
		<li>NOD-SCID fareleri için 125 mg / kg STZ, tek enjeksiyon, yani gece boyunca aç kaldıktan sonra enjekte edin.</li>
		<li>C57BL/6 fareler için 225 mg/kg STZ, tek enjeksiyon, yani enjekte edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>STZ (13.5 mg/mL) için hesaplamalar: NOT: Bu hesaplama, vücut ağırlıkları 30 g olan beş C57BL/6 fare içindir:<ol>
<li>Toplam vücut ağırlığı: 5 fare x 30 g/fare = 150g</li>
		<li>STZ gerekli: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33.75 mg</li>
	</ol>
</li>
	<li>STZ hazırlığı:<ol>
<li>Önceden hesaplanan dozu takiben STZ'yi tartın.</li>
		<li>Tartılan STZ tozunu buz üzerinde 10 mL'lik bir beherin içine aktarın.</li>
		<li>STZ'yi çözmek için beherine 3 mL sodyum sitrat çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>İyice karıştırın, 0.22-μm'lik bir gözenekten sterilize edin ve STZ çözeltisini hazırlıktan sonraki 10 dakika içinde kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>STZ enjeksiyonu:<ol>
<li>İstenilen miktarda STZ çözeltisini (bir fare için yeterli) 1 mL şırıngaya yükleyin.</li>
		<li>Fare karnının sağ alt çeyreğinde intraperitoneal enjeksiyon yapın.</li>
		<li>Enjeksiyondan sonra 5 dakika boyunca fareleri gözlemleyin ve kafeslere geri koymadan önce bu süre zarfında herhangi bir rahatsızlık belirtisi olup olmadığını kontrol edin.</li>
		<li>STZ enjeksiyonundan sonra günlük bir glukometre kullanarak kuyruk damarı kan örneğinden kan şekeri seviyesini izleyin. NOT: Bu deneyde, açlık yapmayan kan şekeri art arda iki gün boyunca 350 mg / dL'> edildiğinde fareler diyabetik olarak kabul edilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Adacık hazırlama
NOT: İnsan adacıkları, CMRL-1066 ortamında, 100 mm hücre kültürü kabı başına 10.000 adacık eşdeğer sayısı (IEQ) yoğunluğunda% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenerek kültürlenmiştir9. DMEM'de fare adacıkları %10 FBS ve %1 P/S ile aynı yoğunlukta kültüre alındı13. Ticari kaynaklardan 6-10 haftalık yaşlar arasındaki erkek NOD-SCID ve C57BL/7 fareler elde edildi.
<ol><li>Kültürlü adacıkları hücre kültürü kabından nazik tırmalayarak ayırın.</li>
	<li>1cc'lik bir şırınga kullanarak istenen sayıda adacığı (örneğin, 300-350 adacık) elle seçin ve bunları buz üzerinde steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine koyun.</li>
	<li>Mikrosantrifüjü kullanarak tüpü 10 saniye boyunca döndürün.</li>
	<li>Peleti kaybetmemek için biraz sıvı bırakarak süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Peletin 200 μL HBSS'de %0.5 sığır serum albümini (BSA) ile yeniden askıya alın.</li>
	<li>Yeniden askıya alınan adacıkları 0,5 mL'lik bir insülin şırıngasına aspire edin.</li>
	<li>Şırıngayı dik konuma getirin. Adacıkların 1 dakika boyunca batmasına izin verin.</li>
	<li>Tüm kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı itin, yaklaşık 100-150 μL sıvı içeren adacıklar bırakın.</li>
	<li>Şırıngayı baş aşağı yerleştirin ve adacıkların sıvı boyunca eşit olarak dağılmasına izin vermek için şırınganın yan tarafına hafifçe dokunun. Adacıklar artık enjeksiyon için hazır.</li>
</ol>3. Adacık nakli
<ol><li>Fareyi genel anestezi altında% 2 izofluran ile indükleyin ve koruyun. Hayvanın uygun şekilde anestezi altına alınmasını sağlamak için pedal reflekslerinin eksikliğini kontrol edin.</li>
	<li>Farenin karın bölgesindeki kürkü tıraş edin ve çıkarın.</li>
	<li>Ameliyat öncesi tek bir Buprenorfin dozu uygulayın (0.1 mg / kg i.p.).</li>
	<li>Cerrahi alanı% 2 iyot ve% 75 alkolden oluşan üç alternatif mendil ile dezenfekte edin.</li>
	<li>1-1.5 cm'lik bir kesi oluşturmak için mikro makasla bir laparotomi yapın.</li>
	<li>Peritoneal boşluğu bir retraktörle açın. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi A veya B yöntemini izleyin.</li>
</ol>4. Yöntem A: (jel köpük ile kanamayı durdurun, Şekil 1A)14,15,16
<ol><li>Fare hazırlığı<ol>
<li>Kesinin etrafına steril bir gazlı bez yerleştirin.</li>
		<li>Forseps kullanarak bağırsağı yavaşça dışarı çekin ve gazlı bez üzerinde tutun.</li>
		<li>Portal damarını konumuna göre tanımlayın ve iyi bir şekilde ortaya çıkarın.</li>
		<li>Tüm ameliyat boyunca bağırsağı ılık bir salin-ıslak gazlı bezle örtün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adacık önceden yüklenmiş insülin şırınga iğnesini duodenumun yakınındaki portal damardan geçirin (Şekil 1B). Bunu yapmak için, iğneyi delik (konik) aşağı bakacak şekilde tutun ve duvardan geçmeden önce açılış yüzeyinin açısını portal damar duvarına paralel olarak konumlandırın.<ol>
<li>Önce adacıkları karıştırmak için şırıngaya biraz kan (20-50 μL) çekmek için pistonu çekin.</li>
		<li>Dalmayı tekrar tekrar çekip iterken adacıkları portal damara yavaşça aşılayın.</li>
		<li>Enjeksiyon bölgesini örtmek için bir parça jel köpük (yaklaşık 0,5 cm x 0,5 cm boyutlarında) yerleştirin.</li>
		<li>İğneyi portal damardan çekerken jel köpüğü pamuklu bir uçla bastırın.</li>
		<li>Aktif kanama olmadığını doğrulamak için jele yaklaşık 2 dakika basmaya devam edin.</li>
		<li>Jel köpüğün portal damarı iyi kapladığından emin olmak için pamuk ucunu jel köpüğün üzerine ve uzağına yuvarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Yöntem B: (yağ yastığı ile kanamayı durdurun, Şekil 1C)17
<ol><li>Portal damarını iyice ortaya çıkarın.<ol>
<li>Açıkta kalan portal damarı hem sol hem de sağ taraftan tutmak için iki pamuk ucu kullanın.</li>
		<li>Duodenum ve portal ven arasındaki yağ dokusu yastığını tanımlayın.</li>
		<li>İğneyi portal damara sokmadan önce yağ yastığına nüfuz edin (Şekil 1D).</li>
