Name: Vitro ve Omurilikte Floresan Etiketli Küçük Hücre Dışı Veziklin Alımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Öğrenin, PKH boyalarıyla etiketlenmiş makrofaj kaynaklı küçük ekstraselüler veziküllerin (sEV) in vitro ve omurilikte alımını görselleştirme yöntemini. Bu protokol, spinal ağrı ve inflamasyon gibi hastalıklarda sEV'lerin terapötik potansiyelini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH NINDS R01NS102836 ve Seena K. Ajit'e verilen Pennsylvania Sağlık Bakanlığı Commonwealth Evrensel Araştırma Geliştirme (CURE) hibeleri ile desteklenmiştir. Dr. Bradley Nash'e makaleyi eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz.

NOT: Tüm prosedürler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu'na uygun olarak gerçeklatılmış ve Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Zamanlanmış hamile CD-1 fareler astrositik kültür için kullanıldı ve tüm barajlar emprenye edildikten 15 gün sonra alındı. In vivo alım deneyleri için 10-12 haftalık C57BL/6 fareler kullanıldı.
1. SEV'lerin RAW 264.7 makrofaj hücrelerinden yalıttırılır
<ol><li>Kültür RAW 264.7 hücre 75 cm2 şişelerde DMEM ekzozom-tükenmiş ortamda% 10 ekzozom tükenmiş fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisinin (kalem strep) 24-48 saat.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika boyunca 300 × g'da 300 mL şartlandırılmış orta ve santrifüj toplayın.</li>
	<li>4 °C'de 20 dakika boyunca 2.000 g'da 2.000 ×'da süpernatant ve santrifüjü toplayın.</li>
	<li>Süpernatantı santrifüj tüplerine, santrifüjü 12.000 × g'da 4 °C'de 35 dakika aktarın.</li>
	<li>Süpernatantı toplayın ve 0,22 μm şırındi filtresinden filtreleyin.</li>
	<li>4 °C'de 110.000 g'da 80 dakika ultracentrifuge tüplere × ve santrifüje aktarın.</li>
	<li>Süpernatantı (eksozom tükenmiş ortam) saklayın, peleti 2 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve santrifüjü 110.000 × g 4 °C'de 1 saat boyunca yeniden depolayın.</li>
	<li>Nanopartikül izleme analizi (NTA) ve iletim elektron mikroskopisi (TEM) veya batı şişkinliği için radyoimmün önkeklilik tahlil (RIPA) tamponu kullanılarak daha fazla karakterizasyon için peleti 100 μL PBS'de yeniden atın.</li>
</ol>2. SEV'lerin karakterizasyonu
<ol><li>Nanopartikül izleme analizi (NTA) NOT: RAW 264.7 hücrelerinden arındırılmış sEV'lerin boyut dağılımı ve partikül sayısı/konsantrasyonu NTA ile ölçüldü.<ol>
<li>Optimum izleme için görüş alanı başına 20-60 veziklin elde etmek için sEJ'leri filtrelenmiş PBS'de seyreltin.</li>
		<li>Seyreltilmiş numuneyi sabit bir akış hızına sahip bir şırınna pompası kullanarak bir akış hücresine sokun.</li>
		<li>Her biri 30 sn'lik 3-5 video çek. Deklanşör hızını ve kazancını ayarlayın ve kamera ayarlarını görünür ve izlenebilecek ve analiz edilebilecek maksimum sayıda vezikül için manuel olarak odaklayın.</li>
		<li>Çoğaltma ölçümleri gerçekleştirmek için örnekleri her kayıt arasında ilerletin. NTA alım sonrası ayarlarını optimize edin ve ayarları örnekler arasında sabit tutun.</li>
		<li>Veziklinlerin ortalama boyutunu ve konsantrasyonu elde etmek için NTA yazılımını kullanarak her videoyu analiz edin.</li>
		<li>Tutarlılık için tüm NTA ölçümlerini aynı sistem ayarlarıyla gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Batı lekesi<ol>
<li>Üreticinin talimatlarını takip eden bir protein test kiti kullanarak SEV'lerdeki, hücre lizazlarındaki ve ekzozom tükenmiş ortamlardaki toplam protein miktarlarını ölçün.</li>
		<li>Hücre lysate hazırlanması için, RAW 264.7 hücrelerini 75 cm2 şişelerde% 80-90 birleştiği zamana kadar kültür edin. Hücreleri 10-15 dakika boyunca% 0.25 tripsin ile ayırın, tripini kültür ortamıyla nötralize edin ve 5 dakika boyunca 400 × g'da dönerek hücreleri peletin. Hücreleri taze büyüme ortamında yeniden biriktirin.</li>
		<li>Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 1 × 106 hücreyi başka bir tüpe aktarın. Yukarıdakiyle aynı santrifüjleme koşullarını kullanarak hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve son dönüşten itibaren hücre peletine 50 μL lizis tamponu (proteaz inhibitörü kokteyli ekli RIPA tamponu) ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri girdaplayın ve 20 dakika boyunca buzda tutun. Karışımı 4 °C'de 30 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüje maruz koyun, süpernatantı (yani lisatı) taze mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve kullanıma kadar −80 °C'de tutun.</li>
		<li>Protein miktarını ölçmeden önce 3 kDa kesme santrifüj filtreleri kullanarak 2 mL eksozom tükenmiş ortamı 100 μL'ye konsantre edin. SEV'leri lizis tamponu ile 1:1 oranında, girdapta 30 sn karıştırın ve protein miktarını ölçmek için 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numune tamponunun azaltılmasıyla eşit miktarda sEV, RAW 264,7 hücre lizatı ve eksozom tükenmiş ortamı karıştırın.</li>
		<li>Örnekleri 95 °C'de 5 dakika denature, 5 dakika buzda tutun ve 10.000 × g'da 2 dakika döndürün. Numuneleri% 12 Tris glisinin protein jelini yükleyin ve jeli 125 V'ta 45 dakika çalıştırın.</li>