		<li>Yukarıda Yöntem A'nın 4.2.1 ve 4.2.2 bölümlerinde açıklanan benzer prosedürü izleyerek adacıkları demleyin.</li>
		<li>Pamuklu bir uçla yağa bastırırken iğneyi çekin.</li>
		<li>İğneyi çıkardıktan sonra yağ yastığına 1 dakika basmaya devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Portal damardan kanama olmadığını doğruladıktan sonra, bağırsağı yavaşça orijinal pozisyonunda periton boşluğuna geri döndürün.</li>
	<li>Kapatmadan önce karın boşluğunda 0,5 mL ılık salin (36-37 ° C) bırakın. NOT: Sıcak salin, ameliyat sonrası bağırsak hareketini ve iyileşmesini kolaylaştırır ve bağırsak nekrozunu önler.</li>
	<li>Kas tabakasını 5-0 dikişle kapatın.</li>
	<li>Cilt tabakasını 4-0 dikişle kapatın.</li>
	<li>Fareyi anesteziden tamamen kurtulana kadar bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin.</li>
	<li>Her 12 saatte bir analjezik (örneğin, buprenorfin 0.1 mg / kg i.p.) ve ameliyat sonrası 48 saat boyunca ek ısı sağlamaya devam edin. NOT: Adacık nakli işleminin tamamlanması yaklaşık 15-20 dakika sürmektedir.</li>
</ol>6. H&E boyama ve tüm karaciğer bölümünün fotoğrafı
<ol><li>Karaciğer perfüzyonu<ol>
<li>Fareyi yukarıda bölüm 3.1'de açıklandığı gibi anestezi altına alın.</li>
		<li>Portal damarı dikkatlice ortaya çıkarın ve inferior vena kavayı kesin.</li>
		<li>Portal ven yoluyla 20 mL% 10 paraformaldehit kullanarak karaciğeri yaklaşık 5 dakika boyunca 25G iğneli 20 mL'lik bir şırınga kullanarak manuel olarak perfüze edin18. NOT: Karaciğer perfüzyonu, karaciğer dokusundan kanı çıkarabilir ve adacık greftlerini rahatsız etmeden karaciğer fiksasyonunu iyileştirebilir.</li>
		<li>Perfüze edilmiş tüm karaciğeri diğer organlardan disseke edin.</li>
		<li>Perfüze karaciğer dokusunu 24 saat boyunca% 10 paraformaldehit içinde sabitleyin.</li>
		<li>Dokuyu parafine gömün.</li>
		<li>Her biri 5 μm kalınlığında doku kesitlerini kesin ve boyama için cam bir slayta koyun.</li>
		<li>Standart yöntemleri kullanarak H&E, insülin, fibrin ve polimorfonükleer nötrofil (PMN) boyama işlemini gerçekleştirin15,16.</li>
		<li>Tüm karaciğer bölümünü mikroskop altında tarayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+islet+transplantation+and+cell+therapy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes.</a> Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).</li>
<li>Ballinger, W. F., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+intact+pancreatic+islets+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of intact pancreatic islets in rats.</a> Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).</li>
<li>Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Ia+antigen+expression+on+murine+islet+parenchymal+cells+does+not+diminish+islet+allograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival.</a> American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).</li>
<li>Toyofuku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+T-cells+participate+in+rejection+of+islet+allografts+in+the+liver+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice.</a> Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).</li>
<li>Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+to+islet+xenografts+in+a+concordant+rat-to-mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model.</a> Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+studying+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation.</a> Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+enhances+islet+engraftment+by+suppression+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction.</a> Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).</li>
<li>Gou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+suppresses+macrophage+activation+and+promotes+islet+graft+survival+after+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. , (2020).</li>
<li>Contreras, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+preserves+functional+islet+mass+after+intraportal+transplantation%3A+A+novel+link+between+endothelial+cell+activation%2C+thrombosis%2C+inflammation%2C+and+islet+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death.</a> Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+islet+transplant+in+the+mouse%3A+functional+and+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization.</a> Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+treatment+with+carbon+monoxide+can+yield+islet+allograft+survival+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance.</a> Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).</li>
<li>Desai, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liver+histopathology+on+islet+cell+engraftment+in+the+model+mimicking+autologous+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation.</a> Islets. 9 (6), 140-149 (2017).</li>
<li>Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+formulations+of+thrombomodulin+increase+engraftment+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).</li>
<li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+improves+early+outcomes+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).</li>
<li>Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatoparenchymal+clearance+of+indocyanine+green+in+infectious+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Giornale+di+Malattie+Infettive+e+Parassitarie%22%5BJournal%5D)">Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis.</a> Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+transplantation+of+pancreatic+islets+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stem+cell+and+islet+cotransplantation%3A+Safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).</li>
</ol>

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu çalışmada, fare IIT sırasında kanamayı önleyebilen ve fare mortalitesini azaltabilen iki gelişmiş prosedür gösterilmiştir. Bu çalışma, araştırmacıların transplantasyon sonrası anlık kan aracılı enflamatuar yanıtı incelemede benzersiz olan adacık transplantasyon modelini görselleştirmelerini sağlar. IIT modeli, adacık transplantasyonuna yanıt olarak adacık hücresi sağkalımı ve hepatik iskemik yaralanmaları incelemek için ayırt edici bir modeldir19. Burada, önceki çalışmalara dayanarak prosedürü ...

Portal ven yoluyla intraportal adacık transplantasyonu (IIT), klinik ortamlarda insan adacık transplantasyonu için en sık kullanılan yöntemdir. Fare IIT modeli, adacık transplantasyonunu incelemek ve adacık transplantasyonunun etkinliğini artırabilecek umut verici girişimsel yaklaşımları test etmek için harika bir fırsat sunmaktadır1. IIT ilk olarak 1970'lerde tanımlanmış ve birkaç grup tarafından kullanılmıştır1,2,3,4,5. 20006 yılında insan adacık transplantasyonundaki atılımdan sonra popülerliğini yeniden kazanmıştır,7. Bununla birlikte, çoğu adacık nakli çalışması, kolay başarısı nedeniyle böbrek kapsülünü deneysel adacık nakli için tercih edilen bir yer olarak kullanmıştır. Aksine, IIT teknik olarak daha zordur ve adacık nakli çalışmalarında daha az sıklıkla kullanılmaktadır8,9. Bununla birlikte, IIT'den farklı olarak, böbrek kapsülü altına nakledilen adacıklar, tromboz, inflamasyon ve hepatik doku iskemisi ile karakterize acil kan aracılı enflamatuar reaksiyondan muzdarip değildir ve bu nedenle karaciğere nakledilen adacıklardan daha iyi bir işleve sahiptir. Bu nedenle böbrek kapsül modeli, insan adacık naklinde adacıkların karşılaştığı stresleri tam olarak taklit edemeyebilir10,11,12.
IIT'nin farelerdeki en önemli komplikasyonlarından biri, transplantasyon sonrası enjeksiyon bölgesinden kanamadır ve bu da farklı fare suşları arasında mortalitenin %10-30'una neden olabilir12. Bu yazıda, IIT sonrası kanamayı daha hızlı ve güvenli bir şekilde durdurmak ve fare mortalitesini azaltmak için iki rafine yaklaşım geliştirilmiştir. Bu rafine detayların görsel olarak gösterilmesi, araştırmacıların bu teknik olarak zorlu prosedürün temel adımlarını belirlemelerine yardımcı olacaktır. Ayrıca adacık greftlerinin alıcının karaciğerindeki yeri, nakledilen adacıkları taşıyan Hematoksilin ve Eozin (H&E) boyalı karaciğer dokusunun (tüm kesit) histolojik incelemesi ile belirlendi.