		<li>Proteini 2 saat boyunca 25 V'ta bir polivinylidene difluorid (PVDF) membranına aktarın.</li>
		<li>Aktarımı takiben, PVDF membranlarını oda sıcaklığında 1 saat boyunca engelleme tamponu ile engelleyin (Malzeme Tablosunabakın).</li>
		<li>Blot'u 4 °C'de bir gecede bir çalkalayıcı üzerinde birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. NOT: Kullanılan primer antikorlar anti-CD81 (1:1.000), anti-alfa-1,3/1,6-mannosyltransfeaz (ALG-2)-etkileşim proteini X (Alix) (1:1:000) 1.000), anti-Calnexin (1:1.000) ve anti-gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) (1:1.000).</li>
		<li>Lekeleri 1x Tris tamponlu salin, %0,1 Ara 20 (TBST) ile 3 x 15 dk yıkayın ve oda sıcaklığında keçi anti-fare IgG-yaban turpu peroksidaz (HRP) veya eşek anti-tavşan IgG-HRP-konjuge ikincil antikorlar (1:10,000) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Lekeleri 3 x 15 dk 1x TBST ile yıkayın ve proteinleri bir HRP substratı kullanarak tespit edin.</li>
		<li>Batı leke görüntüleyicısı kullanarak gelişmiş chemiluminescence ile lekeleri analiz edin.</li>
	</ol></li>
	<li>İletim elektron mikroskopisi (TEM)<ol>
<li>SEV'leri 0,1 M fosfat tamponunda (PB) %2 paraformaldehit (PFA) olarak yeniden oluşturarak düzeltin; 2 x 15 sn için girdap.</li>
		<li>Temiz parafilme 10 μL sEV süspansiyonu yerleştirin. Karbon kaplı formvar ızgarasını, kaplamalı tarafı süspansiyona bakacak şekilde damla üzerinde yüzdürülür. Membranların kuru bir ortamda 20 dakika emici olduğuna izin verin.</li>
		<li>Izgaraları (membran tarafı aşağı) 3 x 2 dakika yıkamak için bir damla PB üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Izgaraları 5 dakika boyunca% 1 glutaraldehitin 50 μL'sine aktarın.</li>
		<li>Izgaraları 100 μL damıtılmış su ile 8 x 2 dakika yıkayın.</li>
		<li>Izgaraları 2 dakika boyunca% 1 uranil asetat damlasına yerleştirerek numuneyi karşılaştırın.</li>
		<li>Numuneyi 50 μL%0,2 uranil asetat ile %2 metilselüloz çözeltisi ile parafilm kaplı bir buz kabına 10 dakika boyunca gömün.</li>
		<li>Izgaraları tutmak ve fazla sıvıyı filtre kağıdıyla çıkarmak için paslanmaz çelik halkalar kullanın.</li>
		<li>Hala döngüdeyken ızgarayı 10 dakika boyunca havayla kurulayın.</li>
		<li>80 kV'da bir iletim elektron mikroskobu altında gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. SEV'lerin etiketlenerek etiketlenerek
<ol><li>Boya kontrolü için 1 mL seyreltici tamponda 20 μg SEV veya 1 mL seyreltici tamponda aynı hacimde PBS seyreltin.</li>
	<li>3 μL PKH67 veya PKH26 boyasını 1 mL seyreltici tamponda seyreltin ve pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Seyreltilmiş SEV'lere seyreltilmiş PKH boyası ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Oda sıcaklığında karanlıkta 5 dakika kuluçkaya yatırın. Boya kontrolü için, seyreltilmiş boyayı adım 3.1'den seyreltilmiş PBS ile karıştırın.</li>
	<li>PBS'deki %1 sığır serum albüminin (BSA) 2 mL'sini boya ve sEV karışımı ile tüpe ve fazla boyayı emmek için boya kontrol tüpüne ekleyin.</li>
	<li>110.000'de 1 saat × 4 °C'de g için santrifüj. Süpernatantı atın, peleti 2 mL PBS'de yeniden atın ve 110.000'de 1 saat santrifüj × 4 °C'de g. Yıkamayı PBS ile tekrarlayın ve etiketli sEV'leri veya boya kontrolünü eşit miktarda PBS'de yeniden diriltin.</li>
	<li>Bradford yöntemiyle toplam protein miktarını ölçün.</li>
</ol>4. SEV'lerin Nöro-2a hücreleri tarafından alınması
<ol><li>18 mm'lik kapakları 12 kuyulu bir plakaya ve plaka 10 ×10 4 Nöro-2a hücresine% 10 FBS ve% 1 kalem strep içeren toplam 1 mL komple DMEM ortamına yerleştirin.</li>
	<li>Hücre konfülüzyonu %80-90 olduğunda ortamı DMEM eksozom tükenmiş ortam olarak değiştirin. Doz ve zamana bağlı alım için her kuyuya 1, 4 ve 24 saat boyunca 1, 5 veya 10 μg etiketli sEV ekleyin veya eşit miktarda boya kontrolü ekleyin.</li>
</ol>5. Birincil astrositik kültürler
<ol><li>Doğumdan 4 gün sonra hipotermi başlatarak 4 postnatal yavruyu uyuşturmak.</li>
	<li>Beyinleri, 10 mM 4-(2-hidroksetil)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ile desteklenmiş buz gibi Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren 60 mm'lik bir Petri kabında toplayın.</li>
	<li>Her iki kortikal lobun da inceksini alın ve menenjileri çıkarın. Dokuları sterilize edilmiş bir bıçakla kıyma.</li>
	<li>Dokuları papain/deoksiribonükleaz I ayrıştırma tamponu içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın ve 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Her 5 dakikada bir döndürün. NOT: 4 fare kortiği için, HBSS'deki 9 mL 7,5 U/mL papain, 37 °C'de en az 30 dakika boyunca etkinleştirilir, 0,22 μm şırıng filtresinden süzülür ve deoksiribonükleaz I ile 0,1 mg/mL'lik son konsantrasyona karıştırılır.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve enzim aktivitesini inaktive etmek için 5 mL tam DMEM ekleyin. Dokuları 5 mL cam serolojik pipet ve alev cilalı Pasteur pipet ile ayrıştırmak için dikkatlice tritüre edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 40 μm hücre süzgecinden geçirin ve hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 × g'da santrifüj edin. Ortamı epire edin ve hücreleri 75 cm2 şişede 10 mL tam DMEM'de tohumlayın. Kaplamadan sonra süpernatant ortamı 15 mL taze DMEM ortamı 4 saat ile değiştirin.</li>
	<li>14 gün in vitrosonra, mikroglia ve oligodendrositleri 320 rpm'de 6 saat boyunca ayırmak için şişeyi yörüngesel bir çalkalayıcıya aktarın.</li>
	<li>Kalan astrositleri 37 °C'de 10 dakika boyunca hücre ayrışmaenziminin (Malzeme Tablosu)5 mL'si kullanılarak deneyin. Enzimatik eylemi devre dışı bırakmak için 5 mL tam DMEM ekleyin ve hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 × g'da peletleyin.</li>
	<li>Hücreleri tam DMEM'de yeniden biriktirin. Tohum 5 ×10 4 hücre üzerinde 12 mm #1.5 kapaklar üzerinde 24 kuyulu bir plaka.</li>
</ol>6. SEV'lerin astrositler tarafından alınması
<ol><li>Astrositler %80-90 izdiah süresine ulaştığında, ortamı DMEM eksozom tükenmiş ortam olarak değiştirin.</li>
	<li>Hücrelere 1 μg etiketsiz, etiketli sEV, eşit miktarda boya kontrolü veya PBS ekleyin. SEV tedavisinden sonra 1 saat ve 24 saat boyamak için hücreleri kullanın.</li>
</ol>7. İmmünoresans
<ol><li>Hücreleri PBS 3x ile durulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PB'de% 4 PFA ile sabitlayın.</li>
	<li>Sabit hücreleri PB ile 3 x 5 dk yıkayın ve PB'de %0,1 Triton X-100 kullanarak 10-15 dk boyunca dengelerini bozun ve PB 3 x 5 dk ile yıkayın.</li>
	<li>PB'de %5 normal keçi serumu (NGS) bulunan hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca tıkayın.</li>
	<li>Hücreleri birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın: Nöro-2a hücreleri için mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2A, 1:500) veya 4 °C'de bir gecede taze % 5 NGS/PB'de birincil astrositler için glial fibril asidik protein (GFAP, 1:500) nazik titreme ile.</li>
	<li>PB ile 3 x 10 dakika yıkayın ve floroforla konjuge ikincil antikorlar ekleyin (Keçi Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; veya Keçi Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) % 5 NGS'de ve bir rocker'da oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PB ile 3 x 10 dk yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1 μg/mL nükleer leke 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile kuluçkaya yatırın. Hücreleri PB ile 3x tekrar yıkayın.</li>
	<li>Kapakları bir antifade montaj ortamı kullanarak 1 numaralı slaytlara monte edin. Karanlıkta gece boyunca kurumalarını bekleyin ve hazırlanan cam slaytları konfokal mikroskopta görüntülemeye kadar 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>8. SEV'lerin in vivo alımı
<ol><li>C57BL/6 farelere 10 μL PBS'de yeniden 5 μg etiketli veya etiketli sEV'lerin intratekal enjeksiyonu veya eşit hacimli (10 μL) boya kontrolü (bölüm 3'te hazırlandığı gibi) gerçekleştirin.</li>
	<li>SEV'lerin enjeksiyonundan 6 ve 18 saat sonra, 100 mg / kg vücut ağırlığı ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığı ksilazinin intraperitoneal enjeksiyonu ile fareleri derinden uyuşturun.</li>
	<li>Kanı temizlemek için% 0.9 salin ile farelerin intrakardiyal perfüzyonunu gerçekleştirin, ardından taze yapılmış buz gibi% 4 PFA / PB.</li>
	<li>Omuriliği parçalara ayrıştırın ve 24 saat boyunca 4 °C'de %4 PFA/PB'de sabitlenin. Dokuları PB'de % 30 sakkarozda 24 saat boyunca veya dokular batana kadar 4 °C'de kriyoprotect. Dokuları immünostokimyaya kadar 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>9. İmmünohistokinoloji
<ol><li>L4-L5 omuriliğini O.C.T bileşiğine gömün. Tamamen katılanınya kadar kuru buz üzerinde dondurun.</li>
	<li>Dokuları bir kriyostat kullanarak 30 μm'de (omurilik için kesitsel olarak) bölümlere koyun ve bölümleri PB içeren 24 kuyulu bir plakada toplayın. Pb'de %0,3 Triton ile bölümleri 3 x 5 dk yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 2 saat boyunca %0,3 Triton/PB'de %5 NGS ile spesifik olmayan bağlama bölgelerini engelleyin.</li>
	<li>Birincil antikorları seyreltin: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1.000), mikroglia için Iba1 (1:2.000) ve % 5 NGS ile% 0.3 Triton / PB ve bölümleri bir gecede 4 ° C'de bir çalkalayıcıda kuluçkaya bırakın.</li>
	<li>Bölümleri %0,3 Triton/PB ile 3 x 5 dk yıkayın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca %5 NGS/PB'de ikincil antikorlar (Eşek Anti-Tavşan IgG Alexa Fluor 488, 1:500 veya Keçi Fare Önleyici IgG Alexa Fluor 488, 1:500) ekleyin.</li>
	<li>PB ile 3 x 5 dakika yıkayın ve bölümleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1 μg / mL DAPI'da kuluçkaya yatırın. 3 x 5 dk bölümleri PB ile yıkayın.</li>
	<li>Bölümleri hafif bir mikroskop altında ince bir boya fırçası ile temiz bir yapışkan kaydırakta(Malzeme Masası)monte edin.</li>
	<li>Kapak kapağını montaj ortamı ile ıslatın. Oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca tedavi edin.</li>
	<li>İlgili lazerlerle konfokal mikroskop altında görüntü.</li>
</ol>