<table><tbody><tr><td>% 10 Nötr tamponlu formalin v / v</td><td>Fisher Scientific</td><td>23426796</td><td></td></tr><tr><td>1 mL İğneli Şırınga</td><td>AHS</td><td>AH01T</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Şırınga</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>25G x 5/8 "hipodermik iğneler</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Alkol hazırlama pedleri, steril</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Hayvan Anestezisi sistem</td><td>VetEquip, Inc.</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>Buprenorfin hidroklorür, enjeksiyon</td><td>Par Steril Ürünler, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Corning</td><td>15110CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, mutlak (200 kanıt), moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>Ekstra ince Mikro Diseksiyon makası 4 "düz keskin</td><td>Roboz Cerrahi Alet A.Ş.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle&nbsp; Glikoz ölçer</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle Kan Şekeri test şeritleri</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>Jel Köpük (emilebilir jelatin sünger, USP)</td><td>Pharmacia & Upjohn Company</td><td>34201</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forseps 4 "ekstra hassas uç</td><td>Roboz Cerrahi Alet A.Ş.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>Isıtmalı ped</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Hegar-Baumgartner İğne Tutucu 5.25"</td><td>Roboz Cerrahi Alet A.Ş.</td><td>RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>27 gauge iğneli insülin şırıngası</td><td>BD</td><td>879588</td><td></td></tr><tr><td>İyot hazırlama pedleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Piramal Yoğun Bakım</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin (P / S)</td> <td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Sütür 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Sütür 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür, %0.9 intravenöz solüsyon</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>Streptozocin (STZ)</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi örtü, steril</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kaseti</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde İntrahepatik adacık transplantasyonu sırasında İnfüzyon sonrası portal ven kanamasının en aza İndirgenmesi