<ol><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).</li>
<li>Betzer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+strategies+for+in+vivo+tracking+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594(2020).</li>
<li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li>
<li>González, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+labeled+fluorescent+exosomes+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications.</a> Biomedicines. 9 (1), 81(2021).</li>
<li>Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extracellular+vesicles%3A+current+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91(2018).</li>
<li>vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li>
<li>Heinrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+using+dialkylcarbocyanine+dyes+for+cell+tracing+in+hard+and+soft+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+B%2C+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).</li>
<li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+model+of+acute+kidney+injury+monitored+by+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).</li>
<li>Wiklander, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+in+vivo+biodistribution+is+determined+by+cell+source%2C+route+of+administration+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316(2015).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6 (1), 7029(2015).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+and+uptake+of+exosomes+by+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 11, 108(2011).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+exosomes+and+ferritin+protein+nanocages+for+the+delivery+of+membrane+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics.</a> Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+in+the+brain%3A+Biomarker%2C+messenger+or+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator.</a> Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).</li>
<li>De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+exosomes+in+normal+and+pathological+conditions%3A+new+insights+for+diagnosis+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).</li>
<li>Matsumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+alpha-synuclein-containing+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+across+the+blood-brain+barrier+via+adsorptive+mediated+transcytosis%3A+another+mechanism+for+initiation+and+progression+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71(2017).</li>
<li>Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transport+mechanism+of+extracellular+vesicles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier.</a> Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).</li>
<li>Shaimardanova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+the+diagnosis+and+treatment+of+central+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases.</a> Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Hoen, E. N. M. N. -t, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+in+vivo+imaging+of+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 169(2018).</li>
<li>Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+tracking+of+lymphocytes+in+vivo%3A+the+migration+of+PKH-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes.</a> Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).</li>
<li>Kuffler, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+sprouting+in+culture+by+motoneurons+isolated+from+the+spinal+cord+of+adult+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs.</a> Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Pužar Dominkuš, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKH26+labeling+of+extracellular+vesicles%3A+Characterization+and+cellular+internalization+of+contaminating+PKH26+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).</li>
<li>Shimomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+lipophilic+fluorescent+dyes+for+labeling+extracellular+vesicles%3A+characterization+and+monitoring+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).</li>
<li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li>
<li>Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+taken+up+by+neurons+hijack+the+endosomal+pathway+to+spread+to+interconnected+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10(2018).</li>
<li>Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+specificity+of+HEK293T+extracellular+vesicle+uptake+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry.</a> Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Bu protokolde SEV'lerin PKH boyalarla etiketlenmesi ve omurilikteki alımlarının görselleştirilmesini gösterdik. PKH lipofilik floresan boyalar, akış sitometrisi ve floresan mikroskopi 3 , 5 ,6,12,24,25ile hücreleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Nispeten uzun yarı ömürleri ve düşük sitotoksiklikleri nedeniyl...

Küçük hücre dışı veziklinler (sEV'ler) 50-150 nm boyut aralığına sahip nanosized, membran türevi veziklinlerdir. Çok araçlı cisimlerden (MVB' ler) kaynaklanırlar ve MVB'lerin plazma zarı ile füzyonu üzerine hücrelerden salınırlar. sEV'ler miRNA'lar, mRNA'lar, proteinler ve biyoaktif lipitler içerir ve bu moleküller hücreler arasında hücreden hücreye iletişim şeklinde aktarılır. sEV'ler alıcı hücreler tarafından çeşitli endosit yollar tarafından içselleştirilebilir ve sEV'lerin alıcı hücreler tarafından bu şekilde yakalanması, hem EV'lerdeki hem de hedef hücrelerdeki yüzey moleküllerinin tanınması ile aracılık eder1.
SEV'ler, kabul eden hücrelerde moleküler ve fenotipik değişiklikleri tetikleme kapasiteleri, terapötik bir ajan olarak yararları ve kargo molekülleri veya farmakolojik ajanlar için taşıyıcı olarak potansiyelleri nedeniyle ilgi kazanmıştır. Küçük boyutları nedeniyle, sEV'lerin görüntülenmesi ve izlenmesi, özellikle in vivo çalışmalar ve klinik ayarlar için zor olabilir. Bu nedenle, biyodistribution ve in vitro ve in vivo 2 izlemelerine yardımcı olmak için sEV'leri etiketlemek ve görüntülemek için birçok yöntem geliştirilmiştir. 
SEV biyodistribasyon ve hedef hücre etkileşimlerini incelemek için en yaygın teknik, floresan boya molekülleri 3 , 4,5,6,7ile etiketlemeyi içerir. EV'ler başlangıçta hücreleri görüntülemde yaygın olarak kullanılan hücre zarı boyaları ile etiketlenmiştir. Bu floresan boyalar genellikle lipid bilayer veya sEV'lerde ilgi çekici proteinleri lekeler. Birkaç lipofilik boyalar, DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′,-tetrametindotricarbocyanine iyodür), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3), dahil olmak üzere sitozol içine dahil edildiğinde güçlü bir floresan sinyal gösterir. 3, 3′, 3′-tetrametrin indokarboksiyanine perklorat), ve DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indokarboksiyanin 4-klorobenzenesulfonat tuzu)8,9,10,11.
PKH67 ve PKH26 gibi diğer lipofilik boyalar, son derece floresan bir polar kafa grubuna ve herhangi bir lipit yapısına kolayca karışan ve uzun süreli boya tutma ve stabil floresan12'yeyol açan uzun bir alifatik hidrokarbon kuyruğuna sahiptir. PKH boyaları, VIVO13'tekiEV özelliklerinin incelenmesine izin veren EV'leri deetiketleyebilir. Floresan mikroskopi ve akış sitometrisi kullanarak ekzomları gözlemlemek için başka birçok boya kullanılmıştır, lipid etiketleme boyaları14 ve karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDA-SE)15,16 ve calcein asetoksimetil (AM) ester17gibi hücre geçirgen boyalar dahil.
CNS'deki farklı hücreler arasında sEV aracılı çapraz konuşma çalışmaları nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezine dair önemli içgörüler sağlamıştır18. Örneğin, nöronlardan gelen SEV'ler beta-amiloid peptitleri ve fosforillenmiş tau proteinlerini yayabilir ve Alzheimer hastalığının patogenezine yardımcı olabilir19. Ek olarak, eritrositlerden elde edilen EV'ler büyük miktarlarda alfa-sinüklein içerir ve kan-beyin bariyerini geçebilir ve Parkinson patolojisine katkıda bulunabilir20. SEV'lerin fizyolojik engelleri21'i geçebilmeleri ve biyomoleküllerini hedef hücrelere aktarabilmeleri, onları CNS22'yeterapötik ilaçlar sunmak için uygun araçlar haline getirir.
SEV alımını omurilikteki sayısız CNS hücresi tarafından görselleştirmek, hem mekanistik çalışmalara hem de çeşitli hücresel kaynaklardan eksojen olarak uygulanan SEV'lerin terapötik faydalarının değerlendirilmesini sağlayacaktır. Bu makalede, makrofajlardan elde edilen sEV'leri etiketlemek ve lomber omurilikteki in vitro ve in vivo alımlarını nöronlar, mikroglia ve astrositler tarafından görselleştirme ile sEV doğumunu niteliksel olarak doğrulamak için etiketlemek için metodoloji açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL santrifüj filtreler</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alix Antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Calnexin Antikoru</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD81 Antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Monoklonal Antikor (14C10)</td> <td>Hücre Sinyali Teknoloji</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-glial Fibriler asidik protein antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>IF için 1:500; IHC</td></tr><tr><td>Anti-Iba1 Antikoru</td> için 1:1000 <td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anti-MAP2A Antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci, 40 &mu; m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12.000 x g</td></tr><tr><td>Lamel, 12 mm, #1.5 Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Lamel, 18 mm, #1.5</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>DC Protein Testi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I (DNAse I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Eşek Anti-Tavşan IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Çift Buzlu Mikroskop Slaytları, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve Magnezyum</td><td>Corning Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Eksozom Tükenmiş Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>FluorChem M görüntüleme sistemi</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 Konfokal Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG H & L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG H & L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Kesişme engelleme tamponu, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS Numune Tamponu</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Kapak Camı, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 sistemi</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 yazılımı</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nöro-2a Hücre Hattı</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşiği</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biyokimya Şirketi</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Transfer Membranı</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 Hücre Hattı</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Tampon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Altın Slaytlar</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td><td>yapışkan slaytlar</td></tr><tr><td>T-75 Şişeler</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 Dijital Transmisyon Elektron Mikroskobu</td><td>FEI Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Izgaraları Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glisin Protein Jeli,% 12</td> <td>İnvitrojen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glisin SDS Çalışan Tampon</td><td>İnvitrojen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glisin Transfer Tamponu</td><td>İnvitrojen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>hücre ayrışma enzimi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, %0,25</td> <td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Tüpleri</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110.000 x g</td></tr></tbody></table>