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Karaciğer günümüzde klinik ortamlarda insan adacıkları için birincil transplantasyon alanı olarak kabul edilmekle birlikte, çoğu kemirgen preklinik adacık transplantasyonu çalışmasında adacıklar böbrek kapsülü altında nakledilmektedir. Bu model yaygın olarak kullanılır, çünkü murin intrahepatik adacık transplantasyonu teknik olarak zordur ve farelerin yüksek bir yüzdesi cerrahi komplikasyonlardan, özellikle de nakil sonrası enjeksiyon bölgesinden kanamadan ölebilir. Bu çalışmada, infüzyon sonrası portal ven kanaması insidansını en aza indirgeyebilecek iki prosedür gösterilmiştir. İlk yöntem, enjeksiyon bölgesine emilebilir hemostatik jelatin sünger uygular ve ikinci yöntem, adacık enjeksiyon iğnesinin önce yağ dokusundan sonra da kanamayı durdurmak için fiziksel bir bariyer olarak yağ dokusunu kullanarak portal venin içine nüfuz etmesini içerir. Her iki yöntem de kanamaya bağlı fare ölümünü etkili bir şekilde önleyebilir. Adacık dağılımını gösteren tüm karaciğer kesiti ve intrahepatik adacık transplantasyonu için tipik bir özellik olan transplantasyon sonrası adacık trombozu bulguları sunuldu. Bu geliştirilmiş protokoller, intrahepatik adacık transplantasyon prosedürlerini hassaslaştırır ve laboratuvarların adacık sağkalımını incelemek ve klinik öncesi ortamlarda işlev görmek için prosedürü oluşturmasına yardımcı olabilir.

Portal ven üzerinden sinjenik ve ksenojenik adacık nakilleri gerçekleştirdik. Her iki adacık transplantasyon modelinde de adacık greft fonksiyonu doza bağımlı olarak gözlendi. C57BL / 6 fareleri kullanan sinjenik adacık transplantasyonu modelinde, 250 adacığın transplantasyonu, fareler hiperglisemiye dönmeden önce geçici normoglikemiye yol açtı. 500 adacık alan fareler, transplantasyondan sonraki 30 günden fazla normoglisemine ulaştı ve korudu (Şekil 2A). Her iki gruptaki fareler vücut ağırl...

Burada, farelerde klinik olarak ilgili ancak teknik olarak zorlayıcı bir cerrahi prosedür olan intraportal adacık transplantasyonunun başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için rafine cerrahi prosedürler sunulmaktadır.

Farelerde İntrahepatik Adacık Transplantasyonu Sırasında İnfüzyon Sonrası Portal Ven Kanamasının En Aza İndirgenmesi