vitro ve omurilikte floresan etiketli küçük hücre dışı veziklin alımı

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Küçük hücre dışı veziklinler (sEV' ler) tüm hücreler tarafından salgılanan ve vücut sıvılarında bulunan 50-150 nm veziklinlerdir. SEV'ler RNA, proteinler ve lipitler gibi biyomolekülleri donörden alıcı hücrelere aktararak hücreler arasında anahtar sinyal verici arabulucular haline getirir. Merkezi sinir sisteminde (CNS), sEV'ler nöroimmün etkileşimler de dahil olmak üzere hücreler arası sinyalizasyona aracılık edebilir. sEV fonksiyonları, alıcı hücrelerde hem in vitro hem de in vivoolarak etiketli sEV'lerin alımını izleyerek incelenebilir. Bu makalede, RAW 264.7 makrofaj hücrelerinin koşullandırılmış ortamlarından SEV'lerin PKH membran boyası kullanılarak etiketlenerek etiketlenimi açıklanmaktadır. Nöro-2a hücreleri ve birincil astrosit in vitro tarafından birden fazla zaman noktasında etiketli sEV'lerinfarklı konsantrasyonlarının alımını gösterir. Ayrıca fare omurilik nöronlarında, astrositlerde ve konfokal mikroskopi ile görselleştirilen mikroglialarda intratekal olarak teslim edilen sEV'lerin alımı gösterilmiştir. Temsili sonuçlar, sEV'lerin farklı hücreler tarafından alınmasında zamana bağlı varyasyonu göstermektedir, bu da omuriliğe başarılı sEV'lerin teslimini doğrulamaya yardımcı olabilir.

SEV'lerin RAW 264.7 şartlandırılmış ortamdan santrifüjleme yoluyla izole edilmesi sonrasında, saflaştırılmış SEV'lerin konsantrasyonunu ve boyut dağılımını belirlemek için NTA kullanılmıştır. RAW 264.7 türevi sEV'lerin ortalama ortalama büyüklüğü 140 nm ve tepe parçacık boyutu 121.8 nm idi ve ışık saçılma ölçümündeki çoğu tespit edilebilir parçacığın 50-150 nm'de ekzozom veya sEV boyut aralığına düştüğünü doğruladı (Şekil 1A). Hücre dışı veziklin çalışmaları için minimum bilgide önerildiğini...

Makrofajdan türetilmiş küçük hücre dışı vesikleleri PKH boyalarla etiketlemek ve intratekal doğumdan sonra in vitro ve omurilikte alımlarını gözlemlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Vitro ve Omurilikte Floresan Etiketli Küçük Hücre Dışı Veziklin Alımı

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

SEV olarak da bilinen küçük hücre dışı veziklinlerin omurilikteki farklı hücreler tarafından alınmasını görselleştirmek, SEV'lerin başarılı bir şekilde teslimini doğrulayabilir. Bu, roden modellerinde çeşitli kaynaklardan intratekal olarak uygulanan SEV'lerin hem mekanistik hem de terapötik çalışmalarını sağlar. Bu protokol, SEV'lerin hafif bir omurilikteki hücreler tarafından alınmasını görselleştirmek için kullanılabilir ve sEV'lerin ve kargo moleküllerinin omurga bozuklukları, ağrı ve iltihaplanmadaki rolünü değerlendirmeye yardımcı olabilir.Bu prosedür, Dr Seena Ajit'in laboratuvarındaki iki yüksek lisans öğrencisi Xuan Luo ve Nd Zhucheng Lin ile birlikte benim tarafım tarafından gösterilecektir. 12 kuyu plakasına 18 milimetre kapak kayması yerleştirerek başlayın, ardından her kuyuya %10 FBS ve %1 kalem strep içeren toplam 1 mililitre tam DMEM ile nöro-2a hücrelerini plakalayın. Hücre sayısı akıcılığı %80 ila %90'a ulaştığında, her kuyuda ortayı DMEM eksozom tükenmiş ortam olarak değiştirin, bir, 5 veya 10 mikrogram etiketli sEV ekleyin.1, 4 ve 24 saat boyunca. Doz ve zamana bağlı olarak kuyuların geri kalanına eşit miktarda boya kontrolü ile almak için. Postnatal yavruların beyinlerini 60 milimetrelik bir alanda toplayın, 10 milimolar hepes ile desteklenmiş buz gibi Hanks dengeli tuz çözeltisi içeren Petri kabı, hem kortikal lobları parçalara çıkarın hem de menenjileri çıkarın.Daha sonra dokuları sterilize edilmiş bir bıçakla kıyın. Dokuları Pepane veya deoksiribonükleus içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın, tüpü her 5 dakikada bir döndürün, süpernatantı aspire edin ve tüpe 5 mililitre komple DMEM ekleyin. Enzim aktivitesini inaktive etmek için, dokuları 5 mililitre cam serolojik pipet ve alev cilalı mera pipeti ile ayrıştırmak için dikkatlice derecelendirmeye çalışın.Hücre süspansiyonunu 40 mikrometre hücre süzgecinden geçirin ve ardından hücreleri 250 kez G'de 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin, ortamı epire edin ve hücreleri 75 santimetrekarelik bir şişede 10 mililitrelik tam DMEM'de görün. 4 saatlik kaplamadan sonra, süpernat ve ortamı 15 mililitre taze DMEM ortamı ile değiştirin. Mikroglia ve oligodendrositleri ayırmak için 14 gün tüp bebek yaptıktan sonra, şişeyi 6 saat boyunca 320 RPM'de bir yörünge çalkalayıcıya aktarın.37 santigrat derecede 10 dakika boyunca hücre ayrıştırma enziminin 5 mililitresini kullanın. Tripsinize için, kalan astrositler, enzimatik eylemi devre dışı bırakmak için, 5 mililitre tam DMEM ekleyin ve ardından hücreleri 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 250 kez G'de peletleyin. Hücreleri tam DMEM'de yeniden biriktirin ve 12 milimetrelik 1,5 kapak kaydırdaki hücreleri 24 kuyu plakasında görün.PBS kullanarak hücreleri 3 kez durulayın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de% 4 güç formaldehit veya PFA ile sabitleyin. Sabit hücreleri PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın ve PBS'de %0,1 Triton X 100 kullanarak 10 ila 15 dakika geçirgen hale getirin. Ardından yıkamaları PBS ile tekrarlayın.Hücreleri bloke etmek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 5 normal keçi serumu veya NGS kullanın, nöro-2a hücrelerini harita çift yönlü antikorlarla kuluçkaya yatırın ve GFAP antikorları ile birincil astrositleri hafif bir sarsıntı ile bir gecede taze% 5 NGS veya PBS'de 1 ila 500 oranında kullanın. PBS'de hücreleri 3 kez yıkadıktan sonra, florofor konjuge sekonder antikorları% 5 NGS'ye ekleyin. Bir rocker üzerindeki ışıktan korunan oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yat.Yıkamayı PBS ile tekrarlayın ve hücreyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca mililitre DAPI başına 1 mikrogram ile kuluçkaya yatırın. Bir kez daha, hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın. Solmaya karşı montaj ortamı kullanarak, kapak kaymalarını 1 numaralı slaytlara monte edin, karanlıkta gece boyunca kurumasını bekleyin ve hazırlanan cam slaytları konfokal bir mikroskopta görüntülemeye kadar 4 santigrat derecede saklayın.Omuriliği parçalara ayrıştırın ve PBS'de 24 saat boyunca 4 santigrat derecede%4 PFA'da sabitle. Daha önce PBS'de% 30 sakkarozdaki dokuları 24 saat boyunca 4 santigrat derecede koruyun veya dokular batana kadar ve daha sonra dokuları immünhistokimyaya kadar 4 santigrat derecede saklayın, L4 L5 omuriliğini OCT bileşiğine koyun, sonra tamamen katılanınceye kadar kuru buzda dondurun. Dokuları 30 mikrometrede bölümlere almak ve bölümleri PBS içeren 24 kuyu plakasında toplamak için bir kriyostat kullanın.Bölümleri PBS'de %0,3 Triton ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, oda sıcaklığında 2 saat boyunca %0,3 Triton PBS'de %5 MGS kullanarak spesifik olmayan bağlama bölgelerini engelleyin. Bölümleri bir gecede 4 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın. Pbs'de %0,3 Triton ile bölümleri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.Daha sonra ikincil antikorların uygun konsantrasyonunun eklenmesi. Metin makalesine göre, oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın, bölümleri sadece PBS kullanarak yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca mililitre DAPI başına 1 mikrogramda kuluçkaya yatırın. Ardından PBS yıkamalarını hafif bir mikroskop altında tekrarlayın, bölümleri ince bir boya fırçasıyla net bir yapışkan kaydırağa monte edin.Kapak kaymasını montaj ortamıyla ıslatın ve oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca kürlayın, ilgili lazerlerle konfokal mikroskop altında görüntüler elde edin, RA 2 6 4 0.7 türetilmiş sEV'lerin ortalama ortalama boyutu 140 nanometre ve tepe partikül boyutu 121.8 nanometre idi. En tespit edilebilir parçacıklar ekzozomların veya sEVS'in boyut aralığına düşer. 50 ila 150 nanometrede, sEV'lerin batı lekesi, Hücre Lysate ve exodepleted Media, sEV türevi protein örneklerinin sEV belirteç proteinleri Alix CD81 ve GAPDH içerdiğini göstermiştir.Hücre lisat endoplazmik reticulum ile zenginleştirilmiştir, yerleşik protein Calnexin böylece Calnexin sEV'lerde bulunmadığı için hücresel kontaminasyon için negatif bir belirteç görevi gördü. SEV'lerin alımının 1 saatte gerçekleştiği ve 1, 5 ve 10 mikrogram sEV'ler için 4 saat, 4, 5 ve 10 mikrogram sEV için kuluçka sonrası floresan tespit edilebildiği gözlendi. Birincil astrositler tarafından PKH 26 etiketli sEV'lerin alımı incelendi ve primer kortikal astrositlerde sEVS alımından maksimum floresan 24 saatte PKH26 etiketli sEV'ler alındı ve 6 saatte maksimum floresan, nöron astrositlerde ve mikroglial hücrelerde enjeksiyon sonrası gözlendi.Kontrollerin, etiketlenmemiş sEV'lerin ve boya kontrolünün dahil edilmesi, artık ilişkisiz boya yama kıyılarının opry dansını etiketlemesi nedeniyle bir rüzgar yanlış pozitif son sinyallere kod oluşturur. SEV'lerin alımı, tarif ve hücrelere ve dokulara biyomoleküler kargo transferi araştırılarak ve biyomoleküllerin veya hedef genlerin ifade düzeylerindeki değişikliklerin belirlenmesiyle doğrulanabilir. SEV doğumunun fonksiyonel etkisini araştırmak için davranış çalışmaları da yapılabilir.