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

Karaciğer, insan adacığı klinik ortamında transplantasyon için birincil bölgedir. Fare intrahepatik adacık transplantasyonu teknik olarak zordur ve farelerin yüksek bir yüzdesi cerrahi komplikasyonlardan, özellikle kanamadan ölebilir. Bu çalışmada, her ikisini de gösterdiğimiz iki yöntem, kanamaya bağlı fare ölümünü etkili bir şekilde önleyebilir.Yöntemimiz, kanser hücrelerinin, mezenkimal kök hücrelerin ve hepatositin doğrudan karaciğere enjekte edilmesine izin vererek karaciğer kanseri ve diğer karaciğer hastalıklarında araştırmalara uygulanabilir. Başlamak için, bir insan adacık kültürünü nazik tırmalama ile ayırın. Buz üzerinde steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine 300 ila 350 adacık seçmek için 1 santimetreküp şırınga kullanın.Tüm adacıklar toplandığında, hücreleri çökeltmek için tüpleri 10 saniye boyunca santrifüj yapın. Pelet kaybını önlemek için küçük bir süpernatant hacmi dışında hepsini atın ve% 5 BSA içeren 200 mikrolitre HBSS'de adacıkları yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan adacıkları 5 mililitrelik bir insülin şırıngasına yükleyin ve adacıkların pistona yerleşmesine izin vermek için şırınga iğnesini 1 dakika boyunca çevirin.Herhangi bir kabarcığı çıkarmak için pistonu bastırın, şırıngada yaklaşık 100 ila 150 mikrolitre çözelti tutun ve adacıkları eşit şekilde dağıtmak için şırıngayı hafifçe dokunarak ters çevirin. Pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, kurumayı önlemek için gözlere merhem sürün. Kürkü çıkarmak için anestezi uygulanan farenin karnını tıraş edin ve cerrahi bölgeyi üç alternatif 2% iyot ve% 75 alkol mendili ile dezenfekte edin.Daha sonra, karın içinde 1 ila 1,5 santimetrelik bir kesi yapın ve periton boşluğunu açın. Kesinin etrafına steril bir gazlı bez parçası yerleştirin ve bağırsağı nazikçe gazlı bez üzerine aktarmak için forseps veya pamuklu uçlar kullanın. Daha sonra bağırsağı bir parça tuzlu suyla ıslatılmış gazlı bezle örtün ve portal damarı açığa çıkarın.Jel köpük kullanarak adacık transferine bağlı kanamayı durdurmak için, iğneyi eğim aşağı bakacak şekilde tutun ve iğneyi portal damara sokmadan önce iğne ucunu portal damar duvarına paralel olarak açıklıkla konumlandırın. Pistonu tekrar tekrar bastırıp geri çekerken adacıkları portal damara damlatmadan önce adacıklarla karıştırmak üzere şırıngaya 20 ila 50 mikrolitre kan çekmek için pistonu geri çekin. Tüm adacıklar teslim edildiğinde, enjeksiyon bölgesine yaklaşık 5 x 5 santimetrelik bir jel köpük parçası yerleştirin.İğneyi portal damardan çıkarırken jel köpüğü bastırmak için pamuklu bir uç kullanın. Jeli yaklaşık 2 dakika yerinde tutun, portal damarı kapladığından emin olmak için jel köpüğü yuvarlayın. Kanama durdurulduktan sonra, bağırsağı yavaşça orijinal pozisyonda periton boşluğuna geri döndürün ve karın boşluğuna 500 mikrolitre ılık salin enjekte edin.Kas ve cilt katmanlarını kapatmak için dikişler kullanın. Daha sonra fareyi, anesteziden tamamen iyileşene kadar izleyen, her 12 saatte bir analjezi uygulayan ve 48 saat boyunca ısıtan bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin. Bir yağ yastığı kullanarak adacık transferine bağlı kanamayı durdurmak için, portal damarı gösterildiği gibi açığa çıkardıktan sonra, maruz kalan damarı sol ve sağ taraflarda tutmak için iki pamuklu uç kullanın ve duodenum ve portal ven arasındaki yağ dokusu pedinin yerini belirleyin.Portal damara yerleştirmeden önce yağ yastığına iğne ucu ile nüfuz edin. Adacıkları gösterildiği gibi portal damarına aşılayın. Tüm adacıklar teslim edildiğinde, iğneyi damardan çıkarırken yağ dokusunu pamuk ucu ile yaklaşık 1 dakika bastırın.Daha sonra bağırsağı karın boşluğuna geri döndürün ve gösterildiği gibi cerrahi sonrası bakım prosedürlerinin geri kalanını gerçekleştirin. Adacık transplantasyonunun etkileri doza bağımlıdır, çünkü 500 adacık transfer edildiğinde sinjenik adacık transplantasyonundan 30 gün sonra normal glisemi gözlenir, ancak 250 adacık teslim edildiğinde sadece geçici normoglikemi gözlenir, fareler nakil sonrası 10 gün sonra hiperglisemiye geri döner. Her iki grupta da artan bir vücut ağırlığı gözlenir ve insan adacıkları diyabetik NOD-SCID farelere nakledildiğinde aynı tepkiler gözlenir, daha fazla sayıda adacık eşdeğeri nakledildiğinde normoglisemi gözlenir, ancak daha az sayıda değil.Transfer sonrası kanaması olan farelerin çoğunluğu ameliyattan sonra ölürken, kanaması olmayan fareler hayatta kalır. Transplantasyondan sonraki 28 günde, insülin boyaması, insan adacığının karaciğer boyunca, çoğunlukla kan damarlarına yakın eşit bir dağılımını ortaya koymaktadır. İnsüline ek olarak, nakledilen insan adacıklarında fibrin ve polimorfonükleer hücre filtrasyonu da gözlenir.İntrahepatik adacık transplantasyonu, portal vende kanamaya neden olabilecek büyük bir delik oluşturacaktır. İki gelişmiş prosedürümüzü kullanmak kanamayı önleyebilir ve adacık nakli sonrası mortaliteyi azaltabilir. İntraportal adacık transplantasyonu modeli klinik insan adacık transplantasyonunu taklit edebilir.Rafine edilmiş prosedürlerimiz, alıcılar için daha yüksek sağkalım oranlarına yol açabilir ve bu da transplantasyondan sonra daha fazla adacık fonksiyonu çalışmasına izin verir.

minimizing-post-infusion-portal-vein-bleeding-during-intrahepatic

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, meme tümör hücrelerini portal ven enjeksiyonu yoluyla murin karaciğerine iletmek için kullanılan cerrahi bir prosedür açıklanmaktadır. Bu model, karaciğer metastazının geç evrelerinin araştırılmasına izin verir.