uptake-fluorescent-labeled-small-extracellular-vesicles-vitro-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz nöron veya polietilen emme pipet kullanarak herhangi bir nöronal yoluna floresan ve kalsiyum duyarlı boyalar yüksek konsantrasyon tanıtmak için basit ve düşük maliyetli tekniği tanımlandı.

Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor

Bu videoda, hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin hücresel alımını görselleştirmek ve ölçmek için bir test gösteriyoruz. Bu test, konfokal bir mikroskop kullanarak 3D floresan görüntülemeyi kullanır ve içselleştirilmiş EV'leri hücre yüzeyine yapışanlardan ayırt etmeye izin verir.

Hücre Dışı Vezikül Alım Testi: 3D Floresan Görüntüleme Tekniği Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Hücresel Alımını Görselleştirmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu video, nöronal veziküllerin hareketlerini görselleştirmek için belirli floresan proteinlerle nasıl etiketlendiğini gösterir. İlk olarak, bir floresan proteini kodlayan bir plazmit, bir transfeksiyon ajanı ile inkübe edilir ve daha sonra bir nöron kültürüne sokulur. Daha sonra, veziküllerin hareketini izlemek için nöronların görüntüleri elde edilir ve analiz edilir.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

Bu çalışmada, enfekte Plasmodium falciparum eritrositler tarafından yayımlanan ekstraselüler veziküller (EVs) rolünü araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Özellikle, endotel hücreleri ile EVs etkileşimleri odaklanmak.

Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Burada, osteoartrit için model olarak kullanılan kıkırdak eksplantlarında göçlerini ve alımlarını izlemek için trombositten türetilmiş hücre dışı veziklikleri etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) hücresel biyolojiye ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur. Hücrelerin ALDıĞı EV'leri görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz tarafından EV izolasyonunu takiben konfokal mikroskopi yoluyla üç boyutlu floresan görüntüleme kullanarak EV alma testini önermektedir.

Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi

Bu video E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem gösteriyor. Disosiye commissural nöronların akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için yararlıdır.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Öğrenin, PKH boyalarıyla etiketlenmiş makrofaj kaynaklı küçük ekstraselüler veziküllerin (sEV) in vitro ve omurilikte alımını görselleştirme yöntemini. Bu protokol, spinal ağrı ve inflamasyon gibi hastalıklarda sEV'lerin terapötik potansiyelini anlamaya yardımcı olur.

Vitro ve Omurilikte Floresan Etiketli Küçük Hücre Dışı Veziklin Alımı

Daha fazla video keşfet