Portal Ven Enjeksiyonu: Karaciğere Kanser Metastazı Çalışmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, pankreas adacık hücrelerini hepatik portal ven içine infüze etmek için bir prosedürü ve ardından kanamayı başarılı bir şekilde önlemek için jel köpük uygulamasını açıklıyoruz. Postoperatif kanama, adacık nakli sırasında sık görülen yüksek mortalite nedenidir.

Adacık Transplantasyonunda Murin Modeli: Pankreas Adacıklarının Portal Ven İçine İnfüzyonu ve Postoperatif Kanamanın Önlenmesi İçin Cerrahi Bir Yöntem

Vasküler rejenerasyonu görselleştirmek için kullanılan aletler, vasküler ağaçları kontrastlamak için yöntemler gerektirir. Bu film, vasküler ağaçların optimal kontrastını elde etmek için kullanılan hassas bir enjeksiyon tekniğini gösterdi ve elde edilen örneğin μCT ve histolojik seri kesitler kullanılarak ayrıntılı bir analizinden kaynaklanan potansiyel faydaları gösterdi.

Normal Farelerde% 70 hepatektomi sonrası Vasküler ve Parankimal Rejenerasyon görselleştirme

Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Bir mouse adacıkları omental nakli için bir yöntem tanıttı. İzole adacıkları hidrojel ile karıştırılır ve karışımı bir diyabetik fare omental kese yerleştirilir. Daha sonra kan şekeri izlenir ve IMMUNO-histochemical çözümleme yapılır.

Adacık nakli için Mouse omentumun için bir yöntemi

Pankreas adacık nakli normoglycemia tip 1 diyabet için bir yoludur. Bu makale nakli tekniği normal glikoz düzeyleri diyabetik farelerde korumak için intraportal rota üzerinden üzerinde duruluyor.

İntraportal fare modeli pankreas adacıkları nakli

Bu protokolde inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna murine adacık izolasyonu ve transplantasyon yöntemi tanımlanmıştır. İzole syngeneic murine adacıkları bir murine alıcı içine bir bodrum membran hidrojel kullanılarak nakledilir. Alıcıların kan şekeri düzeyi izlenir ve adacık greftlerinin histoloji analizi yapılır.

Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları

Bu protokolün amacı sürekli insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamikleri ve donör hücrelere karşı katkıda konak izlemektir. Bu bir NOD gözün ön odasına (ACE) insan adacıkları nakli ile gerçekleştirilir. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-fare alıcısı ve ardından tekrarlanan 2-foton görüntüleme.

Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal

Protokol, portal ven perfüzyonu yoluyla metabolik çalışmalar için sağlam bir fare karaciğerini rezeke etmenin basit bir yöntemini açıklar.

Eski Vivo Farede Portal Damarından Hepatik Perfüzyon

Hepatik insülin klerensi, glikoz homeostazını düzenlemek için kritik öneme sahiptir. Bu makale, farelerde yerinde karaciğer insülin klerens oranını doğrudan değerlendirmek için kullanıcı dostu bir hepatik perfüzyon prosedürünü açıklamaktadır.

Farelerde İnsitülin Klerensinin Yerinde Karaciğer Perfüzyonu ile Değerlendirilmesi

Burada, olası karışıklıkların azaltılması ile endokrin pankreas fonksiyonunu değerlendirmek için ek bir teknik olarak, sağlam bir pankreas ile fare damar sistemi yoluyla perfüzyon yoluyla glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu (GSIS) gerçekleştirme hakkında ayrıntılar sunuyoruz.

Sağlam Bir Pankreas ile Farelerin Damar Sisteminden Perfüzyon Yoluyla Glikozla Uyarılan İnsülin Sekresyonu

Öğrenin farelerde intrahepatik adacık transplantasyonu sırasında portal ven kanamasını önlemek için geliştirilmiş cerrahi teknikleri. Bu yöntemler karaciğer kanseri ve diğer karaciğer hastalıkları araştırmalarında yüksek sağkalım oranları sağlar.

Farelerde İntrahepatik Adacık Transplantasyonu Sırasında İnfüzyon Sonrası Portal Ven Kanamasının En Aza İndirgenmesi

Daha fazla video keşfet